Основы микробиологии

Иммунолюминесцентный метод: сущность, направления, способы постановки и учета, диагностическое значение.

Иммунофлюоресцентный анализ. Один из наиболее чувствительных методов выявления связывания антител с антигенами в клетках и тканях -- иммунофлюоресцентный анализ. Специальный флюоресцентный краситель (флюорохром) прикрепляется химической связью к молекуле специфического антитела, не нарушая его специфичности. Часто используют краситель изотиоцианат флюоресцеина, обладающий желто-зеленой флюоресценцией. Красители, выбранные для иммунофлю- оресцентного метода, активируются светом одной длины волны (чаще -- ультрафиолетовой части спектра), а сами испускают лучи другой длины волны (видимого спектра). В люминесцентном микроскопе используется в качестве источника света, возбуждающего люминесценцию, ртутная лампа с системой селективных фильтров, пропускающих в окуляр только свет флюоресцирующего красителя. Прикрепляя разные красители к разным антителам, можно одновременно выявлять несколько антигенов в одной клетке.

Иммунофлюоресцентный метод является методом выбора для быстрого выявления и идентификации неизвестного микроорганизма в исследуемом материале, в связи с чем его называют методом экспресс-диагностики.

Недостатком прямого иммунофлюоресцентного метода является необходимость приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических антител против каждого из изучаемых антигенов. Поэтому чаще используют непрямой иммунофлюоресцентный метод, при котором связанные с антигеном специфические антитела (немеченые) выявляются с помощью флюоресцирующих антииммуноглобулиновых антител против иммуноглобулинов того вида, которому принадлежат антиген-специфические антитела.

Применяют и иммуногистохимический метод, при котором к специфическим антителам прикрепляется фермент (например, пероксидаза хрена), способный превратить бесцветный субстрат в окрашенные продукты его ферментативного разложения, видимые в обычный световой микроскоп.

Для использования при электронной микроскопии антиген- специфические антитела можно метить частицами золота, локализация которых укажет на расположение соответствующего антигена.

При прямом иммунофлюоресцентном методе Кунса специфические флюоресцирующие антитела образуют комплексы с микробными антигенами, которые светятся при люминесцентной микроскопии препаратов (рис. 10. 1. 2).

Непрямой метод предусматривает использование одной универсальной флюоресцирующей сыворотки -- антиглобулиновой, содержащей антитела против кроличьих глобулинов, поскольку диагностические антисыворотки получают путем иммунизации кроликов. При этом на образующемся комплексе (специфические антитела + исследуемый антиген) фиксируются флюоресцирующие антиглобулиновые антитела, обеспечивая его свечение при люминесцентной микроскопии.

На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген--антитело

препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связывающихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против иммуноглобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген--антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.

83. Иммуноферментный и радиоиммунный анализ: сущность, условия, направления, способы постановки и учета, диагностическое значение.

Иммуноферментный анализ. Один из наиболее распространенных в практике методов -- иммуноферментный анализ (ИФА) -- основан на использовании двух разных по специфичности моноклональных антител против двух разных антигенных эпитопов в составе искомого антигена. В лунки с иммобилизованными антителами против одного эпитопа добавляют материал, в котором ищут антиген. В процессе инкубации на твердой фазе образуется комплекс антиген--антитело. Затем лунки отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом антитела против другого эпитопа того же антигена. После повторной инкубации и отмывания от избытка конъюгата антител с ферментом определяют количество связавшихся антител по их ферментативной активности в присутствии субстрата с индикатором. При этом величина активности фермента пропорциональна концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления иммунного комплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизированных и меченых антител, что послужило поводом для широко распространенного в литературе названия "сэндвич"-метод.

Повышение специфичности и чувствительности иммуно- ферментного анализа, так же как и иммунофлюоресцентного и радиоиммунного методов, связано с использованием моно- клональных антител (МКАТ).

Для получения МКАТ мышей иммунизируют очищенным препаратом антигена, затем выделяют лимфоциты из селезенки и лимфатических узлов и проводят слияние их с миеломными клетками-партнерами. Неслившиеся миеломные клетки погибают, так как они дефектны по синтезу некоторых нуклеотидов и не могут выжить на селективной среде без этих нуклеотидов. Неслившиеся лимфоциты погибают в культуре из-за отсутствия в среде необходимых им трофических факторов. Выживают только гибридные клетки (гибридомы), унаследовавшие от миеломных клеток способность к пролиферации в культуре, а от лимфоцитов -- способность к синтезу антител соответствующей специфичности. Надосадочную жидкость культур гибридом исследуют с помощью ИФА с соответствующим антигеном. После выявления клеток, секретирующих нужные антитела, их клонируют методом лимитирующих разведений, т. е. клетки разводят таким образом, чтобы получить дочернюю культуру из одной клетки. Тогда все потомство будет генетически идентично: одна клетка дает один клон, который продуцирует МКАТ.

Радиоиммунный анализ. Радиоиммунный анализ (РИА) является чрезвычайно чувствительным методом, который может быть использован для количественного определения любого антигена. Чувствительность метода позволяет выявлять незначительные количества антигена.

Для проведения жидкостного радиоиммунного анализа очищенный известный антиген метят радионуклидами, чаще всего 1251. В этом случае используют конкурентный вариант связывания, когда для определения количества антигена в исследуемом образце оценивают его способность конкурировать с меченым референс-антигеном в связывании со специфическими антителами. Образующиеся комплексы антиген--антитело выделяют осаждением (сульфатом аммония или антиантителами) и определяют их радиоактивность в сопоставлении с радиоактивностью несвязанного антигена в надосадочной жидкости. Использование ряда концентраций немеченого антигена позволяет построить стандартную калибровочную кривую, с помощью которой определяется концентрация исследуемого антигена.

Более современный метод -- твердофазный РИА, при котором специфические антитела фиксируются на твердой фазе, к ним добавляется исследуемый антиген, а затем меченый стандартный антиген. Определение связанной и несвязанной метки позволяет построить калибровочную кривую и определить количество исследуемого антигена.

РИА широко применяют для количественного определения различных веществ: гормонов (инсулина, гормона роста, адренокортикотропного гормона, трийодтиронина, тироксина, эстрогена), белков сыворотки крови (IgE, а-фетопротеина и др. ), метаболитов (фолиевой кислоты, циклических нуклеотидов и др. ), лекарственных препаратов (дигоксина, дигитоксина, морфина), микробных антигенов (HBsAg).

Внутрикожные токсические пробы в диагностике инфекционных болезней. Проба Шика.

Шика реакция- внутрикожная проба с дифтерийным токсином, применяемая для установления противодифтерийного иммунитета. Для постановки Ш. р. внутрь кожи ладонной поверхности предплечья туберкулиновым шприцем вводят 0, 2 мл стандартного дифтерийного токсина, содержащего 1/64 ДЛМ для морской свинки. Результат учитывают через 72 - 96 ч. У людей, не имеющих Ат против токсина или имеющих их мало, на месте введения образуются краснота и инфильтрат (положительная реакция); у людей, в с-ке к-рых содержатся антитоксические Ат в концентрации 1 /30 АЕ и больше, инфильтрат не развивается или он меньше 1 см (отрицательная реакция). Результаты Ш. р. используют для оценки коллективного иммунитета и проведения профилактических прививок. В настоящее время с этой целью применяют РПГА с эритроцитарным диагностикумом.

Внутрикожные пробы в основном используются с диагностической целью, но по их интенсивности судят о типе иммунологической реактивности. Наряду с этим время максимального развития воспалительного процесса в месте введения аллергена в кожу служит дифференциальным признаком повышенной чувствительности немедленного (24 ч) и замедленного типа (72 ч).

Наибольший опыт применения внутрикожной пробы накоплен при изучении туберкулезной и бруцеллезной инфекций. При острой форме бруцеллеза 50 % больных не реагировали на введение бруцеллина. При хроническом его течении без отчетливых местных поражений у 2/3 больных внутрикожные пробы были отрицательны. Локальные поражения при хроническом течении заболевания сопровождались увеличением положительных проб до 90 %. Эти данные указывают на зависимость внутрикожной пробы от активности процесса и типов гиперергических реакций. При бруцеллезе наблюдаются немедленный и замедленный типы повышенной чувствительности к антигенам бруцелл. При туляремии положительные пробы составляют 60--80 %. Причем в период реконвалесценции внутрикожные пробы с тулярином показывают возможность развития гиперчувствительности немедленного типа, но не исключается замедленный тип повышенной чувствительности в разгар заболевания. Опыт применения внутрикожных проб показал их высокую диагностическую значимость при сибирской язве.

Аллергены энтеробактерий, за исключением эбертина, широко не применяются в связи с большим удельным весом (до 50 %) перекрестных реакций.

Внутрикожные аллергические пробы в диагностике инфекционных болезней. Проба Манту.

Туберкулиновая проба (реакция Манту, проба Пирке) представляет собой кожную пробу, направленную на выявление наличия специфического иммунного ответа на введение туберкулина. Наличие выраженной кожной реакции свидетельствует о наличии напряжённого иммунитета, то есть, что организм активно взаимодействует с возбудителем. Реакция Манту -- это своего рода иммунологический тест, который показывает, есть ли в организме туберкулёзная инфекция.

Туберкулин -- общее название экстрактов микобактерийM. tuberculosis, M. bovis или M. avium, используемых для проведения внутрикожных диагностических проб на туберкулёз у человека и животных. Применялось несколько различных типов туберкулина, из которых наиболее важен PPD (англ. purified protein derivative). PPD представляет собой слабо очерченную, сложную смесь антигенов. Основанные на PPD пробы относительно неспецифичны, поскольку многие его протеины можно обнаружить у различных видов микобактерий.

Внутрикожная туберкулиновая проба применяется для диагностики туберкулёзной инфекции на основании появляющейся местной индурации (уплотнения кожи), а также для определения местоположения аллергии (перед прививкой БЦЖ) и для контроля конверсии (Инверсии) после прививки.

Проверка результата пробы производится не ранее чем через 48 часов, лучше всего на третий день, самое позднее -- через одну неделю после аппликации. Индурация отмечается, измеряется, документируется и оценивается.

Индурация< 5 мм в основном не имеет значения;

10 мм указывает на возможное заражение туберкулезом в группах риска и при контакте с пациентами с открытыми формами туберкулеза

при индурации15 мм или язвенной реакции кожи (образование гнойников) очень вероятно заражение туберкулезом.

Туберкулиновая проба Манту не даёт сведений о распространении, инфекциозности или локализации заболевания, однако показывает реакцию организма -- антиген-антитело на возбудителя туберкулёза. Позитивная реакция кожи показывает, что исследуемый пациент имел контакт с возбудителями туберкулёза. Это, однако, не означает, что данный пациент болен туберкулезом.

Большие размеры реакции на введение туберкулина всегда оказывают большее впечатление как на пациента, так и на медицинского работника. Весьма распространено ошибочное представление о том, что значительные по размерам («пышные») реакции с большей вероятностью указывают на активный туберкулезный процесс. Это представление ошибочно. Считается установленным, что вариации размеров реакции менее или более 5 мм с определенной достоверностью могут указывать на развитие заболевания или на его отсутствие. Однако даже при реакциях размерами свыше 5 мм нельзя установить четких различий между активным туберкулезным процессом, неактивными туберкулезными изменениями (по изменениям на рентгенограммах), недавно развившейся инфекцией (тесный контакт с бактериовыделителем) или инфицированием в отдаленном прошлом. Таким образом, размеры реакции, превышающие определенный порог, не помогают в интерпретации туберкулинового теста

Иммунотерапия и иммунопрофилактика инфекционных заболеваний. Сущность и определение понятий "вакцина", "серотерапия" и "серопрофилактика".

1. Иммунотерапия -- это использование иммунологических закономерностей для лечения больных.

При лечении острых тяжелых генерализованных форм инфекционных заболеваний, особенно тех, возбудители которых продуцируют экзотоксин, возникает, как правило, необходимость экстренного создания пассивного искусственного приобретенного иммунитета. Для этих целей используются следующие антительные препараты:

* антитоксические и антибактериальные (антимикробные) иммунные сыворотки;

* иммуноглобулины (гамма-глобулины);

* плазма.

Иммунные сыворотки, используемые в практике специфической профилактики и терапии инфекционных болезней, получают от иммунизированных животных, переболевших людей или специально иммунизированных доноров.

2. Антитоксические сыворотки содержат антитела против экзотоксинов. Их получают путем гипериммунизации животных (лошадей) анатоксином.

Активность таких сывороток измеряется в АЕ (антитоксических единицах) или ME (международных единицах) -- это минимальное количество сыворотки, способное нейтрализовать определенное количество (обычно 100 DLM) токсина для животных определенного вида и определенной массы.

В настоящее время в России широко используются следующие антитоксические сыворотки:

* противодифтерийная;

* противостолбнячная;

* противогангренозная;

* противоботулиническая.

Применение антитоксических сывороток при лечении соответствующих инфекций обязательно.

3. Антимикробные сыворотки содержат антитела против клеточных антигенов возбудителя. Их получают иммунизацией животных клетками соответствующих возбудителей и дозируют в миллилитрах. Антимикробные сыворотки могут применяться при лечении:

* сибирской язвы;

* чумы;

* стрептококковых инфекций;

* стафилококковой инфекции;

* синегнойной инфекции.

Их назначение определяется тяжестью течения заболевания и, в отличие от антитоксических, не является обязательным. При лечении больных с хроническими, длительно, вяло текущими формами инфекционных заболеваний возникает необходимость стимулировать собственные механизмы специфической зашиты путем введения различных антигенных препаратов и создания активного приобретенного искусственного иммунитета (иммунотерапия антигенными препаратами). Для этих целей используются в основном лечебные вакцины и значительно реже -- аутовакцины или стафилококковый анатоксин.

Убитые лечебные вакцины -- дизентерийная, гонококковая (гоновакцина), бруцеллезная, стафилококковая -- используются довольно давно.

4. Особую, отдельную группу лечебных вакцин представляют аутовакцины, приготовленные из убитых прогреванием при 70--80 °С в течение 1 ч штаммов возбудителей, выделенных в результате бактериологического исследования от данного больного. Аутовакцины имеют определенные преимущества: они создают антигены конкретного возбудителя, учитывая его штаммовые особенности.

5. При проведении иммунотерапии необходимо учитывать несколько важных моментов:

* противовирусные антительные препараты не используются, так как антитела не действуют на внутриклеточные формы вирусов;

* лечение путем введения антитоксических сывороток должно быть начато как можно раньше, не дожидаясь результатов микробиологического диагноза, так как серотерапия ими эффективна только до адсорбции (фиксации) токсина клетками организма;

* антитоксические иммунные сыворотки часто содержат лошадиный белок, и введение таких сывороток пациентам допустимо лишь в случае отсутствия в течение 20-30 мин выраженной реакции на лошадиную сыворотку (в разведении 1 : 100, в объеме 1 мл);

* в некоторых случаях возможно одновременное введение и антигенных, и антительных препаратов (столбнячный анатоксин с противостолбнячным иммуноглобулином при первичной хирургической обработке раны);

* клинически доказано, что использование препаратов иммуноглобулинов, полученных от иммунизированных людей, при иммунотерапии гнойно-воспалительных заболеваний стафилококковой этиологии и столбняка более эффективно, чем использование соответствующих иммунных антитоксических сывороток (лошадиных).

Вакцина (от лат. vacca -- корова) -- медицинский препарат, предназначенный для создания иммунитета к инфекционным болезням. Вакцина изготавливается из ослабленных или убитых микроорганизмов, продуктов их жизнедеятельности, или из их антигенов, полученных генно-инженерным или химическим путём.

Серотерапия (от лат. serum -- сыворотка и терапия), метод лечения заболеваний человека и животных (преимущественно инфекционных) при помощи иммунных сывороток. Лечебный эффект основан на явлении пассивного иммунитета -- обезвреживании микробов (токсинов) антителами (антитоксинами), содержащимися в сыворотках, которые получают путём гипериммунизации животных (главным образом лошадей). Для Серотерапии применяют также очищенные и концентрированные сыворотки -- гамма-глобулины; гетерогенные (полученные из сывороток иммунизированных животных) и гомологичные (полученные из сывороток иммунизированных или переболевших людей). Сыворотки иммунные применяют при лечении дифтерии (преимущественно в начальной стадии болезни), ботулизма, при укусах ядовитых змей; гамма-глобулины -- при лечении гриппа, сибирской язвы, столбняка, оспы, клещевого энцефалита, лептоспироза, стафилококковых инфекций (особенно вызванных антибиотикоустойчивыми формами микробов) и других заболеваний. Для предупреждения осложнений Серотерапии (анафилактический шок, сывороточная болезнь) сыворотки и гетерогенные гамма-глобулины вводят по специальной методике с предварительной кожной пробой. В ветеринарной практике иммунные сыворотки, в том числе гамма-глобулины, применяют при лечении сибирской язвы, геморрагической септицемии крупного рогатого скота, овец и свиней, анаэробной дизентерии ягнят, рожи свиней и т. п.

Серопрофилактика (от лат. serum -- сыворотка и профилактика), метод предупреждения инфекционных болезней человека и животных при помощи иммунных сывороток; создаётся сравнительно непродолжительный (1--4 нед) пассивный иммунитет. В современной медицинской практике для Серопрофилактика всё шире применяют гамма-глобулины. Серопрофилактику проводят в эпидемических очагах лицам, имевшим контакт с больными (например, корью, коклюшем), при травмах (для предупреждения столбняка), при укусах животных (для профилактики бешенства) и клещей (для предупреждения клещевого энцефалита). Плановая Серопрофилактика осуществляется для профилактики инфекционного гепатита. При некоторых инфекциях используют глобулиновые фракции сывороток (болезнь Ауески) или сыворотку молока иммунизированных животных (противоящурный иммунолактон).

Живые и убитые вакцины. Способы получения и особенности применения. Аттенуация. Рекомбинантные вакцины.

1. По назначению вакцины делятся на профилактические и лечебные.

По характеру микроорганизмов, из которых они созданы, вакиины бывают:

* бактериальные;

* вирусные;

* риккетсиозные.

Существуют моно- и поливакцины -- приготовленные соответственно из одного или нескольких возбудителей.

По способу приготовления различают вакцины:

* живые;

* убитые;

* комбинированные.

Для повышения иммуногенности к вакцинам иногда добавляют различного рода адъюванты (алюмо-калиевые квасцы, гидроксид или фосфат алюминия, масляную эмульсию), создающие депо антигенов или стимулирующие фагоцитоз и таким образом повышающие чужеродность антигена для реципиента.

2. Живые вакцины содержат живые аттенуированные штаммы возбудителей с резко сниженной вирулентностью или штаммы непатогенных для человека микроорганизмов, близкородственных возбудителю в антигенном отношении (дивергентные штаммы). К ним относят и рекомбинантные (генно-инженерные) вакцины, содержащие векторные штаммы непатогенных бактерий/вирусов (в них методами генной инженерии введены гены, ответственные за синтез протективных антигенов тех или иных возбудителей).

Примерами генно-инженерных вакцин могут служить вакцина против гепатита В - Энджерикс В и вакцина против коревой краснухи - Ре-комбивакс НВ.

Поскольку живые вакцины содержат штаммы микроорганизмов-возбудителей с резко сниженной вирулентностью, то, по существу, они воспроизводят в организме человека легко протекающую инфекцию, но не инфекционную болезнь, в ходе которой формируются и активируются те же механизмы защиты, что и при развитии постинфекционного иммунитета. В связи с этим живые вакцины, как правило, создают достаточно напряженный и длительный иммунитет.

С другой стороны, по этой же причине применение живых вакцин на фоне иммунодефицитных состояний (особенно у детей) может вызвать тяжелые инфекционные осложнения.

Например, заболевание, определяемое клиницистами как БЦЖит после введения вакцины БЦЖ.

Живые вакиины применяют для профилактики:

* туберкулеза;

* особо опасных инфекций (чумы, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза);

* гриппа, кори, бешенства (антирабическая);

* паротита, оспы, полиомиелита (вакцина Сейбина-Смородинцева-Чумакова);

* желтой лихорадки, коревой краснухи;

* Ку-лихорадки.

Между введениями живых вакцин рекомендован интервал не менее 1 мес, в противном случае возможны тяжелые побочные реакции, иммунный ответ может быть пониженным.

3. Убитые вакцины содержат убитые культуры возбудителей (цельноклеточные, цельновирионные). Их готовят из микроорганизмов, инактивированных прогреванием (гретые), ультрафиолетовыми лучами, , химическими веществами (формалином -- формоловые, фенолом -- карболовые, спиртом -- спиртовые и др. ) в условиях, исключающих денатурацию антигенов. Иммунногенность убитых вакцин ниже, чем у живых. Поэтому вызываемый ими иммунитет кратковременный и сравнительно менее напряженный. Убитые вакиины применяют для профилактики:

* коклюша, лептоспироза,

* брюшного тифа, паратифа А и В,

* холеры, клещевого энцефалита,

* полиомиелита {вакцина Солка), гепатита А.

К убитым вакцинам относят и химические вакцины, содержащие определенные химические компоненты возбудителей, обладающие иммуногенностью (субклеточные, субвирионные). Поскольку они содержат только отдельные компоненты бактериальных клеток или вирионов, непосредственно обладающих иммуногенностью, то химические вакцины менее реактогенны и могут использоваться даже у детей дошкольного возраста. Известны еще и антиидиотипические вакцины, которые также относят к убитым вакцинам. Это антитела к тому или иному идиотипу антител человека (анти-антитела). Их активный центр аналогичен детерминантной группе антигена, вызвавшего образование соответствующего идиотипа.

4. К комбинированным вакцинам относят искусственные вакцины.

Они представляют собой препараты, состоящие из микробного антигенного компонента (обычно выделенного и очищенного или искусственно синтезированного антигена возбудителя) и синтетических полиионов (полиакриловая кислота и др. ) -- мощных стимуляторов иммунного ответа. Содержанием этих веществ они и отличаются от химических убитых вакцин. Первая такая отечественная вакцина -- гриппозная полимер-субъединичная ("Гриппол"), разработанная в Институте иммунологии, уже внедрена в практику российского здравоохранения. Для специфической профилактики инфекционных заболеваний, возбудители которых продуцируют экзотоксин, применяют анатоксины.

Анатоксин -- это экзотоксин, лишенный токсических свойств, но сохранивший антигенные свойства. В отличие от вакцин, при использовании которых у человека формируется антимикробный иммунитет, при введении анатоксинов формируется антитоксический иммунитет, так как они индуцируют синтез антитоксических антител -- антитоксинов.

В настоящее время применяются:

* дифтерийный;

* столбнячный;

* ботулинический;

* стафилококковый анатоксины;

* холероген-анатоксин.

Вакцины, содержащие антигены бактерий и анатоксины, называются ассоциированными.

Примерами ассоциированных вакцин являются:

- вакцина АКДС (адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина), в которой коклюшный компонент представлен убитой коклюшной вакциной, а дифтерийный и столбнячный -- соответствующими анатоксинами;

- вакцина ТАВТе, содержащая О-антигены брюшнотифозных, паратифозных А- и В-бактерий и столбнячный анатоксин; брюшнотифозная химическая вакцина с секстаанатоксином (смесь анатоксинов клостридий ботулизма типов А, В, Е, клостридий столбняка, клостридий перфрингенс типа А и эдематиенс -- 2 последних микроорганизма -- наиболее частые возбудители газовой гангрены) и др.

В то же время АДС (дифтерийно-столбнячный анатоксин), часто используемый вместо АКДС при вакцинации детей, является просто комбинированным препаратом, а не ассоциированной вакциной, так как содержит только анатоксины.

Химические вакцины и анатоксины, способы получения и применения.

Химические вакцины -- вакцины, состоящие из протективных антигенов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Имеются следующие их разновидности:

холерная (состоит из анатоксина-холерогена и липополисахарида, извлечённого из клеточной стенки холерного вибриона),

рибосомальная бактериальная -- рибомунил (включает рибосомальные фракции различных видов микроорганизмов; активизирует макрофаги, нейтрофилы и процесс синтеза ими интерлейкинов 1, 6, 8, а-интерферона, а также функции натуральных киллерных клеток, стимулирует гуморальный иммунный ответ и местный иммунитет дыхательного тракта; используется для профилактики острых респираторных инфекций),

лизатная (получают с помощью оригинальных методов лизиса бактерий; например, бронхомунал -- лиофилизированный лизат стрептококков, клебсиелл, гемофилов и др. представителей микрофлоры дыхательного тракта -- стимулирует специфический клеточный и гуморальный иммунный ответ, функции фагоцитов, определяет количество Т- и В-лимфоцитов в крови, повышает местный иммунитет дыхательного и желудочно-кишечного тракта, а ИРС-19 представляет собой аэрозоль для интраназального применения, содержащий лизат микроорганизмов, наиболее часто являющихся возбудителями инфекций дыхательных путей; повышает фагоцитарную активность макрофагов, увеличивает содержание эндогенного интерферона и лизоцима, стимулирует процесс продуцирования секреторного иммуноглобулина А, обладает десенсибилизирующей активностью; применяется при острых и хронических инфекциях дыхательного тракта),

глюкозаминилмурамилдипептид (лекарственная форма ликопид, фрагмент клеточной стенки практически всех известных бактерий -- активирует неспецифический иммунитет, в частности, повышает интенсивность поглощения и киллинга микробов при фагоцитозе, цитотоксичность по отношению к вирусинфицированным и опухолевым клеткам, экспрессию HLA-DR-антигенов, синтеза ИЛ1, ФНО-альфа, КСФ, подавляет воспалительные процессы; применяется при гнойно-воспалительных заболеваниях кожи и мягких тканей, вызванных как грамположительными, так и грамотрицательными бактериями, при хронических инфекциях верхних и нижних дыхательных путей, туберкулезе, офтальмогерпесе, псориазе, папилломатозе и др. ),

гликопротеидные вакцины, полученные из капсул и клеточных стенок Streptococcus pneumonie и Klebsiella pneumonie; индуцируют не только специфический, но и естественный иммунитет (в частности, препарат “биостим” стимулирует синтез ИЛ1, активирует миелопоэз; рекомендуется больным хроническим бронхитом, а также онкобольным при химиотерапии).

Анатоксины (токсоиды)

Примером молекулярных вакцин являются анатоксины: дифтерийный, столбнячный, бо- тулинический (типов А, В, Е), гангренозный (перфрингенс, нови и др. ), стафилококковый, холерный.

Принцип получения анатоксинов состоит в том, что образующийся при культивировании соответствующих бактерий токсин в молекулярном виде превращают в нетоксичную, но сохраняющую специфическую антигенность форму -- анатоксин путем воздействия 0, 4% формальдегида и тепла (37 °С) в течение 3--4 недель. Полученный анатоксин подвергают очистке и концентрированию физическими и химическими методами для удаления балластных веществ, состоящих из продуктов бактерий и питательной среды, на которой они выращивались. К очищенному и концентрированному анатоксину для повышения его иммуногенности добавляют адъюванты, обычно сорбенты-- гели А1(ОН)3 и А1(Р04). Полученные таким образом препараты назвали очищенными сорбированными анатоксинами.

Дозируют анатоксины в антигенных единицах: единицах связывания (ЕС) анатоксина специфическим антитоксином или в единицах флокуляции (Lf). Анатоксины относятся к числу наиболее эффективных профилактических препаратов. Благодаря иммунизации дифтерийным и столбнячными анатоксинами резко снижена заболеваемость и ликвидированы эпидемии дифтерии и столбняка. Очищенные сорбированные анатоксины применяют подкожно или внутримышечно по схеме, предусмотренной календарем прививок.

Синтетические вакцины

Молекулы антигенов или их эпитопы сами по себе обладают низкой иммуногенностью по-видимому в связи с деструкцией их в организме ферментами, а также недостаточно активным процессом их адгезии иммунокомпетентными клетками, из-за относительно низкой молекулярной массы антигенов. В связи с этим ведутся поиски повышения иммуногенности молекулярных антигенов путем искусственного укрупнения их молекул за счет химической или физико-химической связи («сшивки») антигена или его детерминанты с полимерными крупномолекулярными безвредными для организма носителями (типа поливинилпирролидона и других полимеров), который бы играл роль «шлеппера» и роль адъюванта.

Таким образом, искусственно создается комплекс, состоящий из антигена или его детерминанты + полимерный носитель + адъювант. Часто носитель совмещает в себе роль адъюванта. Благодаря такой композиции тимусзависимые антигены можно превратить в тимуснезависимые; такие антигены будут длительно сохраняться в организме и легче адгезироваться иммунокомпетентными клетками. Вакцины, созданные на таком принципе, получили название синтетических. Проблема создания синтетических вакцин довольно сложная, но она активно разрабатывается, особенно в нашей стране (Р. В. Петров, Р. М. Хаитов). Уже создана вакцина против гриппа на полиоксидонии, а также ряд других экспериментальных вакцин.

Антимикробные и антитоксические лечебные и профилактические сыворотки. Принципы получения и применения.

Антитоксические сыворотки содержат антитела против экзотоксинов. Их получают путем гипериммунизации животных (лошадей) анатоксином.

Активность таких сывороток измеряется в АЕ (антитоксических единицах) или ME (международных единицах) -- это минимальное количество сыворотки, способное нейтрализовать определенное количество (обычно 100 DLM) токсина для животных определенного вида и определенной массы.

В настоящее время в России широко используются следующие антитоксические сыворотки:

* противодифтерийная;

* противостолбнячная;

* противогангренозная;

* противоботулиническая.

Применение антитоксических сывороток при лечении соответствующих инфекций обязательно.

3. Антимикробные сыворотки содержат антитела против клеточных антигенов возбудителя. Их получают иммунизацией животных клетками соответствующих возбудителей и дозируют в миллилитрах. Антимикробные сыворотки могут применяться при лечении:

* сибирской язвы;

* чумы;

* стрептококковых инфекций;

* стафилококковой инфекции;

* синегнойной инфекции.

Их назначение определяется тяжестью течения заболевания и, в отличие от антитоксических, не является обязательным. При лечении больных с хроническими, длительно, вяло текущими формами инфекционных заболеваний возникает необходимость стимулировать собственные механизмы специфической зашиты путем введения различных антигенных препаратов и создания активного приобретенного искусственного иммунитета (иммунотерапия антигенными препаратами). Для этих целей используются в основном лечебные вакцины и значительно реже -- аутовакцины или стафилококковый анатоксин.

Убитые лечебные вакцины -- дизентерийная, гонококковая (гоновакцина), бруцеллезная, стафилококковая -- используются довольно давно.

Иммунные сыворотки. Иммуноглобулины

Первые иммунные антитоксичкские противодифтерийные сыворотки получил Беринг. К настоящему времени разработаны и применяются не только антитоксические сыворотки для лечения и профилактики дифтерии, столбняка, газовой гангрены, ботулизма, но и множество противобактериальных (противотифозная, дизентерийная, противочумная и др. ), а также противовирусных сывороток (гриппозная, коревая, против бешенства и др. ).

Иммунные сыворотки получают путем гипериммунизации (т. е. многократной интенсивной иммунизации) животных (чаще всего лошади, ослы, иногда кролики) специфическим антигеном (анатоксином, бактериальными иливирусными культурами и их антигенами) с последующим, в период максимального антителообразования, кровопусканием и выделением из крови иммунной сыворотки. Иммунные сыворотки, полученные от животных, называют гетерогенными, так как они содержат чужеродные для человека сывороточные белки.

Для получения гомологичных нечужеродных иммунных сывороток используют сыворотки переболевших людей (коревая, паротитная, оспенная сыворотки) или специально иммунизированных людей-доноров (противостолбнячная, противоботулиническая и другие сыворотки) либо сыворотки из плацентарной, а также абортной крови, содержащие антитела к ряду возбудителей инфекционных болезней вследствие вакцинации или перенесенного заболевания.

Естественно, что гомологичные сыворотки предпочтительнее гетерологичных. Поскольку нативные иммунные сыворотки содержат в своем составе ненужные балластные белки, например альбумин, из этих сывороток выделяют и подвергают очистке и концентрированию специфические белки -- иммуноглобулины.

Д. ля очистки и концентрирования иммуноглобулинов используют различные физико-химические методы: осаждение спиртом или аиетоном на холоде, обработка ферментами, аффинная хроматография, ультрафильтрация.

Иногда, а именно для повышения специфичности и активности антител, из молекулы иммуноглобулина выделяют только антигенсвязывающий участок (Fab-фрагменты); такие иммуноглобулины получили название именных антител.

Активность иммунных сывороток и иммуноглобулинов выражают в антитоксических единицах, в титрах вируснейтрализующей, гемагглютинирующей, преципитирующей, агглютинирующей и т. д. активности, т. е. тем наименьшим количеством антител, которое вызывает видимую или регистрируемую соответствующим способом реакцию с определенным количеством специфического антигена.

Так, активность антитоксической противостолбнячной сыворотки и соответствующего иммуноглобулина выражают в антитоксических единицах (АЕ) или в международных антитоксических единицах (ME), т. е. количеством антитоксина, связывающего 100 Dimили 1000 Dimдля белой мыши столбнячного токсина. Титр агглютинирующих или преципитирующих сывороток выражают в максимальных разведениях сыворотки, вызывающих соответствующие реакции с антигеном; вируснейтрализующие антитела -- в разведениях, нейтрализующих определенное количество вируса при биопробах на культуре клеток, развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) или животных.

Иммунные сыворотки и иммуноглобулины применяют с лечебной и профилактической целью. Особенно эффективно применение сывороточных препаратов для лечения токсинемических инфекций (столбняк, ботулизм, дифтерия, газовая гангрена), а также для лечения бактериальных и вирусных инфекций (корь, краснуха, чума, сибирская язва и др. ) в комплексе с другими способами лечения. С лечебной целью сывороточные препараты вводят как можно раньше внутримышечно (иногда внутривенно) в больших дозах.

Профилактические дозы сывороточных препаратов значительно меньше лечебных, а препараты вводят внутримышечно обычно лицам, имевшим контакт с больным или иным источником инфекции, для создания пассивного иммунитета. При введении сывороточных препаратов иммунитет наступает через несколько часов и сохраняется 2--3 недели после введения гетерологичных и в течение 4--5 недель -- гомологичных сывороточных препаратов.

После введения сывороточных препаратов возможны осложнения в виде анафилактического шока и сывороточной болезни.

Поэтому перед введением препаратов ставят аллергическую пробу на чувствительность к ним пациента, а вводят их по Безредке.

В некоторых случаях прибегают к пассивно-активной иммунизации, т. е. к одновременному введению сывороточных препаратов и вакцин, в результате чего быстро наступающий, но кратковременный пассивный иммунитет, обусловленный вводимыми антителами, подменяется через 2--3 недели активным иммунитетом, возникающим в ответ на введение вакцины. К пассивно-активной иммунизации прибегают для профилактики столбняка у раненых, при профилактике бешенства и других инфекций.

90. Иммуноглобулины, способы получения, особенности применения.

Иммуноглобулинами (гамма-глобулинами) называют очищенные и концентрированные препараты гамма-глобулиновой фракции сывороточных белков, содержащие высокие титры антител и присутствующие в крови, цереброспинальной жидкости, лимфоузлах, селезенке, слюне и других тканях. Синтезируются они в лимфоидных клетках, содержат углеводные группировки и могут рассматриваться как гликопротеины. По электрофоретической подвижности иммуноглобулины относятся в основном к гамма-глобулинам и в 2 -глобулинам. Биологическая роль иммуноглобулинов в организме связана с участием в процессах иммунитета. Их защитная функция обусловлена способностью специфически взаимодействовать с антигенами.

Освобождение от балластных сывороточных белков способствует снижению токсичности и обеспечивает быстрое реагирование и прочное связывание с антигенами. Применение гамма-глобулинов снижает количество аллергических реакций и осложнений, возникающих при введении гетерологичных сывороток. Современная технология получения человеческого иммуноглобулина гарантирует гибель вируса инфекционного гепатита. Основным иммуноглобулином в препаратах гамма-глобулина является IgG.

Нормальные и специфические иммуноглобулины являются мощным средством экстренной профилактики и лечения многих заболеваний, прежде всего инфекционных. В практике здравоохранения применяют гомологичные (человеческие) и гетерологичные (лошадиные) иммуноглобулины.

Гомологичные сыворотки или гамма-глобулины человека не вызывают анафилактических реакций и вводятся однократно.

Важным условием эффективного использования гамма-глобулинов для лечения и профилактики инфекционных заболеваний является как можно более раннее их назначение с момента заболевания или заражения. Пассивный иммунитет возникает через несколько часов и длится до двух недель.

Получение и контроль качества иммуноглобулинов

Наиболее часто для получения препаратов иммуноглобулина применяют метод Кона, метод фракционирования белков этиловым спиртом. Используются различные модификации этого метода, фракционирование проводится при низкой температуре. Используются дополнительные способы фракционирования с целью освобождения препаратов от пигментов, гонадотропных гормонов, групповых веществ крови и других антигенов. Для гарантии исключения вирусной контаминации в современном производстве применяются дополнительные методы обезвреживания сывороточных препаратов: пастеризацию (термическую обработку материалов при 60єC в течение 10 часов), обработку хлороформом, полиэтиленгликолем, в-пропиолактоном, ультрафиолетовое облучение.

Препараты иммуноглобулинов контролируются по физико-химическим свойствам на содержание общего белка, фрагментированных и агрегированных молекул, на электрофоретическую однородность, степень очистки от балластных сывороточных белков, на стерильность, токсичность, пирогенность, способность к хлопкованию, наличие HBsAg и антител к вирусу гепатита C и ВИЧ. По российским требованиям количество фрагментов и агрегатов иммуноглобулина в коммерческих препаратах не должно превышать 3%, хотя по европейской фармакопее этот процент измененных молекул в препаратах иммуноглобулина может достигать 10.

Наряду с методами, применяемыми для контроля иммуноглобулинов для внутримышечного введения, ВОЗ рекомендует контролировать препараты для внутривенного введения на гипотензивную активность (определение содержания активатора прекалликреина), антикомплементарную активность и содержание гемагглютининов.

Нормальный иммуноглобулин, полученный по методу Кона, состоит в основном из IgG. IgM и IgA остаются в балластных фракциях, хотя они содержат антитела, играющие важную роль в развитии иммунитета против бактериальных и вирусных инфекций. Следует отметить, что при производстве сывороточных препаратов огромное количество антител идет на выброс, используется лишь небольшая часть иммунологически активного материала. При использовании метода Кона IgM и IgA попадают в осадок B, наиболее опасный в отношении возможной контаминации ретровирусами. В связи с этим для получения обогащенных препаратов применяются дополнительные методы фракционирования и очистки иммуноглобулинов с помощью методов ионообменной хроматографии, адсорбционной хроматографии, ультрафильтрации, а также дополнительные методы их обезвреживания

Показания к применению

Нормальные и специфические иммуноглобулины являются мощным средством экстренной профилактики и лечения многих заболеваний, прежде всего инфекционных.

Пассивная иммунизация дает быстрый и хороший эффект, особенно в сочетании с антибиотикотерапией. Такой способ иммунопрофилактики используется в качестве превентивной меры при опасности заражения в эпидемические сезоны и в стрессовых ситуациях, а также при сепсисе, токсических состояниях.

Специфические иммуноглобулины оказывают не только прямое действие на возбудителя инфекции, они обладают выраженным неспецифическим иммуномодулирующим свойством. Оно зависит прежде всего от присутствия в препаратах биологически активных веществ (лизоцим, компоненты системы комплемента, цитокины).

Иммуноглобулины являются ценным средством профилактики и лечения всех инфекционных заболеваний, при которых развитие иммунитета зависит от циркулирующих антител. За рубежом и у нас в стране разрабатываются новые препараты иммуноглобулинов против вирусов краснухи, герпеса, геморрагической лихорадки с почечным синдромом, цитомегаловирусной инфекции. Тормозит производство таких препаратов отсутствие надежных коммерческих диагностикумов, необходимых для отбора донорских сывороток по титрам антител. Перспективным источником создания специфических иммуноглобулиновых препаратов являются моноклональные антитела, они обладают узкой специфичностью и могут быть получены в большом количестве.

Особенности применения

В России выпускаются комплексные препараты иммуноглобулина, предназначенные для разных способов введения. Гамма-глобулины вводят в организм подкожно, внутримышечно, внутривенно. Возможно также введение в спинномозговой канал.

При внутривенном введении для снижения антикомплементарной активности применяют различные способы предотвращения образования белковых агрегатов и их удаления, а также методы ферментативного расщепления или изменения структуры Fc-фрагментов, ответственных за побочное действие иммуноглобулинов. Для предупреждения агрегирования используют различного рода стабилизаторы, пригодные для внутривенного введения (полиэтиленгликоль, человеческий сывороточный альбумин, химически модифицированный желатин, сахара).

Задачи по частной микробиологии

Стафилококки (гнойные инфекции, пищевые интоксикации, стафилоносительство)

Эпидемиология

Источник инфекции - больной человек, бактерионосители, больное животное. Стафилококки, являясь постоянными обитателями кожи и слизистых, могут вызвать аутоинфекцию. Микроорганизмы этой группы могут вызывать внутрибольничную инфекцию. Путь передачи - контактно-бытовой, воздушно-капельный, алиментарный.

Патогенез

Стафилококки проникают в любые органы и ткани. Это свойство связано с наличием у них факторов патогенности - экзотоксина и ферментов агрессии. Экзотоксин пантропен и состоит из множества фракций, обладающих органотропностью. Фракции экзотоксина: гемотоксин, лейкотоксин, некротоксин, нейротоксин, летальный токсин, энтеротоксин, эксфолиативные токсины, экзотоксин, вызывающий синдром токсического шока и т. д. Стафилококк имеет весь набор ферментов агрессии - гиалуронидазу, плазмокоагулазу, лецитиназу, фибринолизин и другие.

Клиника

Стафилококки проникают в организм через повреждения кожи и слизитых оболочек, вызывая самые разнообразные заболевания - от банальной угревой сыпи до тяжелейшего перитонита, эндокардита, сепсиса и септикопиемии, менингита, пневмонии, при которых летальность достигает до 80%. Стафилококки играют ведущую роль в гнойной хирургии. Инфицирование стафилококками пищевых продуктов - частая причина пищевых отравлений (пищевых интоксикаций).

Лабораторная диагностика.

Исследуемый материал зависит от клинических проявлений инфекции. Это могут быть кровь, спинномозговая жидкость, мокрота, гнойное отделяемое пораженного органа, рвотные массы.

1. Микроскопический метод - определяет род. В мазках из исследуемого материала - грамположительные бактерии шаровидной формы в виде гроздьев винограда.

2. Бактериологический метод - ведущий, служит для определения вида стафилококка. Исследуемый материал засевают на элективные среды - желточно-солевой агар (ЖСА) с целью выделения чистой культуры. Кровь и спинномозговую жидкость предварительно обогащают на 1% сахарном бульоне. В бульоне возбудитель дает равномерное помутнение, на агаре - гладкие, пигментированные колонии с ровными краями. Идентификацию стафилококка проводят по факторам патогенности: лецитиназная активность определяется на ЖСА (вокруг колоний отмечается перламутровая зона помутнения среды); гемолитическая активность определяется путем посева культуры стафилококка на кровяной агар; плазмокоагулаза определяется посевом в цитратную плазму; биохимическая активность - посевом в пестрый ряд. По патогенности выделяют три вида стафилококка (см. таблицу). Для обнаружения типа энтеротоксина используют реакцию преципитации в геле(РП).

Таблица дифференциальной диагностики видов стафилококков

Дифференциальный признак	Staphylococcus aureus	Staphylococcus epidermidis	Staphylococcus saprophyticus
Плазмкоагулаза	+	-	-
Гемолизин	+	-	-
Лецитиназа	+	-	-
Сбраживание маннита	+	-	+
Сбраживание глюкозы	+	+	-
Экзотоксин	+	-	-
Преимущественное место локализации	Пантропен	Кожа и слизистые	Слизистые .

С целью определения источника инфекции проводят фаготипирование с помощью типового стафилококкового бактериофага.

3. Серологический метод - реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), иммуно- ферментная реакция (ИФА) для определения специфических антител в сыворотке крови больного к тейхоевой кислоте, содержащейся в клеточной стенке стафилококка.

4. Биологический метод - биопроба на котятах (пероральное введение фильтрата бульонной культуры стафилококка) для обнаружения энтеротоксина. Токсины вызывают у котят рвоту и понос.

5. Аллергический метод не применяется.

Лечение и специфическая профилактика. Этиотропная терапия назначается с учетом антибиотикочувствительности. Для лечения используют главным образом В-лактамные антибиотики, макролиды, полипептидные антибиотики. Специфическая иммунотерапия применяется при тяжелых и хронических стафилококковых инфекциях - в виде противостафилококкового человеческого иммуноглобулина, антистафилококковой плазмы.

Специфическая плановая профилактика - стафилококковый анатоксин. Показана беременным женщинам перед родами. Иммунитет кратковременный.

менингококки (менингит, менингококцемия)

Менингит - инфекционное респираторное заболевание с гнойно-воспалительными проявлениями мозговых оболочек спинного и головного мозга. Возбудитель - Neisseriameningitidisотносится к семейству Neisseriaceae.

Эпидемиология

Источник инфекции - больной человек либо бактерионоситель. Инфекция - антропонозная. Путь передачи инфекции - воздушно-капельный. Входные ворота - слизистая носоглотки. Во внешней среде неустойчив.

Патогенез

С помощью пилей и белков наружной мембраны возбудитель осуществляет адгезию и колонизацию эпителия носоглотки, где происходит его первичное размножение. Из носоглотки возбудитель проникает в лимфатические сосуды и в кровь, а затем в центральную нервную систему, где оседает на мягких мозговых оболочках и, интенсивно размножаясь, вызывает их воспаление. При гибели возбудителя выделяется эндотоксин, обладающий пирогенным, некротическим и летальным действием. Главный фактор патогенности - капсула, защищающая менингококк от фагоцитоза.

Клиника

Инкубационный период 2-4 дня. Менингококки могут вызывать следующие клинические формы болезни: назофарингит (наиболее легкая форма); менингококцемия (менингококковый сепсис); эпидемический цереброспинальный менингит. Клинические проявления - головная боль, сыпь, симптомы интоксикации. После перенесенного заболевания формируется прочный длительный антимикробный иммунитет.

Лабораторная диагностика.

Исследуемый материал - ликвор, кровь. Ликвор перед исследованием центрифугируют.

1. Микроскопический метод -ведущий. Из осадка спинномозговой жидкости готовят 2 мазка. Один красят по методу Грама, другой - щелочной синькой. При окраске по методу Грама в мазке - грамотрицательные диплококки бобовидной формы. При простом методе окраски - диплококки внутри лейкоцитов (незавершенный фагоцитоз).

Для определения серотипа менингококка ставится реакция преципитации надосадочной жидкости с преципитирующей антименингококковой сывороткой. По О- антигену у возбудителя различают 13 серотипов. Основные - А, В, Д, \А/-135, Y

...