Оптимізація діагностики ендотеліальної дисфункції та прогнозування перебігу хронічного обструктивного захворювання легень в поєднанні з гіпертонічною хворобою

Важливим питанням останніх десятиліть є вивчення факторів, які модулюють функцію ендотелію. За влучним визначенням Lьscher T. F., Corti R. (2004), «потік є сигналом життя» [113]. Потік крові, тобто перемінна сила тиску як фізичне явище сприймається внутрішньою поверхнею ендотелію всієї серцево-судинної системи і трансформується в численні сигнали у відповідності до різноманітних фізіологічних вимог в організмі. Так званий зсувний стрес є одним з важливих фізіологічних сигналів, який регулює синтез та вивільнення релаксаційних і констриктивних факторів щодо судинних гладеньких м'язів і обумовлює вазодилатацію чи звуження судин [120, 121].

Розділяють атеропротекторні ламінарний або пульсуючий варіанти, протиставляючи їм потенційно несприятливі поперечний коливальний вплив або порушення току крові, причому докладно досліджують основні молекулярні механізми, що асоціюються з цими моделями кров'яного потоку [120].

Стійкий ламінарний потік забезпечує атеропротекторну дію на судинну стінку, посилюючи вироблення ендотелію простацикліну та оксиду азоту, тоді як порушений потік стимулює прозапальну сигналізацію з результуючою ендотеліальною дисфункцією та подальшим розвитком атеросклеротичних уражень [121].

Такий порушений потік, який сприймається на чутливих ділянках судинного русла (таких як артеріальні гілки, біфуркації та вигини), прискорює ендотеліальне старіння через p53-p21-залежний шлях; активація у експериментальних умовах сиртуїну-1 чинила захисний вплив щодо ендотелію [122].

Також було продемонстровано, що аспект механічного впливу на ендотелій із подальшою сигналізацією відіграє важливу роль у терапевтичному ангіогенному ефекті імпульсного ультразвуку [123].

Активні форми кисню вважаються перш за все шкідливими через їх надзвичайно потужний вплив на клітини й тканини та патологічні наслідки в широкому діапазоні серцево-судинних захворювань, асоційованих із дисфункцією ендотелію [113, 124].

За допомогою новітньої методики мікродіалізу, яка дозволяє одночасно вимірювати рівень вільнорадикальних форм кисню, було показано його підвищення у людей з ожирінням і мікросудинною ендотеліальною дисфункцією [125, 126]. Звертає на себе увагу позитивний вплив 8-тижневого тренування з аеробними вправами, за якого відбулася нормалізація як вихідних підвищених рівнів реактивних форм кисню, так мікросудинної ендотеліальної функції [126].

Проте, у яскравому контрасті відносно відомих раніше негативних ефектів активних форм кисню було виявлено і визначну фізіологічну їх роль у регуляції судинного гомеостазу [113, 124].

Так, показано атеропротективну роль пероксиду водню NADPH оксидази 4 у моделі мишей діабет-асоційованого атеросклерозу [126]. Продемонстровано, що надмірна продукція ендотеліального оксиду азоту в умовах дефіциту негативного регулятора ендотеліальної синтази оксиду азоту (eNOS) кавеоліну-1 або надмірної експресії eNOS змінює фізіологічний баланс між оксидом азоту та перекисом водню як фактором ендотелійзалежної гіперполяризації у мікроциркуляції, в результаті чого порушується серцево-судинний гомеостаз [127, 128].

Запропоновано один із механізмів ролі мікросудинної дисфункції у розвитку захворювань коронарних артерій [129]. Як уже було обговорено вище, за нормальних умов коронарна циркуляція регулюється оксидом азоту та низьким фізіологічним рівнем перекису водню як фактору ендотелійзалежної гіперполяризації. Проте в умовах атерогенезу та порушення обміну речовин має місце переважання перекису водню, патологічно високий рівень якого, як меч з подвійним лезом, призводить до мікросудинної дисфункції та розвитку ішемічної хвороби серця [130]. У експериментальних умовах показано, що зниження активності теломерази в мітохондріях викликає описані ефекти [131, 132].

Хоча джерела та регулятивні механізми фізіологічних рівнів активних форм кисню не є остаточно відомими, місцева субклітинна концентрація в мікродоменах, а не чиста внутрішньоклітинна концентрація, може мати вирішальне значення для визначення того, чи можуть їх ефекти бути позитивними або шкідливими для клітинних процесів [113]. Серед редокс-регулюючих білків показано, що ендотеліальна тіоредоксинуредуктаза 2 відіграє ключову роль у підтримці здорових ендотеліальних функцій [133], коактиватор 1б проліфераторів рецепторів г пероксисом є основним регулятором ендотеліальних функцій, включаючи захист від окисного стресу, запалення та атеросклероз [134].

Описана вище подвійна роль активних форм кисню як значної ендогенної сигнальної молекули, може бути ключем до розробки кращих терапевтичних стратегій (наприклад, ізоформ або специфічних інгібіторів NADPH оксидаз тощо) [113, 135].

Накопичуються докази вазопротекторної ролі периваскулярної жирової тканини [113, 136]. Периваскулярну жирову тканину класифікують на білу, коричневу та бежеву з різними патофізіологічними ролями залежно від її розташування в організмі. З'ясовано її модулюючий вплив на судинний тонус паракринним чи аутокринним шляхом із вивільнення масиву вазоактивних речовин, включаючи адипонектин, оксид азоту, сірководень та інших іще не ідентифікованих щодо даного ефекту [136].

Показано, що, подібно до периваскулярної адипозної тканини, що оточує аорту або брижові артерії, міжшкірна коричнева жирова тканина чинить антиконтрактильний ефект за допомогою активації циклічної GMP-індукованої PKG1б (циклічної GMP-залежної протеїнкінази G1б) та наступної вазодилатації малих резистивних артерій, що відкриває терапевтичний потенціал впливу на коричневу жирову тканину в контексті лікування серцево-судинних порушень. Цікаво, що ця окислювально-опосередкована активація PKG1б пов'язана із вазодилатуючим механізмом перекису водню як фактора ендотелійзалежної гіперполяризації у резистивних артеріях [113]. Крім того, передбачено потенційну роль периваскулярної жирової тканини у патогенезі пов'язаних з ожирінням коронарної хвороби серця [137].

Виявлено потенційно новий механізм, за допомогою якого може розвинутися коронарна мікросудинна дисфункція; активність ADAM17 (старіння та ожиріння збільшували активність дезінтегріну та металлопротеази) та вироблення розчинного фактору некрозу пухлини в жировій тканині призводить до зміни порушеної ендотелій-залежної вазодилатації коронарних артеріол [138].

Ожиріння також погіршує судинну функцію, опосередковану периваскулярною адипозною тканиною, через механізми, що включають релаксаційні сигнали, одержувані ендотелієм [113].

По-перше, ожиріння сприяє залученню прозапальних макрофагів до периваскулярного простору і порушенню вазодилататорної властивості периваскулярної жирової тканини шляхом зменшення виробництва сірководню, що є потужним розслабляючим чинником, ендотеліальними та судинними гладеньком'язовими клітинами [139].

По-друге, аліментарне ожиріння спричиняє роз'єднання eNOS у периваскулярній адипозній тканині через аргіназа-індукований дефіцит L-аргініну [140]. При цьому, викликана ожирінням втрата антиконтактильного ефекту периваскулярної жирової тканини є зворотною шляхом обмеження калорійності [141].

Вірогідно, описані вище нові докази обґрунтовують терапевтичний потенціал, спрямований на урахування орлі периваскулярної жирової тканини у лікуванні серцево-судинних захворювань, пов'язаних із судинною дисфункцією.

Зростаюча кількість досліджень доводить різнопланову корисну роль АМФ-активованої протеїнкінази при лікуванні порушень обміну речовин, у тому числі цукрового діабету та ожиріння, де суттєвою є роль судинної дисфункції ендотелію.

Продемонстровано, що б1-субодиниця ендотеліальної AMФ-активованої протеїнкінази відіграє важливу роль у регуляції артеріального тиску та реакції коронарного потоку через ендотелій-залежну вазодилатацію, не впливаючи на оксид азоту-опосередковану вазодилатацію [113].

До речі, метформін, який є препаратом вибору для лікування цукрового діабету 2-го типу, є також активатором цієї протеїнкінази. Нещодавно продемонстрували, що ендотеліальна АМФ-активована протеїнкіназа відіграє важливу захисну роль проти розвитку легеневої гіпертензії і що метформін може бути корисним препаратом для лікування цього стану [142].

Подібно до АМФ-активованої протеїнкінази, сиртуїн-1 -- це асоційований з старінням білок, який демонструє ефекти антисенесценції в ендотеліальних клітинах [143].

Сумісний атеропротективний ефект ситруїну-1 та АМФ-активованої протеїнкінази обумовлений тим, що F-актин-зв'язуючий білок корактин, накопичений за допомогою AMФ-активованої протеїнкінази і фосфорилювання та дератилювання сіртуїну-1-медикаментозного деацетилювання у відповідь на стрес зсуву, сприяє розподіленню та наступній активації ендотеліальної синтази оксиду азоту, що призводить до атеропротекторних ефектів [144, 145].

Більш того продемонстровано, що ендотеліальна мікроРНК-34а підвищується через окисний стресу і сприяє дисфункції ендотелію через інгібіювання сиртуїну-1 [146]. У гіперліпідемічній моделі миші гальмування активації каспази-1 під час раннього атерогенезу полегшило накопичення сиртуїну-1 в ендотеліальних клітинах з одержанням протизапальних ефектів [146].

Сумісно ендотеліальні АМФ-активована протеїнкіназа та сиртуїн-1 можуть бути перспективними терапевтичними мішенями для лікування серцево-судинних та метаболічних розладів [147].

Калієві канали відіграють ключову роль у механізмах вазодилатації, особливо в тих, що пов'язані з ендотелійзалежною гіперполяризацією, релаксацією і вазодилатацією судинної гладкої мускулатури. Так, показано, що релаксація KV7-опосередкованого каналу у відповідь на ізопротеренол залежить від обмінного білка, безпосередньо активованого циклічним АМФ в брижовій артерії, але не в нирковій артерії, що свідчить про зміну проміжних сигнальних етапів від в-адренорецепторів до каналів KV7 залежно від місцеположення судин [148].

Встановлено, що блокування каналів KCa3.1 знижує атеросклеротичне навантаження та підвищує стабільність бляшки за атеросклерозу, інгібіюючи диференціювання макрофагів до прозапального фенотипу M1 [149]. Проте, неспецифічне інгібіювання KCa3.1 вимагає обережності, оскільки це може призвести до порушення мікросудинного ендотелію через інгібіцію EDH-опосередкованих реакцій [150].

Морфогенний протеїн кістки 4 залучений у розвиток серцево-судинних захворювань та дисфункції ендотелію [151]. Недавні дослідження продемонстрували функціональний зв'язок між морфогенним протеїном кістки 4 і тромбоцитарними факторами росту в молекулярних механізмах ендотеліальної дисфункції та терапевтичного потенціалу інгібіювання каскаду морфогенного протеїну кістки 4 для діабетичної ендотеліальної дисфункції [113].

Специфічна для ендотелію делеція рецептора P2Y2 чинить захисну дію в аспекті стабілізації зубного нальоту, сприяючи утворенню волокнистої шапки в атеросклеротичній моделі миші. Враховуючи, що ендотеліальна клітино-специфічна P2Y2 рецепторно-дефіцитна миша показала зниження нуклеотид-опосередкованої, але збереженої ацетилхолін-індукованої ендотелій-залежної релаксації аорти, не викликаючи системної гіпертензії, ендотеліальний рецептор P2Y2 може бути перспективною терапевтичною мішенню для атеросклеротичних серцево-судинних захворювань [152].

Запальні стани суттєво впливають на розвиток ендотеліальної дисфункції, інтерлейкіни 1в, 17, 18 та фактор некрозу пухлин б є одними з ключових прозапальних цитокінів [153, 154].

Продемонстровано тісний зв'язок між ендотеліальною дисфункцією, оціненою через потік-опосередковану дилатацію, та запаленням судин, виявлений за допомогою томографії, комп'ютерної томографії, (18F)-флуоретоксиглюкозо-позитронно-емісійної томографії у суб'єктів з низьким кардіоваскулярним ризиком, обидва з них було покращено через 6-місячне антигіпертензивне лікування [155].

Ряд молекул, включених у шлях лектин-компонентів, може сприяти ендотеліальній дисфункції у пацієнтів з легкими метаболічними факторами ризику. Крім того, нещодавній метааналіз показав позитивний зв'язок між підвищенням рівня антагоніста рецепторів інтерлейкіну-1в в сироватці крові та збільшенням частоти серцево-судинних захворювань у загальній популяції [156].

Виходячи із запальної теорії атерогенезу і відомої ролі запалення у розвитку серцево-судинних захворювань, наразі ведеться великомасштабне рандомізоване клінічне випробування, метою якого є з'ясування того, чи може таргетування інтерлейкіну-1в знижувати ризик повторних серцево-судинних подій (дослідження CANTOS) [157, 158].

Зв'язок між запаленням та коронарною ендотеліальною дисфункцією підтверджує той факт, коронарна ендотеліальна дисфункція більш виразна у сегментах ішемічної артерії з інфільтрацією макрофагів і проліферацією власних судин артерій, ніж у осіб без таких змін, що вказує на важливу роль запалення та проліферації власних судин артерій в патогенезі ішемічної хвороби серця [113].

Роль легеневої гіпертензії у розвитку кардіореспіраторної патології, особливо поєднання хронічного обструктивного захворювання та системної артеріальної гіпертензії, є незаперечною [159]. Встановлено її зв'язки з численними патофізіологічними аспектами хвороб, зокрема, із нейрозапаленням [160] тощо.

Ендотелій-специфічна надмірна експресія циклофіліну А, яка, як доведено, індукує пошкодження судин через декілька механізмів, включаючи ендотеліальну дисфункцію та проліферацію гладеньких м'язів судин, викликає спонтанну легеневу гіпертензію [161]. Позаклітинний циклофілін А викликає дисфункцію ендотеліальних клітин через ендотеліальний апоптоз, запалення та окислювальний стрес [161].

Запропоновано механізм, за допомогою якого розвивається захворювання коронарних артерій у пацієнтів з легеневою гіпертензією: експресія мікроорганізмів, що містять бромдомієн 4, який сприяє атерогенним процесам через запальні реакції в ендотеліальних клітинах, збільшена не тільки в легенях пацієнтів з легеневою гіпертензією, а й у їхніх коронарних артеріях, що сприяє ремоделюванню судин через посилену проліферацію та придушення апоптозу в судинних гладеньких м'язових клітинах. Ці дані дають підказку для розуміння того, чому легенева гіпертензія ускладнюється захворюванням коронарних артерій навіть за відсутності метаболічних розладів [162].

Показано, що індукований гіпоксією фактор-1 є важливим посередником, який послідовно породжує міогенні фактори, викликані гіпоксією, що сприяє розвитку легеневої гіпертензії, частково через активацію легеневої мікросудинної ендотеліальної клітини, апоптоз та запалення [163], частково -- провокуючи вазоконстрикцію [164].

Понад третину осіб когорти, що складалася з 5708 учасників Фреймінгемського дослідження, демонстрували реверсию потоків плечової артерії, яка була пов'язана з ендотеліальною дисфункцією, що оцінювалася через потік-опосередковану дилатацію або реактивний гіперемічний потік, і з вищою жорсткістю аорти [165]. Ці результати вказують на те, що обернення потоку може впливати на функцію ендотелію залежним чином і може слугувати показником дисфункції ендотелію.

З іншого аналізу зрізного Фреймінгемського дослідженя одна і та ж група дала подальше уявлення про зв'язок між неалкогольною жировою хворобою печінки та ендотеліальною дисфункцією, незалежно від добре сформованих серцево-судинних ризиків, пояснюючи принаймні частково, чому пацієнти з хронічними хворобами печінки зазвичай страждають на метаболічні та серцево-судинні захворювання [166].

Ендотеліальний глікокалікс відіграє важливу роль у збереженні нормальних функцій ендотелію, включаючи антикоагуляцію, механічні властивості та вироблення оксиду азоту, пов'язану з деформацією зсуву. Розроблено прості способи дослідження, які дозволяють оцінити функцію глікокаліксу шляхом вимірювання його антитромбогенної здатності in vitro [167]. Цей аналіз може прокласти шлях до розробки нового діагностичного інструменту ендотеліальної дисфункції та нового терапевтичного підходу, спрямованого на глікокалікс.

Виявлено декілька нових біомаркерів, які пов'язані з дисфункцією ендотелію та корелюють із тяжкістю або клінічними наслідками серцево-судинних захворювань. У дослідженні, що включало 3005 осіб у віці понад 40 років, сироватковий рівень ангіопоетиноподібного протеїну 2 (прозапального медіатора, який сприяє дисфункції ендотелію), був позитивно пов'язаний із ризиком серцево-судинних захворювань у майбутньому [168].

Показано, що рівень розчинного ендогліну (трансформуючого фактора росту в-рецептора, експресованого на проліферуючих ендотеліальних клітинах), обернено пов'язаний з тяжкістю ураження коронарних артерій [169]. Враховуючи, що раніше у пацієнтів із цукровим діабетом були виявлені суперечливі результати щодо того, питання того, чи ендоглін може служити біомаркером для ішемічної хвороби серця, чекає подальшого дослідження [113, 170].

Показано, що гіпергомоцистеїнемія викликає дисфункцію ендотелію, інгібіюючи NO-опосередковану релаксацію та релаксацію, пов'язану з ендотелійзалежною гіперполяризацією, в резистивних артеріях, через що вона вважається незалежним предиктором серцево-судинних подій [171].

Одним із механізмів, через який гомоцистеїн викликає ендотеліальну дисфункцію, є прискорення ендотеліального старіння через епігенетичну регуляцію зворотної транскриптази теломерази [172, 173, 174, 175]. Дійсно, підвищення рівня гомоцистеїну в плазмі знижує гіпотензивний ефект інгібітора ангіотензинпревращающего ферменту еналаприлу. Нарешті, підвищений рівень циклофіліну А в плазмі, особливо в комбінації з натрійуретичним пептидом мозку або високочутливим С-реактивним білком, може використовуватися для прогнозування серцево-судинних подій у пацієнтів з ішемічною хворобою серця [176, 177].

1.3 Стан функції ендотелію за хронічного обструктивного захворювання легень та гіпертонічної хвороби

На цей час серед патогенетичних зв'язків, що сприяють розвитку ГХ на фоні ХОЗЛ розглядаються гіпоксія й гіперкапнія [178-183], системне запалення [184, 185], оксидативний стрес, гемодинамічні порушення [186-198], що викликають дисфункцію та ураження ендотелію [199].

Однак на сучасному етапі залишається недостатньо вивчена роль дисфункції ендотелію в формуванні та регуляції змін, що відбуваються у хворих ХОЗЛ в поєднанні з ГХ.

Існує значна кількість доказів, підтверджуючих, що синтез ендотелієм NO необхідний для процесу ангіогенезу [200]. Одним з найважливіших факторів, що стимулює формування нових кровоносних та лімфатичних судин та збільшує проникність судин, є глікопротеїн, що зв'язується лише з ендотеліальними клітинами та стимулює їх проліферацію -- васкулоендотеліальний фактор росту (ВЕФР) [201, 202]. З одного боку, ВЕФР потрібен для стабілізації ендотелію, з іншої -- він виступає як прозапальний цитокін, який індукує макрофагальну та ендотеліальну активність, асоційований з бронхолегеневим та судинним ремоделюванням [203, 204].

Основною стимуляцією активації ангіогенезу є гіпоксія. За умов нестачі кисню в тканинах відбувається активація росту судин. Під впливом ангіогених факторів відбувається проліферація ендотеліоцитів, з подальшою дифференціровкою та формуванням судин чи його ремодулювання. ВЕФР є необхідним для адаптації тканин в умовах пошкодження [201].

На фоні дисфункції ендотелію порушується взаємозв'язок ВЕФР з еNOS, що призводить по порушення регуляції її активності та тим самим порушує продукцію NO та простацикліну [205]. Також ВЕФР впливає на виживання ендотелію, чинячи на нього антиапоптичний ефект. За умов зниження ВЕФР відбувається апоптоз ендотеліальних клітин, що призводить до звуження просвіту судин [204].

Зниження та порушення ендотеліального NO є одним з найважливіших показників ендотеліальної дисфункції, яка в свою чергу супроводжується посиленням продукції ВЕФР, що стимулює не лише неоангіогенез, але й призводить до перебудови судинної архітектоніки [204].

Встановлено асоціацію генетичного поліморфізму, зокрема, ВЕФР, з підвищеним ризиком ХОЗЛ [206]. У курців виявлено активацію вироблення ВЕФР [207]

Як один із найважливіших факторів дисфункції ендотелію можна розглядати гіперактивацію ренін-ангіотензин-альдостеронової системи (РАС) [208]. Близько 90 % всього обсягу РАС доводиться на органи і тканини (10 % -- на плазму), серед яких судинний ендотелій займає перше місце. Основною точкою докладання РАС є підтримка системного артеріального тиску та достатнього кровообігу в життєво важливих органах. Вона виявляє регулюючий вплив на кардіоваскулярну систему, нирковий гомеостаз, сприяє розвитку компенсаторних процесів. Однак при довготривалій активації РАС спостерігається спазм та підвищення периферійного опору судин, затримка рідини, збільшення об'єму циркулюючої крові, гіперперфузія органів та тканин, підвищена чутливість міокарду до токсичного впливу катехоламінів, ремоделювання судин, зменшення просвіту судини до товщини його стінки, розвиток міокардіального і периваскулярного фіброзу [209].

Ренін-ангіотензин-альдостеронова система проявляє свої ефекти через гормон ангіотензин II (АТ II), прогормон (попередник) якого, ангіотензиноген, виробляється в клітинах печінки. Ангіотензиноген розщеплюється нирковим реніном з утворенням неактивного декапептиду (пептиду, що складається з 10 амінокислотних залишків) ангіотензину I. Останній в результаті ферментативного впливу ангіотензинперетворюючого ферменту (АПФ, або кініназа II) втрачає 2 амінокислоти (гістидин і лейцин) і перетворюється в активний октапептид AТ II, який є одним з найсильніших вазоконстрікторних агентів. Циркулюючи в системі кровообігу, AТ II чинить свій вплив у різних органах і тканинах: в ЦНС, нирках, надниркових залозах, серці, судинах в основному через два типи рецепторів - АТ1 і АТ2. Надалі AТ II метаболізується (утилізується) в AТ III і ряд інших малоактивних пептидів [210].

В міру прогресування ХОЗЛ (за умов розвитку гіпоксії) відбувається активація симпатичного відділу вегетативної нервової системи, що призводить до рівня катехоламінів, зокрема норадреналіну, на підставі чого, в свою чергу, можна зробити висновок про порушення метаболічної функції легень и ролі симпатоадреналової системи у формуванні ГХ. Порушення обміну адреналіну, дофаміну, серотоніну, простагландинів, кініну та інших в цьому випадку пов'язані з зміненням так званої нереспіраторної функції легень. Багато даних є в літературі щодо ролі компонентів РАС в патогенезі серцево-судинних змін у хворих на ХОЗЛ. Тканинний зміст ангіотензину-II в значно більшій мірі визначає ступінь активності РАС, ніж його концентрація в плазмі периферичної крові. Найбільш важлива активність ангіотензинперетворюючого ферменту (АПФ) у ендотелії капілярів легень. Встановлено, що вміст і активність АПФ та компонентів РАС корелюють з ступенем гіпоксії, а наявність хронічного бронхообструктивного синдрому у частини хворих супроводжується збільшенням активності РАС, причому зростають як плазмові, так і тканинні компоненти, що, можливо, грає роль в розвитку гіпоксичної ГХ [76, 211].

Відзначена закономірність між підвищенням рівня АПФ в період загострення ХОЗЛ і зменшенням його в період ремісії захворювання. Відповідно до сучасних уявлень про процес морфо-функціональної перебудови міокарда і судинної стінки за розвиток фіброзу і гіпертрофії відповідальні підвищені рівні АТ-II і альдостерону, що є основними компонентами РАС. Причому виявлена достовірна пряма залежність між активністю тканинного АПФ і діастолічної дисфункцією, гіпертрофією шлуночків серця і рівнем альдостерону, що, в свою чергу, говорить про істотну роль найважливіших компонентів РАС в процесах ремоделювання серця у хворих на ХОЗЛ. Між РАС і САС існують багаторівневі позитивні зв'язки. АТ-II активує САС, полегшує вивільнення норадреналіну, а САС, в свою чергу, стимулює утворення реніну нирками [208].

У великих концентраціях ангіотензин-II сприяє виникненню окисного (оксидативного) стресу, так як, по-перше, він пригнічує активацію норадреналіну легкими; по-друге, збільшує активність НАД-і НАДФ-залежної оксидази і перетворює оксид азоту в супероксид азоту - один з основних окислювачів ліпопротеїдів низької щільності (ЛПНЩ); по-третє, зменшує синтез NO, руйнуючи брадикінін, сильний стимулятор освіти NO; по-четверте, стимулює окислення ЛПНЩ макрофагами. Таким чином, АТ-II, пов'язуючи між собою багато факторів, що впливають на тонус судин (ренін-ангіотензинову, кінінову, симпатичну нервову систему, альдостерон і ін.), стає центральною ланкою регуляції артеріального тиску. Активація САС і РАС при ХОЗЛ, а також їх висока активність при ГХ дозволяють припустити вірогідну участь ХОЗЛ у розвитку ГХ [212].

Дисфункція ендотелію -- перша ланка в патофізіології серцево-судинного континууму, в основі якого лежить прогресуюче ураження судин, що поглиблюється впливом ХОЗЛ. Розглядаючи функції ендотелію, можна говорити про дуже складний механізм взаємодії антагоністичних медіаторів, а також про регуляцію ними різних фізіологічних ефектів. При порушенні функції або структури ендотелію різко змінюється спектр біологічно активних речовин, що виділяються ним. За несприятливих умов ендотелій стає ініціатором (чи модулятором) багатьох патологічних процесів в організмі [213].

Дослідження функції ендотелію за допомогою неінвазивної периферичної артеріальної тонометрії (індексу пост-ішемічної реактивної гіперемії на плечовій артерії) у групах пацієнтів з ХОЗЛ, з ГХ, здорових осіб контролю показало високий показник розповсюдженості дисфункції ендотелію за ХОЗЛ [214]. За допомогою лінійного регресійного аналізу було виявлено пряму кореляцію між об'ємом форсованого видиху за 1-у секунду та індексом реактивної гіперемії. Відповідно, серед пацієнтів груп C та D згідно критеріям Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease встановлено нижчий показник індексу реактивної гіперемії порівняно з пацієнтами груп A та B. Дані множинного регресійного аналізу продемонстрували асоціацію дисліпідемії, ХОЗЛ та ГХ з наявністю дисфункції ендотелію. Це дозволило авторам дійти висновку про причетність порушення функції ендотелію у пацієнтів зі стабільним ХОЗЛ до розвитку коморбідної кардіоваскулярної патології, а також про доцільність визначення дисфункції ендотелію у пацієнтів з ХОЗЛ з метою своєчасної оцінки стану пацієнтів та лікування кардіальних ускладнень [214].

Коморбідний фон ХОЗЛ обтяжений не менше соматичного статусу хворих судинною патологією, при цьому відомо, що ХОЗЛ в свою чергу по ряду клінічних та лабораторних показників значно погіршує клінічний перебіг більшості відомих сьогодні захворювань.

Загальновідомо, що одним з пускових механізмів розвитку ЕД є запальний процес та гіпоксія. Відтак, пошкодження ендотелію супроводжується активацією поліморфноядерних лейкоцитів, продукцією активних форм кисню та інтенсифікацією перекисниго окислення білків та жирних кислот. ЕД в теперішній час розглядається у якості пускового механізму розвитку багатьох захворювань [215].

Серед основних факторів розвитку цієї коморбідної патології полягає гіпоксія, що призводить до порушення функціювання та структурних змін ендотеліальних клітин, призводячи до ЕД. На фоні гіпоксії відбувається потовщення інтими за рахунок гіперплазії та гіпертрофії ендотелія с порушенням ендотеліальних функцій релаксації. У ендотелії легеневих судин відбувається процес метаболізму вазоактивних речовин, насамперед ЕД-1 та NO. В умовах гіпоксії можливо також збільшення виділення ендотеліем судиннозвужуючих факторів, нарівні з зменшенням продукції вазодилятуючих речовин. Відмічаеться збільшення рівеня ЕТ-1 в артеріальній крові у хворих ХОЗЛ з гіпоксемією, на відміну від хворих на ХОЗЛ без гіпоксемії.

Оксид азоту бере участь у відтворені багатьох функцій ендотелію судин та відіграє значущу роль у підтримці гомеостазу кардіоваскулярної системи. Він відповідає за контроль тонусу артеріальних судин та рівню артеріального тиску, впливає на контрактильну функцію міокарду та збільшує діастолічну розтяжність. Недостатнє утворення та виділення NO є лідируючим механізмом виникнення та розвитку гіпертензії у малому крузі кровообігу та втратою судинами легень адекватної відповіді розширенням судин на ендотелійзалежні субстанції.

В нормі оксид азоту матаболізується до нітратів та нітритів, а його частина вступає в зв'язок з супероксид -- аніоном з подальшим утворенням пероксинітрита. Супроводжується гіпоксія зростанням вільних радикалів , також супероксид -- аніона, що призводить до руйнації NO та зменшення його концентрації. Також відомо, що гіпоксемія виступає, як одна із головних причин активізації процесів перекисного та свободнорадикального окислення, що в свою чергу й призводить до розвитку оксидативного стресу, що й може розглядатись, як зв'язуюча ланка між ХОЗЛ та ГХ. Так у багатьох дослідженнях показано, що посилення процесів прекисного окислення ліпідів може чинити вплив на модифікацію та бар'єрні властивості мембран клітин, порушуючи їх нормальне функціонування. Окислювальний стрес відіграє провідну роль в патофізіологічних процесах при ХОЗЛ, що призводить до посилення бронхіального ушкодження та як легеневої гіпертензії, так і до системних розладам кровообігу. Вторинні продукти перекисного окислення ліпідів реалізують свій ефект в організмі людини вазоконстрікцією артеріол та підвищенням загального периферичного спротиву. Це й є однією з ланок участі перекисного окислення ліпідів у виникненні та прогресуванні ГХ [216].

Отже, можна зробити висновки, що оксидативний стрес при ХОЗЛ проявляє не лише локальний характер, але й системний. Порушення балансу між прооксидантною та антиоксидантною системами у периферичній крові призводить до порушення судинної стінки та як наслідок до формування ЕД. При ХОЗЛ та ГХ виявляється ЕД спровокована оксидативним стресом з підвищеною продукцією вільних радикалів.

В теперішній час провідне місце серед сприяючих факторів розвитку не лише ХОЗЛ, але захворювань серцево -- судинної системи є паління. Дихальна система страждає першочергово, враховуючи, що вона є зоною первинного контакту впливу компонентів тютюнового диму. Паління неминуче призводить до дислипідемії та системної запальної реакції, на яке судинний ендотелій відповідає розвитком оксидативного стресу та запаленням, активацією симпатичної нервової системи та підвищення коагуляційного потенціалу плазми крові, що й призводить до розвитку та прогресуванню ХОЗЛ в поєднанні з ГХ.

В останній час приділяють все більш уваги позалегеневим проявам ХОЗЛ, що сприяють поліорганному пошкодженню, та деяких випадках й визначають прогноз для пацієнта. Загальновідомо, що в основі розвитку та прогресування ХОЗЛ полягає довготриваючий запальний процес, що впливає на усі структури легеневої тканини (бронхи, бронхіоли, альвеоли ті легеневі судини), однак локальне запалення з часом набуває системного характеру. Хронічне системне запалення розглядається як полісиндромний патологічний процес, що розвивається при системному пошкодженні та характеризується тотальною запальною реактивність ендотеліоцитів, клітинних та плазмових факторів крові, сполучної тканини, а на останніх етапах й мікроциркуляторними порушеннями в життєво важливих органах та тканинах.

Запалення дихальних шляхів являє собою комплексний процес, що починається пошкодження епітелію бронхів, порушення мікроциркуляції та в подальшому взаємодію первинних та вторинних ефекторних клітин та медіаторів. При антигенної стимуляції клітин епітелію бронхів, макрофагів та тучних клітин, що є первинними ефекторними клітинами, вивільняються медіатори, що викликають запальну реакцію. При активації вторинних ефекторних клітин -- клітин крові (еозинофілів, нейтрофілів, моноцитів) вивільняються їй клітинні продукти, які збільшують та поширюють запальну реакцію. Медіатори, що виділилися в ці фази запалення поділяються на заздалегідь вироблені, та ті, що виробляються після антигенної стимуляції, до яких відносяться лейкотрієни, простагландини та тромбоксани. Слабкий прямий вплив на гладеньку мускулатуру виявляє ЛТВ 4, але, стимулюючи циклогенацію ендогенної арахідонової кислоти та утворення тромбоксану у дихальних шляхах, викликає тривалий бронхоспазм. Він також викликає адгезію лейкоцитів до ендотелію пост капілярних вену. Переважає серед продукції легеневих тучних клітин ЛТС 4. Він реалізує свій вплив на організм людини шляхом підвищення проникності капілярів та пост капілярних вену, знижує розтяжність легень, та викликає не лише легеневу, але й системну гіпертензію.

Досі малодослідженим питанням є місце мінералів та мікронутрієнтів, зокрема, заліза, магнію, кальцію, фосфору у підтриманні судинного ендотеліального гомеостазу в нормі та патології, зокрема, в умовах кардіопульмональної патології [285].

Асоційованим із загостренням хронічного обструктивного захворювання легень виявилося підвищення сироваткового вмісту вазоактивного інтестинального пептиду понад 88 пг/мл [286, 287].

Таким чином, дисфункція ендотелію та ремоделювання судин є важливими механізмами формування і прогресування серцево-судинної та бронхолегеневої патології.

Розділ 2. Матеріали і методи дослідження

2.1 Клінічна характеристика хворих

Клінічною базою для проведення дослідження був Науково-дослідний інститут гігієни праці та професійних захворювань ХНМУ. Дане дослідження виконано впродовж 2014 -- 2017 рр. До обстеження було залучено 100 дорослих пацієнтів з заключним діагнозом хронічне обструктивне захворювання легень гр. В. У 55 осіб разом з ХОЗЛ встановлена ГХ II ст. (основна група) та у 45 хворих ХОЗЛ були визначені нормальні цифри артеріального тиску (група порівняння).

Всі пацієнти давали згоду на участь в дослідженні. Критеріями включення пацієнтів до основної групи був підтверджений діагноз ХОЗЛ гр. В згідно з критеріями GOLD -- Global Initiative for Obstructive Lung Disease (2015 р.) та наказом МОЗ України від 27.06.2013 № 555. ХОЗЛ Гр. В встановлювалась на підставі наявності спірометричного класу GOLD 1 чи GOLD 2, та/чи 0-1 загострення на рік та відсутності госпіталізації щодо загострення та ступень задишки по mMRC?2. На момент спостереження вся обстежені пацієнти на ХОЗЛ перебували у фазі ремісії. Згідно з наказом МОЗ України № 384 від 24.05.2012 залучались хворі з підтвердженим діагнозом ГХ ІІ стадії. Тобто усі обстежені мали об'єктивні ознаки ушкодження органів-мішеней без симптомів з їх боку, чи порушення функції та мали гіпертрофію лівого шлуночка за даними ЕКГ. До обстеження не залучалися хворі з супутніми захворюваннями органів дихання (туберкульоз, бронхіальна астма, пневмонія, рак та ін.).

Групу контролю склали 45 умовно здорових добровольців. Розподіл обстежених на клінічні групи представлений у таблиці 2.1.1

Усі обстежені були у віці від 39 до 68 років, що представлено у табл. 2.1.2. Середній вік хворих І групи склав 53,8±5,08 років, ІІ групи - 56,06±3,97 років, групи контролю - 53,44±6,77.

Таблиця 2.1.1 Розподіл обстежуваних за клінічними групами

Таблиця 2.1.2 Розподіл хворих основної та порівняльної груп за віковим критерієм

Як можна побачити з наведених даних, частота розвитку ХОЗЛ зростає відповідно зростанню віку пацієнтів, що й є характерним для цієї патології.

Таким чином, у віковій категорії до 45 років було виявлено 4 % хворих на ХОЗЛ, у категорії від 46 до 50 років -- 12 % хворих, 36 % пацієнтів увійшло у вікову групу 51-55 років, та найбільшу кількість хворих на ХОЗЛ було виявлено у групі пацієнтів старших за 55 років -- 48 %.

На сучасному етапі не виявлено чітких гендерних впливів на розвиток, прогресування і наслідки ХОЗЛ. У обстеженні приймали участь як чоловіки так й жінки. Загалом у досліджені брали участь 69 % чоловіків та 31 % жінок. Результати надані у таблиці 2.1.3.

У всіх обстежених виникнення ХОЗЛ було пов'язано, крім впливу комплексу факторів ризику, з високим рівнем забруднення повітря на робочому місці в минулому. Дані наведені у таблиці 2.1.4.

Таблиця 2.1.3 Розподіл хворих основної та порівняльної груп за статтю

Таблиця 2.1.4 Стажеві характеристики роботи у шкідливих умовах праці

Серед когорти досліджуваних хворих середній стаж праці у шкідливих умовах праці склав 24,6±6,91 років у основній групі та 26,7±8,46 у групі порівняння, тобто серед обстеженого контингенту переважали робітники зі стажем більше 15 років.

Тривалість ХОЗЛ у пацієнтів І групи у середньому склала 3,41±2,41 років, ІІ групи -- 2,95±2,54 років. Таким чином, тривалість анамнезу ХОЗЛ була дещо більшою у хворих основної групи. Однак, у середньому жалоби зі стороні бронхолегеневої системи з'являлися раніше встановленого діагнозу ХОЗЛ. У першій групі в середньому за 9 [7;10] роки, у групі порівняння за 7 [5;9] роки.

На гіпертонічну хворобу хворі основної групи в середньому страждали 2,23±1,52 роки. У цілому розвиток ХОЗЛ у основній групі передував розвитку гіпертонічної хвороби. У 32,7 % обстежених патологія кардіоваскулярної системи розвивалась раніше або одночасно з ХОЗЛ. Результати наведені у таблиці 2.1.5.

Таблиця 2.1.5 Розподіл хворих основної та порівняльної груп по тривалості захворювання

Оцінка статусу паління виявила, що 61 % обстежених осіб були курцями, а 39 % ? не курили, чи вже позбавилися цієї шкідливої звички. Виявилося, що серед обстежених основної групи палять 37 (67,2 %), а у групі порівняння -- 21 (46,6 %). Інтенсивність паління серед обстежених склала понад 10 пачка/років, що дозволяє нам стверджувати про паління як достовірний фактор розвитку ХОЗЛ у обстежених осіб.

У обстеженої когорти хворих було вивчено клінічні особливості хронічного обструктивного захворювання легень, що супроводжувалося кашлем, загостреннями, з'являлася задишка, яка наростала, знижувалися показники ОФВ₁ і ОФВ₁/ФЖЕЛ, знижувалася толерантність до фізичного навантаження. Результати аналізу клінічної картини у обстежених осіб представлені в табл. 2.1.6

Таблиця 2.1.6 Клінічна характеристика хворих на ХОЗЛ

Відомо, що наявність поєднаної патології взаємно обтяжують захворювання і сприяє їх прогресуванню. У обстежених хворих було не більше одного загострення на рік. Кашель відзначався у всіх хворих, у 67,2 % був сухий, переважно протягом дня (74,5 %). У більшому відсотку випадків (56,4 %) задишка виникала вже при незначному фізичному навантаженні.

Тоді, як при у хворих з ізольованим перебігом ХОЗЛ у 76,7 % випадків кашель був не продуктивний та частіше виникав в ранкові часи (61,1 %). У 62,2 % обстежених групи порівняння задишка виникала за умов звичайного фізичного навантаження.

Зіставлення груп хворих без ГХ та з супутньою гіпертонічною хворобою підтвердило думку, що поєднана патологія супроводжується більш вираженими клінічними проявами, що можна пояснити наявністю загальних патогенетичних ланок обох захворювань, наявністю асоційованих факторів, що відіграють важливу роль в перебігу і прогресуванні як ХОЗЛ, так і ГХ.

Для вивчення функціонального стану бронхолегеневої системи усім хворим було проведено спірографічне дослідження. Результати надані у таблиці 2.1.7

Таблиця 2.1.7 Дані спірографічного обстеження хворих

Доповнили клінічну картину захворювання дані спірографічного дослідження, що дозволили виділити особливості зміни швидкісних показників видиху. Так, було виявлено зниження ОФВ₁ у хворих на ізольоване ХОЗЛ у порівнянні з групою контролю (56,8±3,73 % проти 62,2±3,56 %). У співвідношенні ОФВ₁ до ФЖЄЛ були нижчі показники у основній групі (69,4±3,56 %) відносно групи порівняння. Було виявлено також зменшення показників МОШ₂₅, МОШ₅₀, МОШ₇₅ у основній групі відносно до групи порівняння (50,7±5,0, 31,4±5,9, 37,6±6,7 та 53,1±4,12, 40,5±8,4, 41,3±7,6 відповідно)_. У всіх хворих після використання тестів з бронходилятаторами було виявлено незворотну обструкцію, тобто збільшення ОФВ₁ було менш ніж 15 % від вихідної величини.

При проведенні рентгенографічного дослідження органів грудної клітки у хворих обох груп біли виявлені пневмофіброз та емфізема легень.

У основній групі хворих був встановлений діагноз гіпертонічна хвороба II стадії, на підставі анамнезу, попередньої медичної документації і висновків суміжних фахівців. В цілому середні показники систолічного та діастолічного тиску у першій групі склали 138,27±10,6 мм.рт.ст. і 84,09±6,6 мм.рт.ст. та у другій групі -- 125,11±5,98 мм.рт.ст. і 79,88±2,91 мм.рт.ст. Найчастіше у процесі обстеження хворих було виявлено такі ускладнення, як гіпертонічна ангіопатія сітківки ока -- 81,8 %, та у 49,1 % була наявна гіпертонічна дисциркуляторна енцефалопатія.

Узагальнюючи вищевикладене можна дійти висновку, що приєднання ГХ викликає ще більший зрив адаптаційних можливостей, спровокованих системною дією ХОЗЛ, та поглиблює патогенетичні процеси. Таким чином, наявність ГХ у хворих на ХОЗЛ ускладнює перебіг основної патології, що виражається у погіршенні суб'єктивного стану пацієнтів, наростанням клінічної симптоматики та погіршення спірографічних показників.

2.2 Методи дослідження

Дослідження виконувалися з інформованої згоди пацієнтів та відповідають етичним нормам відповідно діючого в Україні законодавства: Закону України «Про лікарські засоби», 1996, ст. 7, 8, 12, принципів ІСН GСP (2008 р.), наказу МОЗ України № 690 від 23.09.2009 «Про затвердження Правил проведення клінічних випробувань та експертизи матеріалів клінічних випробувань і Типового положення про комісію з питань етики», зі змінами і доповненнями.

Всім хворим були проведені стандартні методи дослідження, регламентовані протоколами надання медичних послуг, що затверджені МОЗ України, щодо обстеження хворих на хронічне обструктивне захворювання легень (визначення анамнезу хвороби, даних умов праці, оцінка об'єктивної та суб'єктивної симптоматики), лабораторні (загальний аналіз крові та біохімічний аналіз крові (Креатинфосфокіназа, б-Амілаза, Лужна фосфатаза, МВ-ізоформа креатинфосфокінази, г-Глутамілтранспептидаза, Лактатдегідрогеназа, Аспартатамінотрансфераза, Аланінамінотрансфераза), рентгенографію органів грудної клітки одноразово, функціональні (спірографія, електрокардіографія в 12 стандартних відведеннях).

Функцію зовнішнього дихання визначали за допомогою спірографічного комплексу СПІРОКОМ. Визначали загальноприйняті показники: ЖЕЛ -- життєва ємкість легень; ФЖЄЛ форсована життєва ємкість; ОФВ₁--обсяг форсованого видиху за першу сек.; ОФВ₁/ФЖЄЛ -- модифікований тест Тифно; МОС₂₅, МОС₅₀, МОС₇₅, -- швидкість повітряного потоку на рівні мілких, середніх та великих бронхів. Отримані фактичні величини співставляли з належними та визначали процент відхилення від належних величин.

Для диференційної діагностики та виключення наявності інших патологічних станів зі сторони бронхолегеневої патології хворим проводилось рентгенографічне дослідження ОГК на рентгенапараті РУМ -- 20М ури.

Ехокардіографічні показники серця визначалися за допомогою доплерехокардіографа “Siemens Sonoline -- SL450” для визначення структурно-функціональних змін з боку серця. Для визначення ремоделювання лівого шлуночку визначались наступні показники: ТМШП -- товщина міжшлуночкової перегородки в діастолу, КДР -- кінцевий діастолічний розмір лівого шлуночка, ТЗСЛШ -- товщина задньої стінки лівого шлуночка в діастолу, ВТСЛШ -- відносна товщина стінки лівого шлуночка, ІММЛШ -- індекс маси міокарда лівого шлуночка, ММЛШ (г) -- маса міокарда лівого шлуночка, зріст, вага. Розраховувались за формулами: ІММЛШ =ММЛШ (г) / площа поверхні тіла (м²), ВТСЛШ =(ТМШП + ТЗСЛШ)/ КДРЛШ. Для визначення типу ремоделювання брались такі значення: нормальна геометрія (ВТСЛШ<0,45; нормальний ІММЛШ), концентричне ремоделювання (ВТСЛШ>0,45; нормальний ІММЛШ), ексцентрична гіпертрофія (ВТСЛШ<0,45; ІММЛШ більше норми), концентрична гіпертрофія (ВТСЛШ >0,45; ІММЛШ більше норми). ВТСЛШ розраховувалась за формулою: ВТСЛШ=(ТМШП+ТЗСЛШ)/КДРЛШ

Для визначення систолічної функції визначалась фракція викиду лівого шлуночка. Систолічна функція вважалась збережено. За умов ФВ>45 %. Для визначення діастолічної функції -- ранню фазу заповнення ЛШ -- Е та передсердний компонент діастолічного заповнення ЛШ -- А. В якості основних критеріїв використовувалось ставлення Е/А. Для визначення типу діастолічної дисфункції (ДД) використовувались наступні значення: Е/А<0,8 -- порушення релаксації, Е/А =0,8-2,1 -- псевдонормальний тип та Е/А >2,1 -- рестриктивний тип.

Для виявлення систолічної дисфункції правого шлуночку використовувалися такі показники: КДП -- кінцева діастолічна площа, КСП -- кінцева систолічна площа, ФЗПС -- фракція зміни площі перерізу правого шлуночка. Розрахунок проводився за формулою: ФЗПС (%) =(КДП - КСП)/ КДП. За умов, якщо ФЗПС<30 % встановлювалась систолічна дисфункція правого шлуночка.

Для визначення діастолічної функції ПШ визначались пікова швидкість кровотоку через трикуспідальний клапан під час раннього діастолічного наповнення, що відповідає хвилі Е, та швидкість кровотоку під час скорочення передсердь -- хвиля А. З отриманих даних розраховувалось співвідношення Е/А. За нормальне значення приймалось співвідношення Е/А приблизно 1,5 (0,8 -- 2,1).

Також усім хворим вимірювали артеріальний тиск на обох руках та проводили електрокардіографію у 12 стандартних відведеннях. Отримані фактичні величини зіставляли з належними та визначали відсоток відхилення від належних величин.

Лабораторні дослідження.

Вміст метаболічних показників та активності індикаторних ферментів, заліза, магнію, фосфору та кальцію досліджували на біохімічний аналізатор «LabLine-80» фірми «Labline Diagnostics» (Австрія) з використанням наборів реагентів фірми «Cone-Lab» та «Roche» (Швеція).

Вміст дофаміну, норадреналіну, адреналіну у сироватці крові визначали спектрофлюориметричним методом після хроматографічного виділення на колонках з катіонобмінною смолою (Dowex 50Wx4, (200-400) mesh, натрієва форма, параметри колонки d=4 мм, h=75 мм). Швидкість протікання розчинів через колонки не перевищувала 1 мл/хв. Для елюїрування адреналіну та норадреналіну використовували 1 н водну соляну кислоту. Дофамин елюїрували соляною кислотою в етанолі. Кількісний вміст визначали за власною люмінісценцією на спектрофюориметрі «Hitachi MPF-4A». Для аналізу використовували наступні довжини хвилі: дофамін -- довжина хвилі збудження 330 нм, довжина хвилі люмінесценції -- 375 нм; норадреналін -- 395/485 нм; адреналін -- 554/490 нм відповідно. Як стандарти були використані наступні препарати: адреналін-гідрохлорид, дофамін-гідрохлорид, норадреналін-гідрохлорид «Reanal» (Угорщина).

Визначення ферментативної активності NO-синтаз та кількість метаболітів NO у сироватці крові визначали за допомогою реакції Гріса, що протікає одночасно з відновленням нітратів у нітрити в присутності хлорида ванадію[22]. Після депротеїнізації сироватки у лунки 96-лунного планшету розливали по 100мкл супернатанта, після чого додавали 100 мкл VCl₃ та 100 мкл реактиву Гріса. Суміш інкубувалась протягом 30 хвилин при температурі 37°С. На спектрофлюорометрі при довжині хвилі 540 нм вимірялась оптична щільність розчинів. По калібрувальній кривій знаходили кількість нітратів (NO₂) у мкмолях побудованій зі стандартним розчином NaNO₂. Лінійність зберігалась в діапазоні концентрації нітрит-іона від 5 до 230 мкМ. Це сумарні метаболіти NO. Для визначення нітрітів сироватку інкубують з реактивом Гірса без додавання VCl₃. Їх концентрація знаходилась шляхом вирахування кількості нітратів із сумарної кількості метаболітів. Для визначення активність NO-синтаз до інкубаційних середовищ №1 та №2 з наявністю контрольної проби (для кожної сироватки власна) додавали 0,3 мл сироватки та 5 % трихлороцтової кислота після чого центрифугували 10 хв. при 1500 об/хв. Додавали розчин VCl₃ та реактив Гірса. Оптичну щільність виміряли при довжині хвилі 540 нм. Розрахунок проводили за формулами: Сумарна активність NO-синтаз (NOS_сумм) =[нітритів]дослід 1 - [нітритів] контрольна проба/білок (г/л) *15; iNOS=[нітритів]дослід 2 - [нітритів] контрольна проба/білок (г/л) *15; eNOS=NOS_{сумм --} iNOS.

Визначення рівню S-нітрозотіолу у сироватці крові прозводилось спектрофотометричним методом, основаним на вимірюванні вмісту 5,5-дітіобіс(2-нітробензойної) кислоти -- продуктами окислення толових груп 5-тіо-2-нітробензойної кислоти оксидом азоту.

Визначення рівня вазоактивного інтестинального поліпептиду (ВІП) в сироватці крові пацієнтів проводили імуноферментним методом з використанням комерційної тест-системи фірми RayBio (Італія) на іммуноферментному аналізаторі «Labline-90» (Австрія). Хід визначення. У всі лунки мікропланшетів, який входить до складу набору, додавали по 100 мкл ВІП-антитіл. Мікропланшет інкубували 1,5 години при кімнатній температурі на шейкері. Потім лунки 4 рази промивали спеціальним промивним буфером і до відповідних лунок додавали по 100 мкл стандартів, контролів та досліджуваних проб. Мікропланшет знову інкубували на шейкері 2,5 години при кімнатній температурі. Потім мікропланшет промивали спеціальним буфером 4 рази і в усі лунки додавали по 100 мкл розчину HRP-стрептоведіна. Проби знову інкубували 45 хв. при кімнатній температурі і знову промивали спеціальним буфером 4 рази. Потім в кожну лунку додавали по 100 мкл ТМБ субстрату і інкубували 30 хв. при кімнатній температурі в темряві. Реакцію зупиняли додаванням в кожну лунку по 50 мкл стоп-реагенту і через 5 хв. визначали оптичну щільність проб при довжині хвилі 450 нм. Рівень VIP визначали за калібрувальним графіком, який будували паралельно з визначенням в пробах, використовуючи стандарти, що знаходяться в наборі. Кількість ВІП висловлювали в нанограммах в літрі сироватки (нг/л).