Патологічна анатомія легеневої артерії та аорти у плодів та новонароджених від матерів з ускладненою вагітністю

Відомо, що артеріальна система зазнає вікових змін. Це проявляється в нерівномірному розвитку в процесі онтогенезу, зростанні та старішанні судин. У процесі онтогенезу відмічаються регіональні та фокальні відмінності біохімічних, функціональних і морфологічних характеристик судинної стінки всіх видів артерій. Артеріальні судини великого кола кровообігу змінюються більшою мірою, ніж такі в системі ЛА [45]. Так, з віком збільшується розмір аорти, стінка її дифузно потовщується здебільшого за рахунок внутрішньої оболонки, співвідношення колагенових та еластичних волокон також стає іншим [90]. Більш за все змінюється з віком інтима, де, окрім зміни клітинного складу, відбувається ще її потовщення. Атрофічні процеси наявні в медії з роками, що проявляється у зменшенні кількості клітин на одиницю площі зрізу. Перші вікові зміни формуюються особливо в місцях відходження артеріальних гілок, там зникає внутрішня еластична мембрана. Також з віком піддається перетворенням еластичний каркас судини, він заміщується колагеновими волокнами, які не мають змоги скорочуватися після розтягування. Периметр аорти збільшується однаково рівномірно та на всіх її відділах, при цьому рівномірно зменшується периметр цієї судини від висхідного відділу до черевного в кожному віковому періоді. Еластичні волокна рік у рік стають товщими, кількість їх збільшується через розщеплення, особливо в медії. Колагенові волокна мають можливість замістити еластичні саме з причини появи ділянок для цього в результаті розщеплення [45, 53, 90, 91]. Деякі дослідники відмічають на початок формування атеросклеротичних процесів у великих артеріях вже на 10?14 роках життя людини [92].

Таким чином, процеси ембріогенезу даних судин, їх морфофункціональні особливості у плода та новонародженого за нормальних умов необхідні для виявлення і вивчення морфофункціональних особливостей ЛА та аорти у плодів і новонароджених від матерів з ПЕ та експериментальною ХВГ.

1.2 Зміна морфофункціонального стану легеневої артерії та аорти плодів і новонароджених під впливом негативних факторів перебігу вагітності та патології матері

гіпоксія новонароджений легеневий артерія

Відомо, що організм матері невід'ємно пов'язаний з організмом плода, тому здоров'я першої, перебіг її вагітності відбивається безпосередньо на стані майбутнього новонародженого [21]. Дослідження, проведені Віноградовою І.В. та співавт. (2009), доводять, що материнські фактори (соматичні захворювання та її патологічні стани під час вагітності, патологічний перебіг пологів) призводять до зростання частоти народження немовлят з екстремально низькою вагою тіла, впливають на ступінь розвитку тяжкої патології в ранньому неонатальному періоді, а також перебіг періоду адаптації новонародженого до позаутробного існування [21].

Серед факторів ризику для розвитку ПЕ є хронічний стрес, захворювання нирок, вегето-судинна дистонія, ожиріння, артеріальна гіпертензія, ПЕ при попередніх вагітностях, хронічна інтоксикація та інфекції, бронхіальна астма, захворювання щитоподібної залози, цукровий діабет, мимовільні аборти в анамнезі та запізнілий початок місячних, антифосфоліпідний і метаболічний синдроми, порушення жирового обміну, патологія нирок та ендокринопатії [6, 15, 17, 93-96, 203]. Для тяжкої ПЕ особливе значення, окрім генетичної передумови, мають вік жінки, наявність статевих інфекцій, захворювання серцево-судинної системи, рівень систолічного артеріального тиску до вагітності [7]. Сьогодні є численні свідчення про генетичну схильність ПЕ, при цьому хвороба може наслідуватися як за жіночою, так і за чоловічою лініями, достеменно невідомо материнські, ембріональні гени чи взаємодія їх продуктів призводить до розвитку цього ускладнення вагітності [7, 50, 97-103]. Деякі з дослідників висловлюють припущення щодо наявності зв'язку між розвитком ПЕ та системою HLA [98, 100], інші - прослідковують розвиток цієї патології з дисбалансом в одних і тих самих системах генів «судинної системи» та «ендотеліальної дисфункції» [99, 104, 105].

ПЕ ІІІ асоціюється з частішим оперативним розродженням та більшою крововтратою у пологах, передчасними пологами, розвитком гострої гіпоксії плода та перинатальною смертністю, низькими росто-ваговими показниками новонароджених та ускладненим респіраторним дистрес-синдромом, дихальною недостатністю, ателектазами легень, внутрішньоутробним інфікуванням у неонатальному періоді [11, 106]. Тяжка ПЕ матері є причиною розвитку в дітей неврологічних розладів (33,70 %) у формі мінімальних мозкових дисфункцій (32,30 %) та тяжких органічних церебральних порушень, у тому числі дитячого церебрального паралічу (1,40 %) [16]. Жінки, які страждали на ПЕ під час вагітності, складають групу ризику для розвитку ниркових та кардіоваскулярних захворювань, на думку деяких авторів, саме через ендотеліальну дисфункцію [46, 107, 204, 205].

За результатами дослідження Горомова А.М. и соавт. (2011) виявлено чітку закономірність та послідовність динаміки патологічного процесу при ПЕ. Так, легка її форма майже не супроводжується змінами у плодовому кровотоку, при погіршенні матково-плацентарного кровообігу, середня - призводить до зниження матково-плацентарного кровообігу зі збереженням кровопостачання життєвоважливих органів плода, за тяжкої - компенсаторні можливості плода вичерпані, оскільки периферичний спазм його судин максимальний, а діастолічний опір у термінальному судинному руслі перевищує діастолічний перфузійний тиск вагітної жінки. Кровотік у пуповинних та середньомозковій артеріях критичний, що і може стати причиною антенатальної загибелі [108].

Існує думка, що пусковими механізмами ПЕ є пошкодження ендотелію та порушення в тромбоцитарній та прокоагулянтній ланках гемостазу, що своєю чергою призводить до пошкодження ендотеліоцитів [93]. На думку Сидоровой И.С. (2000), гостре пошкодження периферичної судинної системи з вазоконстрикцією, гіповолемією, порушенням реологічних властивостей крові та гіперкоагуляцією з розвитком ДВЗ-синдрому, гіпоперфузією тканин різних органів та ішемічними їх пошкодженнями з формуванням поліорганної недостатності відіграють основну роль у патогенезі ПЕ [109, 110]. Головне місце в цьому процесі посідає функціональний стан судинного ендотелію. У відповідь на гуморальні зміни, що відбуваються навколо ендотеліоцитів, спостерігається продукція судинорозширюючих та судинозвужуючих факторів, що впливають на тонус гладких міоцитів і регулюють артеріальний тиск [111].

Згідно із сучасними уявленнями про розвиток ПЕ, виокремлюють такі теорії виникнення цього патологічного стану вагітних: ішемія плаценти, пов'язана з порушенням інвазії трофобласта, як результат - ендотеліальна дисфункція; порушення обміну та хімічна модифікація ліпопротеїдів низької та дуже низької щільності, що супроводжується їх накопиченням у кровотоці та токсичною дією на клітини; порушення імунної адаптації в системі «мати-плід»; генетична схильність. Деякі автори простежують схильність патогенетичних механізмів між ПЕ та атеросклерозом через зміни в обміні ліпідів, залучення клітин імунної системи в патологічний процес, а також дисфункцію ендотеліальних клітин [112].

За результатами клінічних досліджень щодо вивчення патогенезу ПЕ виявлено наявність взаємозв'язку між розвитком деструктивно-запального процесу та розвитком ендотеліальної дисфункції. Це представлено вираженими імунобіохімічними порушеннями, які проявляються в збільшенні синтезу прозапальних цитокінів та білку гострої фази лактоферину, рівнів умісту маркерів клітинної деструкції аутоантитіл до антигенів нативної ДНК, посиленій експресії молекул адгезії судинного ендотеліну-1 при зниженні протизапального цитокіну-4 та співвідношення прозапальних/протизапальних інтерлейкінів [113]. Це знайшло своє підтвердження і в морфологічних дослідженнях вітчизняних авторів [114]. Відповідні зміни помічено в імунному статусі новонароджених від матерів з гестозом. Збільшення вмісту імуноглобулінів класів A, M, G у пуповинній крові новонароджених корелює з тяжкістю клінічних проявів ПЕ матері. У цитокіновому статусі цих дітей за результатами дослідження пуповинної крові виявлено збільшення інтерлейкіну-1 та інтерферону-г, зниження вмісту інтерлейкіну-4 [8, 115].

За сучасними уявленнями, ендотеліальна дисфункція - дисбаланс між продукцією вазодилатуючих, ангіопротективних, антипроліферативних факторів, з одного боку, та вазоконстрикторних, протромботичних, проліферативних факторів, з іншого [39, 46, 60, 206]. Уперше термін «ендотеліальна дисфункція» був запроваджений Furchgott R.F. et Zawadzki J.V, які описали необхідність присутності клітин ендотелію для опосередкування розслаблюючої дії на гладкі міоцити [207]. Об'єднувальною патогенетичною ланкою, що є супутньою ендотеліальній дисфункції при різноманітних патологіях є окислювальний стрес [208]. Серед її маркерів виокремлюють інтерлейкіни (інтерлейкін-1, інтерлейкін-6, інтерлейкін-8), фактор некрозу пухлин-б (ФНП-б), фактор Вілленбранда, селектини, С-реактивний білок [39, 209], а також підвищення в периферичній крові рівня натрійуретичного пептиду (ЦНП), який виробляється клітинами ендотелію та реалізує свою дію лише місцево [39]. Дисбалансу між судинорозширюючими аутокоїдами (простациклін, оксид азоту) та судинозвужуючими агентами (ендотелін, тромбоксан) також відводиться велика роль серед маркерів ендотеліальної дисфункції [50]. Простежується декілька послідовних фаз розвитку ендотеліальної дисфункції: компенсація, проміжна фаза, декомпенсація. Секреторна активність клітин ендотелію підвищена у фазі компенсації за наявності зростаючих вимог до судинної системи. Надалі порушується баланс ендотеліальної секреції із зсувом продукції та інактивацією, порушенням власне бар'єрної функції ендотелію, підвищенням його проникливості для моноцитів, прозапальних цитокінів, ендотеліну-1. Фаза декомпенсації характеризується структурно-метаболічним виснаженням ендотелію, що проявляється у функціональному згасанні, гибелі та десквамації клітин, пригніченні їх регенераторних властивостей [46].

Не виникає сумнівів, що ПЕ супроводжується ендотеліальною дисфункцією [9, 46]. Клінічні дослідження вітчизняних авторів серед вагітних жінок з ПЕ з'ясували, що легка її форма супроводжується переважно функціональним порушенням ендотелію, а ось ПЕ середнього та тяжкого ступенів - деендотелізацією судин, а діагностичним методом виступає кількість десквамованих ендотеліоцитів (більше 5,0Ч104/л) [46]. При легкій формі даної патології в жінок не спостерігається змін в антикоагулянтній та фібринолітичній активності стінки судин, що свідчить про відсутність ендотеліальної дисфункції, при середній та тяжкій формах - виявлено недостатність антикоагулянтної та фібринолітичної активності стінки судини, розвивається дисфункція ендотеліальних клітин [52, 55]. В роботах зарубіжних авторів також є згадки про збільшення циркулюючих ендотеліоцитів у вагітних з ПЕ, що може бути розцінено як показник порушення ендотеліальної цілісності. Окрім цього, ендотелійзалежні прояви ПЕ, такі, як артеріальна гіпертензія, набряки та протеїнурія, мають кореляційни зв'язки з рівнем циркулюючих у крові клітин ендотелію [9]. На думку цих самих дослідників, на початкових стадіях розвитку ПЕ існує достатня кількість оксиду азоту для збереження ендотелійзалежної вазодилятації, а порушення її спостерігається при прогресуванні даної патології та артеріальній гіпертензії внаслідок зниження рівня оксиду азоту. Щодо етіологічних факторів дисфункції ендотеліальних клітин існує декілька теорій, які відмічають генетичну схильність, гемодинамічні зміни, викликані порушенням інвазії цитотрофобласту та неповною гістологічною перебудовою спіральних артерій, також плацентарну ішемію та оксидативний стрес [46, 206]. Var A. et al. (2003) виявили, що в жінок з ПЕ гіпергомоцистеїнемія, вільні радикали кисню та оксид азоту взаємодіють між собою та безпосередньо асоціюються з ендотеліальною дисфункцією [206]. За результатами досліджень Хецуриани Т. (2006), з'ясовано, що в жінок за умов наявності даного ускладнення вагітності розвивається окислювальний стрес, збільшення рівня ендотеліну-1 крові, це призводить до інтенсифікації окислювального стресу в трофобластах, пошкодження клітинних мембран ендотеліоцитів кровоносних судин, що своєю чергою поглиблює їх дисфункцію [116]. Отже, цілком зрозуміло, що в наш час ПЕ розглядається як прояв генералізованого ендотеліозу [50, 54, 117].

Загалом, виокремлюють декілька можливих етіологічних факторів для порушення функції ендотелію в жінок за умов ПЕ: накопичення в крові метильованих аналогів L-аргініну (ADMA-асиметричний диметиларгінін, ММА - імонометиларгінін), які є ендогенними інгібіторами eNOS; порушення процесів ангіогенезу та апоптозу в плаценті; оксидативний стрес, бо NO легко задіюється в патологічних реакціях з утворенням пероксинітритів, це, своєю чергою, знижує його біодоступність та сприяє старту наведених вище причин ендотеліальної дисфункції. У такий спосіб утворюється порочне коло, дефіцит NO та ураження клітин вільними радикалами є причиною посилення апоптозу в плаценті, що своєю чергою - посилює дисангіогенез [50, 118, 210]. Окрім вищезазначених чинників, велика увага приділяється ще антиендотеліальним антитілам, молекулам адгезії, цитокінам, ліпопротеїдам низької щільності, перекису ліпідів [50]. Активні кисневі радикали (NO, O2-, гідроксильний радикал (ОН), Н2О2, пероксинітрит (ONOO2-)) активують ендотеліоцити, стимулюючи продукцію вазоконстрикторів, ініціюють патологічні реакції в судинній стінці, пригнічують функції вазодилататорів (NO, простацикліну, EDHF), що продукуються ендотеліоцитами, посилюючи окислювальний стрес; стимулюють скорочення гладких міоцитів та продукцію ендотеліальними клітинами вазоконстрикторів; ініціюють окислювальне перетворення поліненасичених жирних кислот на ізопростани - молекули сімейства простагландинів, які мають вазоконстрикторний ефект завдяки індукції експресії тромбоксан-простаноїдних рецепторів на гладких міоцитах [211]. Накопичення активних кисневих радикалів, зниження активності антиокислювальної системи, підвищення продукції ендотеліну-1 сприяє зростанню окислювального стресу та порушенню функцій клітин ендотелію при гестозі [212]. У результаті досліджень Марущенко Ю.Л. (2008) з'ясовано, що середній рівень вмісту ендотеліну-1 у плазмі крові у вагітних з ПЕ в 1,7 раза перевищує такий у здорових жінок з фізіологічним перебігом вагітності. Автор наголошує на тому, що ПЕ, особливо з вираженим гіпертензивним синдромом, супроводжується системною дисфункцією ендотеліальних клітин [119]. Ступінь виразності останньої в поєднанні зі ступенем гемодинамічних порушень у системі мати-плацента-плід свідчить про тяжкість перебігу ПЕ та є прогностично негативним щодо стану плода [120].

Одним із основних патологічних чинників, що негативно впливає на організм, який розвивається, та посідає провідні позиції в патогенетичному значенні в перинатальній захворюваності та смертності є киснева недостатність в системі «мати-плід». Багато ускладнень вагітності, соматичні й інфекційні захворювання жінки, вплив шкідливих зовнішніх факторів супроводжуються синдромом кисневого голодування плода. За даними Леонова Е.В., Висмонт Ф.И. (2003), внутрішньоутробна гіпоксія та асфіксія в пологах посідають перше місце в структурі перинатальної смертності (46,60 %), а гіпоксія плода зустрічається в 4?6 % випадків. Слід зауважити, що наслідки постгіпоксичного порушення мають місце не тільки в перинатальному періоді, але й у більш пізні терміни онтогенезу [121]. Сьогодні існують численні свідчення про те, що постгіпоксичні ускладнення з боку серцево-судинної системи у новонароджених, особливо недоношених, досить часто зустрічаються (40-70 %) [20, 21, 122, 213]. Кожна третя дитина з перинатальною гіпоксією в анамнезі має залишкові явища у вигляді легеневої гіпертензії з мінімальними ознаками, клапанної недостатності, зниженні контрактильних властивостей міокарда. У структурі захворюваності новонароджених дітей, які перенесли асфіксію на фоні ХВГ, домінують дихальні, серцево-судинні порушення та внутрішньошлуночкові крововиливи гіпоксичної етіології. Близько третини (20?30 %) дітей, що зазнали впливу гострої, хронічної або поєднаної гіпоксії, є такими, що часто хворіють, серед їхньої соматичної захворюваності найбільш часто зустрічаються анемія, дисбіоз кишківника та атопічний дерматит [122, 123]. Діти з антенатальною гіпоксією в анамнезі мають затримку фізичного розвитку, зміну вісцеральних систем та біогенних амінів, морфофункціональні ураження головного мозку, серця, легенів [121, 124]. За даними Прониной О.А. (2009), ендотелін-1 є одним із маркерів ХВГ з прогностичним значенням для розвитку неврологічних порушень [123]. Заднипряный И.В. (2013) наголошує, що ефекти антенатальної гіпоксії залежать від тяжкості впливу, індивідуальної толерантності та терміну внутрішньоутробного розвитку на момент впливу цього фактору. Окрім цього, у таких умовах змінюються реологічні властивості крові, що проявляється збільшенням в'язкості та зменшенням її плинності, змінюються властивості еритроцитів [124].

Клінічне дослідження, проведене групою авторів під керівництвом Зимина Н.Н. (2010), що було присвячене впливу гострої та ХВГ плода на формування клітинного складу пуповинної крові доношених новонароджених, виявило статистично значуще збільшення кількості CD34+ клітин, еритроцитів, концентрації гемоглобіну при незмінності показників життєздатності лейкоцитів та гемопоетичних стовбурових клітин під впливом гострої гіпоксії; зниження кількості CD34+ клітин, ефективності клонування та зростання рівня спонтанного апоптозу лейкоцитів під впливом хронічної гіпоксемії [125].

Відомо, що в дітей, які зазнали впливу ХВГ, у плазмі крові спостерігається підвищення рівня ендотеліну-1 на 3?5?у добу після народження. При цьому рівень цього показника є незмінним не залежно від наявності клінічних проявів. Даний факт може свідчити про розвиток ендотеліальної дисфункції та збереженні постгіпоксичних порушень у новонародженого [123]. Окрім цього, у крові дітей, що страждали на ХВГ, знайдено достовірне збільшення NO в 1,17 раза порівняно з нормою, а активності ангіотензинперетворюючого ферменту - в 2,3 раза. Тобто NO та ангіотензинперетворюючий фермент беруть участь у патогенезі порушень кровообігу при ХВГ, а оксид азоту - ще й у компенсації зниженого кровотоку [126].

Результати експериментальних досліджень Карповой И.Ю. та співавт. (2011) довели, що ХВГ негативно впливає як на організм матері, так і на організм плода. Крім цього, цей патологічний стан особливо негативно реалізує свою дію в першому триместрі вагітності, здійснюючи вплив на кількість та масу нащадків. У першому та другому триместрах вагітності проявляється окислювальний стрес, саме тоді вільнорадикальні реакції перебувають у дисбалансі з роботою антиоксидантних захисних систем організму [127]. Одним із факторів, що включає генерацію вільних радикалів у перинатальний період, є гіпоксія, підвищене вільнорадикальне пошкодження ліпідів тканин новонароджених у перші 7 днів життя обумовлено дефіцитом антиоксидантів за наявності перинатальної гіпоксії [128].

Відомо, що хронічна гіпоксемія спричиняє значне погіршення плодового кровопостачання, зберігаючи постачання для життєвонеобхідних органів (головний мозок, серце, надниркові залози) якомога довше. Проте, коли механізм компенсації стає неефективним, швидке погіршення стану плоду стає невідворотним [214]. Також хронічна індукована гіпоксія знижує концентрацію в крові глюкози та споживання її організмом, що розвивається. За таких умов оксигенації можлива підтримка процесів окислювального метаболізму. Як результат, гіпоглікемія впливає на затримку росту плоду внаслідок змін плацентарного метаболізму [215]. Мікросудинна ішемія новонароджених як розлад мікроциркуляції в результаті перинатальної гіпоксії, відіграє важливу роль у патогенезі різноманітних захворювань [89]. Недостатність кисню є основним стимулюючим фактором для ангіогенезу за фізіологічних та патологічних умов [216, 217].

Сучасна медична наука накопичила багато клінічних робіт стосовно стану ЛА та аорти за нормальних умов [218] та при різноманітній патології [219-221].

Так, клінічні дослідження Lawlor D.A. et al. (2012) свідчать, що діти від доношеної вагітності, матері яких страждали на ПЕ, мають вищий тиск у ЛА в підлітковому віці, але такі самі показники кров'яного тиску та діаметра плечової артерії у порівнянні з контрольною віковою групою [221]. Результати робіт іноземних авторів фіксують на потовщення стінки аорти за рахунок інтими-медії у новонароджених із затримкою внутрішньоутробного розвитку [222-224].

Відомо багато робіт морфологічного та експериментального характеру щодо вивчення змін ЛА й аорти та їх структурних компонентів як у дорослих, так і у плодів та новонароджених при різних патологічних станах. Йдеться про аневризму аорти [40], атеросклеротичний процес та його ускладнення [129], зміни в аортальних клапанах при однойменній ваді серця [130], особливості будови периферичних ЛА за умов легеневої гіпертензії [225], структурні особливості аорти у нащадків від батьків-«курців» [131], особливості будови легеневого стовбура та аорти при вроджених вадах серцево-судинної системи в дітей перших 6?ти місяців життя [36], морфологічний стан ендотелію аорти плодів та новонароджених при артеріальній гіпертензії, ПЕ та цукровому діабеті матері, макросомії [34, 35] та багато інших.

За результатами досліджень Белова Ю.В. та співавт. (2013), виявлено, що патологія середньої оболонки аорти, що проявляється потоншенням, розволокненням, атрофією еластичних волокон та порушенням орієнтації еластичного каркасу, склерозом, лежить в основі розвитку аневризми цієї судини [40].

При легеневій гіпертензії в периферичних ЛА спостерігається потовщення внутрішньої еластичної мемебрани та підвищення вмісту еластину [225].

Губина-Вакулик Г.И. и соавт. (2014), у результаті експериментального дослідження на щурах, встановили наявність морфологічних змін в аорті у новонароджених нащадків від батьків-«курців», що проявлялося в максимальному потовщенні стінки судини і розвитку її еластичного каркасу при курінні матері та гальмуванні формування еластичного каркасу при тютюнопалінні батька [131].

Одним із іноземних авторів (Тодовор С.С., 2011) вивчалися питання морфологічних особливостей будови аорти та легеневого стовбура при вроджених вадах серцево-судинної системи в дітей перших шести місяців життя [36]. У результаті цих фундаментальних досліджень було знайдено низку цікавих фактів: порушення еластогенезу, для якого характерний лізис еластичних волокон та їх неповноцінність, що є загальною ознакою вроджених вад аорти та судинних мальформацій; в інтимі та медії аорти при її коарктації спостерігається гіперплазія гладком'язових клітин, міофібробластів, фібробластів із формуванням багатої на клітини м'язово-фіброзної тканини, стенозуючої просвіт; загальний артеріальний стовбур морфологічно представлений хаотично розташованими гладкими міоцитами з домінуванням епітеліоїдних клітин у медії та великою кількістю новоутворених розширених диспластичних судин з формуванням структур, схожих на кавернозні гемангіоми - у зовнішньому шарі; при транспозиції судин у загальному стовбурі ЛА відмічаються диспластичні зміни гладком'язових клітин із порушенням співвідношення веретеноподібних та епітеліоїдних елементів, фіброз і нерівномірна інфільтрація глікозаміногліканами; синдром Марфана морфологічно представлений поєднанням процесів зниження активності б-актину в гладких міоцитах та еластину в зонах розривів аорти та накопичення в проміжній речовині глікозаміногліканів і формування кіст, некрозом гладком'язових клітин з домінуванням епітеліоїдних клітин; ділянки на межі з розривами аневризм аорти при цьому самому синдромі характеризуються збільшенням кількості переважно контрактильних гладких міоцитів із підвищенням активності в них б-актину [36].

Експериментальна робота Chesler N.C. (2004) на мишах щодо вимірювання біомеханічних властивостей ізольованих ЛА при високому та низькому артеріальному тиску з подальшим гістологічним дослідженням виявила інтактну медію та адвентицію аорти, а також незначну кількісну втрату ендотеліальних клітин інтими [226].

Дослідження Пискуна Р.П и Савицькой А.А. (2009), проведені в ході експерименту на кроликах роду шиншила, з'ясували, що при експериментальному холестериновому атеросклерозі ураження аорти характеризується типовими однойменними змінами її стінки, що морфологічно проявляється в ліпідній інфільтрації інтими з формуванням атеросклеротичних бляшок [129]. На думку Ковалевой О.Н., Демиденко А.В. (2009), показник комплексу інтима-медіа відіграє ключову роль у відображенні розвитку атеросклеротичних процесів та ремоделюванні судин. Цікаво, що збільшення товщини вищезазначеного комплексу зазвичай супроводжується та пов'язано з процесами активації, проліферації та міграції гладких міоцитів, перебудовою клітинних елементів та екстрацелюлярного матриксу судинної стінки. У результаті спостерігається збільшення товщі судинної стінки, зниження еластичних властивостей артерій з розвитком жорсткості та ригідності [44]. Результати експериментальних досліджень на аортах кролів з'ясували можливість оборотних змін у судині за наявності експериментального атеросклерозу у випадку введення кріоконсервованої сироватки крові людини. Про це свідчить збільшення показника суміжності ендотеліоцитів, яке представлено кількістю сусідніх клітин, що є в контакті з даною клітиною не залежно від її геометричної форми та розмірів (від 4?х до 8?и клітин для непокоджених тканин) [132]. Окрім цього, відома роль недиференційованих гладких міоцитів інтими (їх проліферації) в патогенезі атеросклерозу [38, 227].

Чимало морфологічних досліджень присвячені впливу ХВГ на морфофункціональні особливості різних органів та систем організму, що формується. Так, Кихтенко Е.В. (2009) вже вивчено подібний вплив в гіпофізі плодів [29], Андреевым А.В. (2013) - у надниркових залозах плодів та новонароджених [28], Мирошниченко М.С. (2013) - в органах сечовидільної системи плодів та новонароджених [31], Мекенбаєвой Р.Т. (2013) - у міокарді новонароджених [30], Тянтеревой С.Г. (2007) - у венозній протоці [133].

Морфологічні дослідження Вальковича Э.И., Молчанова В.В. (1985), присвячені патоморфології коронарних судин серця плодів та новонароджених при гострій гіпоксії, виявили, що артеріальні стінки набувають неправильних контурів, мають складчасту фестончасту внутрішню еластичну мембрану, клітини ендотелію часто десвамовані та палісадоподібно розташовані відносно до стінки. В артеріях та артеріолах дітей перенесена гіпоксія призвела до гіперплазії, неправильної орієнтації та набухання ендотеліоцитів, деколи до деформації та часткового руйнування внутрішньої еластичної мембрани з появою під нею фібрил колагену та еластину, підвищення проліферативної активності гладком'язових клітин та змін їх структури з набуханням і збільшенням розмірів ядер [134].

Експериментальне дослідження іноземних авторів на щурах Wistar виявило, що хронічна пренатальна гіпоксія призводить до потовщення стінок аорти плоду й окислювального стресу в серці та судинах наприкінці вагітності [228]. Надалі, у зрілому віці, ці ефекти можуть нівелюватися, проте ХВГ детермінує функціональний дефіцит у серці та судинах периферичного кровообігу. Дослідники роблять висновок, що сучасні діти від матерів з ХВГ мають підвищену скорочувальну здатність міокарда через симпатичне домінування та NO-залежну ендотеліальну дисфункцію в периферичних резистентних судинах [229].

Відомі роботи іноземних авторів на курячих ембріонах, за результатами яких з'ясовано причетність ХВГ до формування морфологічної та функціональної основи для гіпертонії. Звуження просвіту аорти накладає підвищене навантаження на серце, у результаті чого розвивається гіпертрофія серця з подальшою дисфункцією лівого шлуночка, що підвищує активність симпатичної нервової системи [168].

Thompson J.A. et al. (2011) у своєму експерименті на ембріонах овець з моделюванням хронічної помірно важкої та тяжкої гіпоксії шляхом емболізації судин плаценти протягом 15?ти днів, починаючи з гестаційного віку 116-118 діб (тривалість гестації - 147 днів), досліджували колаген, еластин та гладкі міоцити. У результаті було виявлено, що товщина стінки аорти збільшується на 23 % у групі з помірною гіпоксією та на 33 % - з тяжкою гіпоксією. Окрім цього, наявне збільшення вмісту колагену в 5 разів та утворення неоінтими у групі з тяжкої гіпоксією. Автори висловлюють думку, що ХВГ негативно впливає на розвиток аорти плодів вівці, що проявляється в структурних аномаліях, формуванні характерної артеріальної жорсткості [167].

Як відомо, ендотелій входить до тканин, що є найбільш чутливими до впливу гіпоксії [135]. Так, при гострій гіпоксії поділ ендотеліоцитів у легеневих судинах уповільнюється, а за умов хронічної гіпоксії та експериментальної легеневої гіпертензії у щурів спостерігається посилення його проліферативної активності, як в основній ЛА так і в маленьких м'язових артеріях [230]. Посилення експресії молекул клітинної адгезії (ICAM-I, Intracellular CellAdhesion Molecule-I), секреція фактора Вілленбранда, збільшення числа клітин, що містять активовану каспазу-3 (маркер апоптозу) є проявами пошкодження та активації судинного ендотелію [136]. Експериментальні дослідження Антоновой Л.В. и соавт. (2012) з'ясували, що в ендотелії за умов посилення гіпоксії некротичні процеси домінують над апоптотичними. На думку цих вчених, даний факт пояснюється неможливістю використання енергії для процесів запрограмованої загибелі клітин за її дефіциту [137].

Експериментальне дослідження на бройлерних курах щодо визначення впливу перинатальної гіпоксії на реактивність легеневих судин у цих тварин з'ясувало, що хронічна пренатальна помірна гіпоксія спричиняє ендотеліальну дисфункцію в ЛА курчат бройлерів та прискорює розвиток легеневої гіпертензії, в патогенезі якої має значення пошкодження судинного ендотелію та/або гладких міоцитів дрібних ЛА, зниження експресії вазодилататорів (NO та простацикліну) та збільшення експресії судинозвужуючих речовин (ендотелін-1). Усе це впливає на тонус легеневих судин та сприяє їх ремоделюванню [231].

На думку Michiels C. et al. (2000), клітини ендотелію можуть по-різному себе поводити при гіпоксії залежно від її ступеня та тривалості. Так, гостра гіпоксія стимулює ендотеліцити виробляти запальні медіатори та фактори росту, підвищує адгезивні властивості нейтрофілів, а тривала гіпоксія призводить до вивільнення факторів росту, цитокінів, факторів згортання в результаті збільшенння експресії генів, що відповідають за цитокіни, фактори росту та VEGF [232].

Окрім цього, у літературі є дані, що хронічна гіпоксія спричиняє посилення продукції ендотелієм фібронектину, ламіліну, еластину, зниження синтезу протеогліканів та речовин, що інгібують ріст гладких міоцитів [138].

За даними іноземних авторів, гіпоксія стимулює колагеноутворення [233]. За таких умов фібробласти підвищують синтез колагену І типу [234]. Існують свідчення, що підвищення кількості колагену в інтимі спричиняє дефекти ендотелію і, як наслідок, агрегацію тромбоцитів [38]. За іншими даними, синтез колагену у свинячій аорті в результаті впливу гіпоксії знижується [235]. Таким чином, не всі лабораторні тварини мають однакову реакцію з боку синтезу колагену в результаті впливу гіпоксії.

Пд час вивчення метаболізму колагену та еластину у щурів при гіпоксичній легеневій гіпертензії виявлено, що в перші декілька днів після початку підвищення артеріального тиску синтез еластину та колагену збільшується (у 8 та 9 разів відповідно). На думку Poiani G.J. et al. (1990), можливий вплив механічних факторів (напруженість стінки) на метаболізм колагену та еластину в основній ЛА в умовах гіпоксичної легеневої гіпертензії [236]. Є згадки про те, що потовщення медії ЛА при неонатальній гіпоксичній легеневій гіпертензії є наслідком гіперплазії гладком'язових клітин [181].

У 1986 році Benitz W.E. et al. у дослідженнях на бичачих ембріонах і плодах виявили, що зниження напруги кисню в межах та нижче за фізіологічний діапазон не призводить до гіперплазії або гіпертрофії гладких міоцитів. Замість цього проліферація клітин зменшилася при зниженні кисневої напруги нижче за 60 мм.рт.ст. Цікаво відмітити, що в ЛА та аорті ефекти гіпоксії на проліферацію гладком'язових клітин були ідентичні - пригнічення [237].

Досі немає єдиної точки зору на результати впливу гіпоксії на гладкі міоцити. Так, за одними даними гостра гіпоксія не є стимулом для їх проліферації [238] або навіть знижує проліферативну активність цих клітин [239]. Водночас інші автори вважають, що гостра гіпоксія є ефективним стимулом для розмноження гладком'язових клітин у ЛА [240]. При цьому треба відмітити, що тяжка гіпоксія та аноксія призводять до зниження їх проліферації в ЛА [241].

Морфологічні дослідження Яльцева А.В. и соавт. (2005), присвячені змінам гладких міоцитів в медії сонних артерій при декомпенсованій серцево-судинній недостатності, виявили їх атрофічні зміни, в одній групі, та дістрофічні - в іншій групі. При цьому морфологічна картина дистрофічних змін була представлена гіперхроматозом та набуханням ядер, що своєю чергою відображало інактивацію активних ділянок транскрипції та було розцінено як патологічне явище і передвісник клітинної загибелі [139].

Експериментальне дослідження на щурах Wistar, присвячене впливу перекисю водню як клітинного метаболіту, що бере участь у патогенезі більш ніж 100 захворювань та патологічних станів, на скорочувальну активність гладком'язових клітин ЛА виявило скорочувальний ефект цієї судини за умов впливу високих концентрацій даної речовини, незважаючи на вихідну механічну напругу та стан ендотелію [140]. Відбувається взаємодія перикису водню з NO, що призводить до утворення пероксинітриту, а він має судинозвужуючу дію. Такими результатами дослідники (Носарев А.В. и соавт., 2014) частково пояснюють підвищення тиску в малому колі кровообігу при запальних реакціях, наприклад, при легеневій гіпертензії [140]. За даними досліджень інших авторів з'ясовано, що пригнічуюча дія перекису водню на скорочувальну активність гладких міоцитів аорти щура реалізується за участю мікротубул цитоскелету, а скорочення гладком'язових клітин, індукованих гіперкалієвим розчином та активованих перекисом водню, не залежать від стану цитоскелету [141].

Деякі науковці дотримуються думки, що у відповідь на вплив хронічної гіпоксії в ЛА маленького діаметра фібробласти посилюють синтез колагену І типу та еластину [242]. Співвідношення колагенів І та ІІІ типів, особливо зниження рівня останнього, має значення в розвитку аневризми аорти, за даними інших авторів. Окрім того, збільшення абсолютного вмісту колагену в аорті може бути наслідком впливу підвищенного тиску на стінку судини [183].

Нефедов В.П., Цибулькин Н.А. (2004) в результаті своїх досліджень припускають, що передумовами для виникнення судинної патології в басейні ЛА з подальшим розвитком легеневої гіпертензії слугують неспроможність сполучної тканини у поєднанні з її дезорганізацією в стінках легеневих судин [142].

Експериментальні дослідження на щурах, проведені Андреевой С.А. и Долгих В.Т. (2008), з метою встановлення структурно-функціональних змін артерій малого кола крообігу у віддалений постгеморагічний період виявили найбільш деструктивні зміни у позаорганних артеріях еластичного типу (легеневий стовбур та ЛА) та великих м'язово-еластичних внутрішньолегеневих артеріях. Це мофрологічно проявляється в колагенізації медії, деструкції та деформації її еластичних мембран, потовщенні внутрішньої еластичної мембрани, розволокнінні та потоншенні зовнішної еластинної мембрани, гіпереластозі та потовщенні і гомогенізації колагенових волокон адвентиції, а також ділянками проростання адвентиціальних колагенових волокон вглиб стінки аж до інтими. Автори відмічають значну схожість морфологічних змін артерій малого кола кровообігу за таких патологічних умов з процесами природнього старіння організму [143].

Слід зауважити, що в наукових джерелах зустрічаються повідомлення про стан судин у жінок, які страждають на ПЕ, лише поодинокі морфологічні роботи, присвячені змінам будови ЛА плодів та новонароджених, тоді як опис морфологічних особливостей цієї судини в нащадків від матерів з ПЕ зовсім відсутній. Зустрічаються публікації, що висвітлюють структурні зміни в периферичних відділах ЛА при гіпоксичному впливі, легеневій гіпертензії, натомість не знайдено інформації стосовно її позалегеневої частини. Особливості будови аорти у плодів та новонароджених вивчено за умов впливу гіпоксії та тютюнопаління батьків. Вплив ПЕ матері на аорту нащадків досліджено лише стосовно змін в ендотелії, з боку його люмінальної поверхні.

Не знайдено публікацій, присвячених порівняльним морфологічним характеристикам ЛА та аорти у плодів і новонароджених від матерів з ПЕ та за умов впливу ХВГ.

Таким чином, аналіз вітчизняної та зарубіжної літератури підтверджує актуальність проблем розвитку питань судинної патології перинатального періоду, обрана тема є актуальною і новою, оскільки в сучасній патоморфології та перинаталогії дана проблема залишається відкритою, та потребує подальших досліджень.

2. Матеріали та методи дослідження

2.1 Загальна характеристика спостережень

Для досягнення мети та вирішення завдань даної дисертаційної роботи вивчено 42 випадки аутопсій плодів і новонароджених з терміном гестації 38?42 тижні, які було одержано під час секційних досліджень, що проводилися на базі КЗОЗ «Харківський обласний клінічний перинатальний центр» з 2011 до 2012 рр. та КЗОЗ «Харківський міський перинатальний центр» з 2012 до 2015 рр. Забір секційного матеріалу проводився не пізніше 6 годин після смерті плода та новонародженого. Було використано архівний матеріал кафедри патологічної анатомії Харківського національного медичного університету, зібраний на базі патологоанатомічного відділення КЗОЗ «Харківський міський перинатальний центр» (1995-2006 роки).

Критеріями розподілу випадків на групи були відсутність або наявність у матерів ПЕ легкого, середнього та тяжкого ступенів, в основу чого покладено діагностичні критерії тяжкості ПЕ, визначені Наказом МОЗ № 676 від 31.12.2004 р. «Про затвердження клінічних протоколів з акушерської та гінекологічної допомоги». Так, вивчені випадки розподілено на групи: «ПЕ І», «ПЕ ІІ», «ПЕ ІІІ» (плоди й новонароджені від матерів, вагітність яких була ускладнена ПЕ легкого, середнього й тяжкого ступеня відповідно) та «ГП» (група порівняння: плоди й новонароджені від матерів без ПЕ за даними карт розвитку вагітності). У групу «ПЕ І» увійшло 12 спостережень, «ПЕ ІІ» - 12 спостережень, а «ПЕ ІІІ» - 5 спостережень. Групу «ГП» сформувало 13 спостережень.

Було вивчено історії вагітностей і пологів, протоколи розтинів, проаналізовано клінічні дані матерів (вік, ступінь тяжкості основного захворювання та його клінічні прояви, раніше перенесені захворювання, екстрагенітальна патологія, кількість попередніх вагітностей та їх результат, перебіг і результат останніх пологів), плодів та новонароджених (вага тіла, зріст, ваго-ростовий показник, тривалість життя, причина смерті згідно з міжнародною класифікацією хвороб і травм Х перегляду, ВООЗ, Женева).

Плоди груп «ПЕ І», «ПЕ ІІ», «ПЕ ІІІ» загинули антенатально (плід без мацерації) або інтранатально внаслідок асфіксії в результаті гострого порушення матково-плацентарного кровообігу. Новонароджені померли від постнатальної асфіксії та двобічного крововиливу в шлуночки головного мозку. Причиною смерті плодів і новонароджених групи «ГП» стала анте-, інтранатальна асфіксія внаслідок гострого порушення матково-плацентарного кровообігу та двобічний крововилив у шлуночки головного мозку.

З аналізу виключалися плоди та новонароджені з явними вродженими вадами розвитку різних органів і систем, з невизначеним гестаційним віком, з пошкодженими ЛА та аортою під час розтину. Термін гестації визначався за датою останньої менструації в матері з урахуванням даних акушерського нагляду за вагітною, її ультразвукового дослідження.

Розподіл плодів та новонароджених (аутопсійний матеріал) на досліджувані групи залежно від терміну гестації відображено в таблиці 2.1.

Таблиця 2.1. Розподіл досліджуваного секційного матеріалу на групи

Нами також було вивчено експериментальний матеріал - моделювання впливу ХВГ на розвиток органів та систем плода й новонародженого. Експериментальне дослідження полягало в тому, що вагітних самок щурів лінії WAG піддавали висотному гіпоксичному впливу, це відповідало підйому на висоту 7500 м над рівнем моря, з моменту реєстрації вагітності й до моменту розродження протягом 20 хвилин щодня в один і той же час [144]. Вагітні самиці щурів (19?21?й день вагітності) та самиці, що розродилися, виводилися з експерименту шляхом внутрішньовенного введення в вену хвоста тіопенталу натрію концентрацією 2-2,5 % розчину в дозуванні 7?10 мг на 1 кг маси тіла з подальшою декапітацією; а новонароджені щури - через 24 години після народження шляхом інгаляції під ковпаком 80 % концентрації CO2 протягом 2?3 хвилин з подальшою декапітацією.

Спосіб реалізовано на щурах лінії WAG, які мають максимально близьку до людської подібність гістоморфологічних параметрів плацентарного бар'єра. Це дозволяє екстраполювати результати досліду на людський організм з достатньою впевненістю; експерименти можна здійснювати протягом відносно нетривалого терміну, оскільки період вагітності щурів становить 21?22 дні. Крім того, щури мають максимально близький до людини тип взаємовідношень материнського й фетального кровообігу, гемохоріальний характер плацентації та дискоїдний тип плаценти одночасно. Морфофункціональна будова плаценти й плацентарного бар'єра при зовні непорівнянній різниці між організмами щура та людини дуже близькі до ідентичності. Таким чином, використання щурів як лабораторних тварин дозволило проводити екстраполяцію результатів експерименту на людський організм.

Усі вивчені експериментальні випадки було розподілено на групи: «ХВГ» (плоди та новонароджені, які зазнали впливу ХВГ), «Ке» (плоди й новонароджені від матерів з фізіологічним перебігом вагітності). У групу «ХВГ» увійшло 16 спостережень (6 плодів, 10 новонароджених), «Ке» - 18 спостережень (7 плодів, 11 новонароджених).

Розподіл експериментального матеріалу на досліджувані групи відображено в таблиці 2.2.

Таблиця 2.2. Розподіл досліджуваного експериментального матеріалу на групи

Усі маніпуляції з тваринами, а також виведення їх з експерименту відповідали вимогам нормативних документів (Європейська конвенція по захисту хребетних тварин (Страсбург, 18.03.1986 р.), директива Ради Європейського економічного товариства по захисту хребетних тварин (Страсбург, 24.11.1986 р.), закон України «Про лікарські засоби», 1996 р., ст. 7, 8, 12, керівництво ІСН GСP (2008 р.), GLР (2002 р.), відповідно до вимог та норм, типовим положенням з питань етики МОЗ України № 690 від 23.09.2009 р.).

Окрім секційного та експериментального матеріалів нами ще вивчено архівний матеріал. Джерелом для проведення аналізу архівного матеріалу стали протоколи 420 випадків розтинів плодів, які загинули в період гестації на 22?42 тижні, та 215 випадків розтинів померлих новонароджених (усього 635 спостережень), виконаних на базі міського перинатального патологоанатомічного центру спеціалізованого міського клінічного пологового будинку № 5 міста Харкова за період з 2006 по 2010 роки включно.

Під час дослідження було відібрано 56 плодів та новонароджених від матерів, вагітність яких ускладнилася ПЕ. Вони в подальшому були розділені на три групи: ПЕ легкого ступеня, ПЕ середнього ступеня, ПЕ тяжкого ступеня.

Під час обробки архівного матеріалу серед плодів і новонароджених вищезазначених груп аналізувалися такі дані: гендерні відмінності, гестаційний вік, маса та довжина тіла при народженні, індекс Кетле, тривалість життя, причини смерті; а також вік, місце проживання, гінекологічний, акушерський анамнези й екстрагенітальна патологія жінок з ПЕ.

2.2 Методи дослідження легеневої артерії та аорти

Під час проведення розтину визначали зріст та масу плодів, новонароджених, макроскопічні характеристики ЛА та аорти (еластичність стінки, колір та вид інтими, на клінічному матеріалі - середній периметр гирла судин). Макроскопічне дослідження експериментального матеріалу проводилося за допомогою лупи (Ч3, 8 діоптрій).

Для морфологічного дослідження з ЛА та аорти вирізали по одному шматочку судин у надклапанній ділянці. Шматочки тканини фіксували в 10 % розчині нейтрального формаліну, піддавали стандартній парафіновій проводці через спирти зростаючої концентрації, рідину Нікіфорова (96 % спирт і діетиловий ефір у співвідношенні 1:1), хлороформ, після чого заливали парафіном. З приготованих у такий спосіб блоків робили серійні зрізи завтовшки 4?5Ч10-6 м на Мікротомі-кріостаті МК-25.

Гістологічні й морфометричні дослідження проводили на мікроскопі Olympus Bx-41 (Японія) з використанням програм Olympus Dp-soft (Version 3:1) і Microsoft Excel 2010, а також люмінесцентному мікроскопі «Axioskop 40» (Carl Zeiss, ФРН).

Морфологічна обробка включала комплекс гістологічних, гістохімічних, імуногістохімічних, морфометричних методів. Препарати, забарвлені гематоксиліном й еозином, а також пікрофуксином за ван Гізоном, використовували для загальної оцінки стану досліджуваних тканин і морфометричного дослідження. Для виявлення й диференціювання сполучно-тканинних структур застосовували забарвлення за методом ван Гізона та Маллорі.

Усі вищезазначені гістологічні й гістохімічні методики виконувалися за схемами, наведеними в керівництвах з гістологічної та гістохімічної техніки [145, 146].

При мікроскопії описували будову ЛА та аорти, стан ендотелію, оболонок. Для характеристики цих судин оцінювали такі морфометричні параметри: відносні об'єми основних структурних компонентів, середні значення ширини та висоти ендотеліоцитів, розміри зон десквамації ендоліальних клітин у полі зору (Ч200 - клінічний матеріал, Ч1000 - експериментальний матеріал), співвідношення колагенових та еластичних волокон у стінці судини (за методом «полів» за Автанділовим Г.Г., 1990.) [147], щільність розташування гладких міоцитів у стінці судини в полі зору (Ч1000), відносна щільність світіння колагенів I, III, IV типів, маркера CD34, кількість клітин, експресуючих рецептори CD16, CD95 в полі зору (Ч600).

На поверхню зображення накладали сітку з решіткою, яка мала рівновіддалені точки (у нашому дослідженні використовувалася сітка Автанділова Г.Г. зі 100 точок), і робили диференціальний підрахунок точок, що припадають окремо на кожну структурну складову судини. Потрібної кількості підрахунків точок для оержання достовірних даних у 95 % довірчому інтервалі досягали повторним накладанням решітки на різні поля зору. У даній роботі було зроблено по три накладання в кожному досліджуваному препараті.

У кожному випадку під час підрахунку розмірів ендотеліоцитів вивчалося 10 випадково обраних полів зору, а в кожному полі зору виконували по 30 вимірювань.

Імуногістохімічне дослідження проводили двома способами: непрямим методом Кунса та непрямим стрептавідин-пероксидазним методом.

Для імуногістохімічного методу дослідження застосовували непрямий метод Кунса в модифікації Brosman M. (1979). з використанням моноклональних антитіл (МКАт) до колагенів I та ІІІ (що є в стінці артерій), IV (що входить до базальних мембран) типів виявляли їх у структурі товщі стінки судин. Колагени I, ІІІ і IV типів визначали МКАт фірми Novocastra Laboratories Ltd, UK. Адезивні властивості клітин ендотелію визначали МКАт до CD34, апоптоз клітин - МКАт до CD95, розташування макрофагів у стінці судин - МКАт до CD16 (Novocastra Laboratories Ltd, UK.). Як люмінесцентну мітку використовували Fab-2- фрагменти кролячих антитіл проти імуноглобулінів миші, мічені ФІТЦ (флуоресцеїну ізогіоціанат). Препарати вивчали в люмінесцентному мікроскопі «Axioskor 40» (Carl Zeiss, ФРН). Оптичну щільність імунофлюоресценції вимірювали за методом Губіної-Вакулик Г.І. та співавт. [148] і виражали в умовних одиницях світіння (ум. од. св.).

Непрямим імунопероксидазним методом проводили імуногістохімічне дослідження на парафінових зрізах завтовшки 5?6Ч10-6 м. Як мітку використовували фермент (пероксидаза хрону), який взаємодіє із субстратом, а як барвник ферменту - хромоген, який взаємодіє з пероксидазою. Так поетапно утворювався забарвлений кінцевий продукт реакції. Парафінові зрізи відібраних блоків наносили на спеціальні адгезивні предметні скельця SuperFrost Plus, депарафінували в спиртах та інкубували з 3 % розчином перекису водню протягом 20 хвилин (з метою блокування ендогенної активності пероксидази). Потім для проведення теплової індукції антигенного звороту (відновлення антигенних властивостей після фіксації) так званого HIER (heat induction of epitope retrieval) зрізи були розміщені в цитратному буфері з pH 6,0 і підігрівалися в автоклаві за температури +121°С 8 хвилин. Далі проводили інкубацію зрізів з первинними антитілами у вологих камерах за температури 23-25°С протягом 30 хвилин. Як первинні використовувалися МКАт до Anti-Нuman Smooth Muscle Actin («DAKO», Данія) для типування гладких міоцитів. Титр антитіл добирався індивідуально для кожного маркера з використанням у ролі розчинника спеціального розчину antibody diluent (DakoCytomation). Наступний крок - інкубація зрізів з полімерами декстранами, що містять фермент-мітку пероксидазу та вторинні антитіла (надчутлива система візуалізації UltraVision Quanlo, LabVision) у вологих камерах близько 30 хвилин за кімнатної температури. Після кожного етапу зрізи промивалися у ТРИС буфері з pH 7,4 протягом 10 хвилин. Далі для ідентифікації реакції наносився розчин хромогену ДАВ (Quanto, LabVision) під контролем мікроскопа протягом від 20 секунд до 3 хвилин, з проявом у вигляді коричневого забарвлення специфічних структур залежно від маркера (у нашому дослідженні - цитоплазматична реакція). Для ідентифікації тканинних структур зрізи додатково забарвлювали гематоксиліном Майєра протягом 1?3 хвилин. Подальша дегідратація й включення в бальзам здійснювалися згідно з поширеними методиками. Кількісні та якісні показники експресії маркерів вивчали як мінімум на 8?10 випадково обраних полях зору мікроскопа гістологічних зрізів при збільшенні Ч100, Ч200, Ч400 та Ч1000 (коли це було необхідно).