Полиморфизм генов, белковые продукты которых играют роль в развитии воспаления, при ишемическом инсульте

Размещено на http://www.allbest.ru/

1

ГБОУ ВПО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова"

Министерства здравоохранения Российской Федерации

03.01.04 - биохимия

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Полиморфизм генов, белковые продукты которых играют роль в развитии воспаления, при ишемическом инсульте

Титов Борис Васильевич

Москва 2014

Оглавление

Введение

1. Ишемический инсульт как комплексное полигенное заболевание

1.1 Этиопатогенез ишемического инсульта и факторы риска

1.2 Значение генетических факторов для развития ИИ

1.3 Поиск генов, определяющих предрасположенность к полигенным формам ИИ

1.4 Выбор генов-кандидатов и их полиморфных участков для настоящего исследования

2. Материалы и методы

2.1 Объект исследования

2.2 Использованные реактивы

2.3 Выделение геномной ДНК из периферической крови

2.4 Геномное типирование

2.5 Статистический анализ

3. Результаты и их обсуждение

3.1 Анализ ассоциации полиморфных участков исследуемых генов с развитием ИИ

3.2 Анализ ассоциации полиморфизма -174G>C гена IL6 с уровнями фибриногена и показателями тромбоцитарного гемостаза в плазме крови

3.3 Анализ ассоциации сочетаний аллелей и генотипов полиморфных участков генов CTLA4, PDE4D, IL4, TNF, LTA, IL6, IFNG, TGFB1 с использованием алгоритма APSampler

Заключение

Список использованной литературы

Введение

Актуальность проблемы. В России, как и во всем мире, острые нарушения мозгового кровообращения являются одной из важнейших медико-социальных проблем, что обусловлено их высокой долей (65-75%) в структуре заболеваемости, а также в инвалидизации и смертности населения [15]. В Российской Федерации частота инсультов составляет, по разным данным, 350-400 случаев на 100 тыс. населения [15]. Заболевание может возникнуть в любом возрасте, но наибольшая заболеваемость наблюдается у лиц в возрасте между 50 и 70 годами [15].

Инвалидизация после перенесенного инсульта занимает первое место среди всех причин первичной инвалидности. Социально-экономическая значимость этого заболевания связана еще и с тем, что среди заболевших инсультом 1/3 - люди трудоспособного возраста, а к труду возвращается не более 20% больных. Более того, увеличение частоты инсульта наблюдается за счет возрастания числа больных в работоспособном возрасте - до 64 лет [16, 28].

Сосудистые заболевания мозга занимают второе место в структуре причин общей смертности, ненамного уступая заболеваниям сердца и онкологическим заболеваниям [33, 78]. В острой стадии инсульта смертность составляет около 35%, увеличиваясь еще на 15% к концу первого года [35]. Особого беспокойства не может не вызывать тот факт, что показатели смертности от инсульта в России за последние годы повысились на 18%, достигнув 280 человек на 100 тыс. населения, хотя в других странах идет прогрессивное снижение этой цифры.

В зависимости от патоморфологических особенностей, выделяют ишемический инсульт (ИИ), или инфаркт мозга, являющийся следствием резкого ограничения притока крови к головному мозгу, геморрагический инсульт, характеризующийся кровоизлиянием в ткань мозга, подоболочечные пространства или в желудочки, а также смешанные инсульты, при которых сочетаются очаги ишемии и геморрагии. На долю ИИ в нашей стране, как и в большинстве стран мира, приходится около 80% всех случаев инсульта [17]. Настоящая работа посвящена исследованию генетической предрасположенности к ИИ.

Известно, что гибель нервной ткани и формирование инфаркта при ИИ являются результатом каскада патобиохимических и патофизиологических процессов [16, 19]. Патогенез мозговой ишемии включает большое количество факторов, таких как гипоксия, реперфузионные повреждения, а также воспалительные реакции, которые, в свою очередь, имея динамический характер, сопровождаются вовлечением различных механизмов на разных стадиях ишемического каскада и играют неоднозначную роль [18]. Большую роль в развитии ИИ играют внешние факторы, такие, например, как гиподинамия, прием алкоголя и стресс. В развитии мозговой ишемии доказана также важная роль генетических факторов, таких как носительство определенных аллелей генов, кодирующих компоненты различных физиологических систем, в том числе связанных с воспалительным ответом, и влияющих на уровень белковых продуктов. Таким образом, ИИ в большинстве случаев представляет собой комплексное (мультифакториальное) полигенное заболевание и возникает в результате действия генетических факторов в сочетании с воздействиями внешней среды.

Среди механизмов повреждения ткани мозга важную роль играют, как уже упоминалось выше, реакции воспаления. Известно, что одними из важнейших факторов воспаления являются цитокины. Было показано, что дисбаланс цитокинов и локальная воспалительная реакция в ответ на действие повреждающего фактора (травму, ишемию, кровоизлияние) приводит к повреждению нейронов, гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и нарушениям микроциркуляции. Исследования выявили дисбаланс цитокинового статуса, влияние иммунобиохимических процессов на тяжесть и клинический исход ИИ, а также неоднозначную роль при ИИ некоторых медиаторов воспаления [41, 52, 217]. Поэтому представляет интерес исследование факторов, приводящих к дисбалансу цитокинов и усилению воспалительной реакции при ИИ.

Поскольку уровень цитокинов и их функциональная активность во многом определяется генетическими факторами, в настоящей работе мы исследовали ассоциацию с ИИ полиморфизма генов, кодирующих цитокины IL6, TGFB1, IL4, TNF, IFNG и LTA. В работу были включены также гены, кодирующие антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов и фосфодиэстеразу 4D, - белки, для которых показана роль в развитии воспаления. Выявление связи между полиморфизмом того или иного конкретного гена с развитием ИИ может способствовать пониманию биологической природы заболевания и открыть новые возможности для его профилактики и лечения.

Воспаление при ИИ развивается также вследствие усиления свертывающей способности крови [262,384]. Описано влияние цитокинов на синтез фибриногена, уровень которого является одной из важных составляющих развития артериального тромбоза и повышенного риска ИИ [141]. Известно, что связывание IL-6 со своим рецептором активирует транскрипционный фактор STAT3, который передает сигнал с рецептора IL-6 в ядро, где связывается с респонсивными элементами промоторных областей всех трех генов, кодирующих субъединицы фибриногена человека [115, 384]. Исходя из сказанного, представляло несомненный интерес оценить влияние полиморфизма гена IL6 на уровень фибриногена и агрегационную активность тромбоцитов в плазме крови.

Степень разработанности темы. За последние годы было проведено немало исследований, посвященных поиску ассоциации различных полиморфных вариантов генов-кандидатов с развитием ИИ для различных этносов. В частности, такие исследования были проведены для населения России. Для русских исследовали ассоциации полиморфизма генов ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), системы гемостаза, липидного метаболизма и системы продукции оксида азота, с развитием ИИ [1, 9, 10, 30, 31, 38, 39]. Для якутской популяции были проведены исследования полиморфизма генов систем гемостаза, РААС, продукции оксида озота и липидного метаболизма, а также системы метаболизма гомоцистеина [25, 30, 294]. Эти исследования показали важность этнической гомогенности исследуемых групп больных и здоровых. Тем не менее, вопрос о генетической предрасположенности к этому заболеванию далек от своего решения. Во многом это, вероятно, связано с тем, что при выявлении генов-кандидатов, влияющих на развитие ИИ, необходимо учитывать совместный вклад большого числа генов.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является комплексный анализ возможной ассоциации носительства аллелей и генотипов однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) генов-кандидатов системы воспаления, а также их сочетаний, с развитием ИИ.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Провести геномное типирование выбранных на основе анализа литературы полиморфных участков генов-кандидатов (CTLA4, IL6, TGFB1, IL4, TNF, IFNG, LTA и PDE4D) для русских индивидов, перенесших ИИ, а также для индивидов без ИИ в анамнезе, совпадающих с больными по этнической принадлежности, полу и возрасту.

2. Провести анализ ассоциации аллелей и генотипов исследованных генов с развитием ИИ методом «случай-контроль» с использованием «стандартного» статистического анализа на основе точного критерия Фишера.

3. Оценить уровни фибриногена и показателей тромбоцитарного гемостаза в плазме крови в зависимости от носительства вариантов гена IL6.

4. Провести анализ ассоциации носительства сочетаний аллелей/генотипов («генетических ансамблей») исследованных генов с развитием ИИ с использованием программного обеспечения (ПО) APSampler.

5. Оценить гендерные и возрастные особенности ассоциации генетических маркеров с предрасположенностью к ИИ.

Научная новизна работы. Впервые у этнических русских проведен комплексный анализ, с учетом пола и возраста рассматриваемых индивидов, связи носительства аллелей, генотипов и сочетаний аллелей и генотипов полиморфных участков генов CTLA4, IL6, TGFB1, IL4, TNF, IFNG, LTA и PDE4D с развитием ИИ. Впервые показана ассоциация с развитием ИИ носительства аллелей/генотипов трех полиморфных участков поодиночке: ?174G>C гена IL6, ?509С>Т гена TGFB1 и 87C>T гена PDE4D. Показано, что ассоциации ИИ с аллелями/генотипами каждого из этих участков, выявленные при сравнении общих групп больных и контролей, наблюдаются при стратификации на две подгруппы по полу или по возрасту по крайней мере в одной из подгрупп, т.е. сохраняются на подвыборках общей выборки. Аллели или генотипы генов IL6, PDE4D и TGFB1 входят в состав ассоциированных с ИИ сочетаний, объединяясь как друг с другом, так и с аллелями других исследованных генов, из которых для IFNG и TNF тоже наблюдается воспроизведение результатов на подвыборках.

Теоретическая и практическая значимость работы. Исследования последних лет показали, что данные о связи между полиморфизмом отдельного гена и развитием полигенного заболевания способствуют пониманию биологической природы последнего. Обнаруженные в работе ассоциации аллелей и генотипов генов IL6, PDE4D и TGFB1 и развитием ИИ, с высокой долей вероятности свидетельствуют об участии кодируемых ими медиаторов воспаления в формировании патогенетических событий на различных стадиях, предшествующих ишемии. Наблюдаемый кумулятивный эффект носительства вариантов этих и некоторых других генов системы воспаления отражает полигенную природу ИИ и позволяет предполагать аддитивность вклада рассмотренных генов в предрасположенность к этому заболеванию .

Выявленные в работе одиночные аллели и генотипы, а также сочетания аллелей и генотипов, могут служить маркерами для оценки индивидуального риска развития ИИ у этнических русских. Обнаружение подобных маркеров может послужить основой в поиске новых мишеней для превентивной терапии, компенсирующей генетически обусловленные неблагоприятные особенности функционирования системы воспаления для тех лиц, у которых выявлена наследственная предрасположенность к ИИ.

Методология и методы исследования. Работа основана на сравнении частот аллелей и генотипов 11 полиморфных вариантов 8 генов-кандидатов в норме и при ИИ. Для анализа вариантов генома использовали различные современные методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ПЦР в реальном времени. Для выявления значимой связи с ИИ носительства сочетаний аллелей и/или генотипов применяли оригинальное программное обеспечение APSampler (http://code.google.com/p/apsampler/), использующее метод Монте-Карло Марковскими цепями и Байесовскую непараметрическую статистику

Положения, выносимые на защиту:

1. Наиболее значимый вклад в развитие ИИ у этнических русских вносят аллели или генотипы генов IL6, PDE4D и TGFB1.

2. Ассоциированные с ИИ сочетания представляют собой составные генетические маркеры ИИ как полигенного заболевания, в которых аллели генов IL6, PDE4D и TGFB1 присутствуют попарно и/или совместно с аллелями других исследованных генов, а именно генов IFNG, CTLA4, IL4 и TNF, носительство которых в одиночку не было значимо ассоциировано с ИИ.

3. Распределение в составе сочетаний аллелей/генотипов, выявленное в общей группе, в целом сохраняется при разделении выборок больных ИИ и контрольной группы на мужчин и женщин, тогда как между подгруппами с ранним (не старше 60 лет) и более поздним ИИ наблюдаются существенные различия.

3. Анализ ассоциации носительства аллелей и генотипов полиморфного участка -174G>C гена IL6 с уровнями фибриногена и показателями тромбоцитарного гемостаза в плазме крови показал, что выявленный вклад гена IL6 в развитие ИИ, по-видимому, не определяется влиянием его полиморфизма на синтез фибриногена.

Достоверность результатов. Результаты получены современными биохимическими и молекулярно-генетическими методами. Основные выводы работы и выносимые на защиту положения являются обоснованными и полностью соответствуют полученным результатам. Достоверность выводов подтверждается корректной статистической обработкой данных.

1. Ишемический инсульт как комплексное полигенное заболевание

1.1 Этиопатогенез ишемического инсульта и факторы риска

ИИ относится к острым нарушениям мозгового кровообращения, характеризуется стойкими менингеальными, общемозговыми и очаговыми симптомами или их сочетанием вследствие прекращения или значительного уменьшения кровоснабжения участка мозга - локальной ишемии. Определенная последовательность молекулярно-биохимических изменений в веществе мозга, вызываемая острой фокальной ишемией мозга, способна привести к тканевым нарушениям, в результате которых происходит гибель клеток (инфаркт мозга). Изменения в мозге могут носить обратимый или необратимый характер. Степень обратимости тканевых изменений на каждом этапе патологического процесса определяется уровнем снижения мозгового кровотока и его продолжительностью в сочетании с факторами, определяющими чувствительность мозга к гипоксическому повреждению. Термином «ядро инфаркта» обозначают зону необратимого повреждения, термином «ишемическая полутень» (пенумбра) -- зону ишемического поражения обратимого характера. Продолжительность существования пенумбры -- важнейший фактор, так как со временем обратимые изменения принимают необратимый характер [112].

К ИИ могут приводить различные патофизиологические механизмы, но наиболее часто его причиной становятся атеросклероз крупных сосудов (дуга аорты, магистральные артерии головы, мозговые артерии), расслоение (диссекция) сонной и реже позвоночной артерий, закупорка мозговых сосудов тромбом или эмболом, образующимися в сердце и попадающими в сосуды мозга с током крови при различных заболеваниях (ревматизм, эндокардиты, ишемическая болезнь сердца и др.).

В последние десятилетия было проведено большое количество исследований, показавших, что в большинстве случаев ИИ представляет собой мультифакториальное (комплексное) заболевание, т.е. развивается в результате многочисленных взаимодействий между генетическими факторами и факторами окружающей среды.

Факторы риска, ассоциированные с повышенной частотой развития ишемического инсульта, можно разделить на модифицируемые и немодифицируемые.

К модифицируемым факторам риска ИИ относятся:

1.Артериальная гипертензия.

Артериальная гипертензия является ведущим модифицируемым фактором риска развития ИИ. По сравнению с лицами, имеющими артериальное давление (АД) ниже 140/90 мм рт. ст., у больных с АД свыше 160/95 мм рт. ст. риск развития инсульта возрастает в 4 раза, а при АД более 200/115 мм рт. ст. - в 10 раз. Увеличение систолического АД на 10 мм рт. ст. приводит к увеличению риска развития ИИ в 1.9 раз у мужчин и в 1.7 раз у женщин [43, 381]. Следует отметить, что наблюдаются этнические различия в распространении АГ. Среди населения, проживающего на севере Европы и в странах Северной Америки, наблюдается более высокая распространенность АГ по сравнению с населением стран бассейна Средиземного моря и Японии.

Выделяют несколько основных механизмов влияния АГ на риск возникновения ИИ, среди которых следует отметить усугубление атеротромботического поражения артерий крупного калибра, дестабилизацию атеросклеротических бляшек и возникновение эмболов, формирование гипертонической микроангиопатии, истончение сосудистой стенки (формирование аневризм). Перечисленные нарушения часто развиваются параллельно. Кроме того, важной проблемой является влияние повышенного АД на морфофункциональное состояние головного мозга.

Важно отметить, что опасность развития цереброваскулярных нарушений может зависеть не только от уровня АД, но и от продолжительности течения АГ. Длительное наличие АГ запускает основные механизмы развития хронического патологического (нейродегенеративного) процесса в ткани головного мозга: хроническое воспаление, изменение проницаемости ГЭБ и аутоиммунизацию организма собственными нейроспецифическими белками с последующим вторичным аутоиммунным повреждением головного мозга, оксидантный стресс и апоптоз [188].

Одним из наиболее эффективных путей снижения риска развития инсульта является контроль АГ. Исследования показывают, что адекватное систематическое лечение АГ приводит к снижению частоты заболеваемости и смертности от инсульта на 36 - 40% [188, 310].

2. Атеросклероз.

Среди модифицируемых факторов риска ИИ важная роль принадлежит атеросклерозу [26, 53. 216, 226].Установлено, что 70% всех случаев ИИ связаны с атеросклерозом. Начальным событием в атерогенезе является эндотелиальная дисфункция. В результате потери эндотелием однородности и упорядоченности эндотелиальные клетки секретируют в интиму набор цитокинов (IL-6, IL-1, TNF), которые активируют макрофаги интимы. Активированные макрофаги в свою очередь секретируют цитокины, приводящие к дальнейшей активации эндотелия, что вызывает усиление проницаемости сосудистой стенки для атерогенных липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) [318].Накапливаясь в стенке сосуда, ЛПНП окисляются и фагоцитируются макрофагами, в результате чего образуются так называемые пенистые клетки [153]. Окисленные ЛПНП приводят к повышению синтеза молекул адгезии на эндотелии и способствуют трансмиграции моноцитов в атероматозные участки сосудистой стенки [318].

Помимо широкого спектра цитокинов, активированные макрофаги вырабатывают факторы роста, прокоагулянтные субстанции, большое количество разнообразных биологически активных липидов, а также фосфолипазу А2, которая активирует ферменты циклооксигеназу и липоксигеназу, тем самым способствуя выработке простагландина Е2 и лейкотриенов, обладающих мощным провоспалительным действием [362].

При развитии атеросклеротической бляшки в стенке сосуда характерно накопление холестерина (холестерол, ХС), связанного с липопротеинами низкой и очень низкой плотности [158, 352 366]. Однако на данный момент связь повышенного уровня ХС с развитием инсульта остается не до конца выясненной. Была обнаружена корреляция между высоким уровнем ХС в сыворотке и смертностью от ИИ у мужчин [43], однако в других исследованиях отмечалась лишь тенденция к повышению риска развития ИИ при гиперхолестерин- и гипертриглицеридемии [81, 224]. Тем не менее, установлено, что гиперлипидемия отрицательно влияет на все звенья центральной и периферической гемодинамики, а также на микроциркуляцию и транскапиллярный обмен, а, следовательно, усугубляет течение атеросклероза [35, 328].

Дополнительным фактором, повышающим риск развития ИИ при атеросклеротическом поражении сосудов, является нарушение в системе свертывания крови. Показано, что одновременное наличие атеросклеротических повреждений, особенно при повреждения капсулы атеросклеротической бляшки, и нарушения в системе свертывания (гиперфибриногенемия, гомоцистинурия и повышенный уровень антиактиватора плазминогена 1) синергически влияют на риск возникновения ИИ [240].

3. Сахарный диабет.

Одним из самых значимых факторов риска инсульта является сахарный диабет, который может увеличивать риск развития инсульта в 2-3 раза независимо от других факторов риска [297, 393].

Показано, что сахарный диабет оказывает различное влияние на риск развития инсульта у мужчин и женщин. У женщин, страдающих сахарным диабетом, риск инсульта в 2 раза выше, чем у мужчин с сахарным диабетом. У этих женщин также наблюдается более высокий риск смерти от инсульта, чем у женщин, не страдающих диабетом [373].

В развитии цереброваскулярных нарушений при диабете главную роль играет патология магистральных артерий головы: сонных и позвоночных артерий. У лиц, страдающих диабетом, стенки сонных артерий утолщены вследствие развития атеросклероза. Показано, что инсулинорезистентность ассоциирована c выраженным атеросклерозом сонных артерий, причем независимо от уровня глюкозы и инсулина в крови [329, 395].

Диабет оказывает прямое влияние на развитие атеросклероза сосудов как крупного, так и мелкого калибра. У женщин, страдающих диабетом, было показано значительное увеличение риска инсульта вследствие окклюзии крупных сосудов [307]. Диффузные изменения стенок мелких сосудов, склероз или гиалиноз стенок, значительно суживающие просвет сосудов, способствуют развитию лакунарного инсульта, а изменения в системах липидного обмена и гемостаза, сопровождающие диабет, могут приводить к атеротромботическим инсультам. Влияние этих процессов наблюдается в равной степени у мужчин и женщин [144, 200, 307, 370].

4. Мерцательная аритмия.

Мерцательная аритмия (МА) является наиболее частой причиной кардиогенной мозговой эмболии, приводящей к развитию ИИ. МА повышает риск возникновения инсульта в 3.6 раза, причем риск эмболии особенно высок в первые месяцы после начала постоянной МА [362].

Около 25% ИИ при мерцательной аритмии имеют атеротромботическую природу и сочетаются с атеросклерозом сосудов головного мозга или дуги аорты [23].

Наличие МА приводит к расширению полости левого предсердия, нарушению его сократительной функции, а отсутствие полноценной систолы предсердий и пассивное опорожнение ушка левого предсердия за счет сокращения прилежащей стенки левого желудочка приводят к замедлению кровотока в ушке левого предсердия, что способствует тромбообразованию. Основной причиной тромбообразования при МА считается активация каскадов коагуляции вследствие стагнации крови в левом предсердии с образованием красных тромбов. Факторами, ассоциированными с повышенным риском тромбоэмболии при неклапанной МА, считают возраст, левопредсердный тромб, дилатацию левого предсердия, увеличение левого желудочка, предшествующий ИМ, высокое АД. Присутствие одного из клинических факторов риска эмболии с каждым годом увеличивает риск инсульта у пациента до 7%, а наличие двух и более - до 17.6% [3, 5].

5. Курение.

Известно, что курение, наряду с другими факторами риска, играет существенную роль в развитии ИИ. При курении наблюдается уменьшение просвета, а также ослабление стенки сосудов головного мозга. Кроме того, у курильщиков часто наблюдается повышение АД и развитие атеросклероза сосудов головного мозга. Среди механизмов, посредством которых курение оказывает влияние на развитие атеросклеротического процесса, особое значение имеют: повреждение эндотелия сосудов, инфильтрация его липидами, усиление клеточной пролиферации, выделение катехоламинов и вазопрессина [50, 67, 296]. Эти процессы приводят к нарушению кровоснабжения головного мозга, что способствует развитию его функциональных нарушений.

Наблюдается зависимость степени риска инсульта от интенсивности и длительности курения: отмечено двукратное увеличение риска развития инсульта у заядлых курильщиков (более 40 сигарет в день) по сравнению с мало курящими индивидами (менее 10 сигарет) [73]. У курильщиков в целом даже при наличии в анаменезе сниженного АД отмечается более раннее развитие ИИ по сравнению с некурящими индивидами. При этом на риск развития ИИ оказывает влияние как активное, так и пассивное курение [102, 168].

Следует отметить, что бьльшую роль в развитии ИИ у курильщиков играет не кардиоэмболия, а окклюзия мелких и атеросклеротические поражения крупных сосудов. Выдвинута гипотеза, что у курильщиков медленное прогрессирующее снижение кровоснабжения и, как следствие, недостаток кислорода в тканях по причине атеросклероза могут «приучить» мозг к ишемии и снизить ущерб в случае резкой ишемии, вызванной внезапным тромбозом сосуда [61, 351]. Поэтому при курении окклюзия мелких сосудов может снижать риск кардиоэмболических инсультов и в то же время являться прогностическим маркером тяжести течения ИИ [391].

Таким образом, наличие таких признаков метаболического синдрома как нарушения углеводного и липидного обмена, АГ и уменьшение просвета сосуда являются основным патогенетическим условием возникновения локальной ишемии мозга, с последующим необратимым повреждением нервной ткани по механизмам некроза и апоптоза.

Среди немодифицируемых факторов риска основную роль играют:

1. Возраст.

В 60% случаев инсульт развивается у лиц в возрасте старше 60 лет. По данным ряда исследований, частота новых случаев инсульта увеличивается более чем в два раза в каждой следующей возрастной группе населения, отличающейся всего на 10 лет [27, 35, 194]. Следует отметить, что в последние годы происходит «омоложение» мозгового инсульта: так, наблюдается значительное увеличение распространенности инсульта в возрасте от 40 до 60 лет, причем в разных климато-географических регионах [35] Почти повсеместно выявляется тенденция к увеличению числа лиц с инсультом и преходящими нарушениями мозгового кровообращения в возрасте до 45 лет, как у мужчин, так и у женщин [21, 374]. По данным [21, 374], cреди пациентов с диагнозом ИИ 20% составляют люди в возрасте 41-50 лет и 12-14% ? люди моложе 40 лет.

2. Пол

В большинстве возрастных групп инсульт чаще развивается у мужчин, чем у женщин [22, 27, 310, 367]. При этом инсульты у женщин развиваются в среднем на 10-20 лет позднее, чем у мужчин [13]. Однако суммарное число женщин, умерших от инсульта, оказывается бьльшим [35].

3. Этническая принадлежность.

Риск развития инсульта зависит от этнической принадлежности. Действительно, частота инсульта различна у разных рас и в разных этнических группах [79, 327]. Среди европеоидов зарегистрированый уровень заболеваемости инсультом в Испании ниже, чем в Германии и Норвегии [48, 49]. Известно, что представители монголоидной расы, особенно китайцы и японцы, более подвержены инсульту, чем представители европеоидной расы, а у индивидов негроидной расы смертность от инсульта вдвое выше, чем у европеоидов [79,199, 279]. В исследовании, проведенном на популяции американских индейцев, было показано, что у них риск инсульта в возрасте после 66.5 лет значительно выше, чем у чернокожих и белых американцев в той же возрастной группе [411].

4. Семейный анамнез

Наличие инсульта в анамнезе у кого-либо из родителей увеличивает риск его развития у потомков. Если пациент в возрасте до 65 лет имел в истории болезни инсульт, риск инсульта у его потомства увеличивается в 2.79 раза (95% ДИ, 1.68- 4.66, р<0.001). Если же пациент в возрасте до 65 лет имел в истории болезни ИИ, то риск ИИ у потомства увеличивается в 3 раза (95% ДИ 1.69-5.88, р<0.001) [337]. Эти данные однозначно свидетельствуют о наличии наследственной предрасположенности к ИИ и значении генетических факторов. Влияние генетических факторов на риск развития ИИ подтверждается с помощью генеалогического, близнецового и популяционного методов. Наиболее объективным и чувствительным является близнецовый метод, при котором проводят сравнение конкордантности моно- и дизиготных близнецов или сравнение конкордантности выросших вместе или порознь монозиготных близнецов. В результате близнецовых исследований показано, что инсульт у обоих (или более) монозиготных близнецов встречается чаще по сравнению с дизиготными близнецами [131].

Анализ литературных источников, посвященных факторам риска ИИ, свидетельствует, что некоторые исследователи рассматривают совокупный вклад в развитие заболевания всего комплекса факторов, в то время как другие исследователи указывают на независимое действие некоторых из них. Тем не менее, между многими факторами риска ИИ существует взаимное влияние, поэтому их сочетание приводит к более значительному увеличению вероятности заболевания, чем простое арифметическое сложение их отдельных вероятностей [29]. Поэтому при анализе предрасположенности к ИИ очень важно учитывать именно сочетанное действие различных факторов риска, включая генетические, географические и этнические.

1.2 Значение генетических факторов для развития ИИ

В последние десятилетия было проведено большое количество исследований, посвященных молекулярно-генетическому анализу факторов риска ИИ в различных популяциях [24, 25, 31, 71, 149, 252, 266]. В ходе исследований было выявлено, что генетическая природа ИИ может быть различной. Выделяют моногенные и полигенные формы ИИ. Наиболее ярко роль генетики в развитии ИИ проявляется при моногенных формах заболевания. Хотя в совокупности на их долю приходится менее 1% от всех случаев ИИ, необходимо четко дифференцировать их от полигенных форм заболевания. Это важно как для своевременной профилактики, адекватного лечения и максимально эффективной реабилитации пациента, так и для правильной оценки риска развития повторного инсульта и дальнейшего прогноза [134, 162, 305, 369].

Этническая принадлежность играет важную роль при проведении генетических исследований, поскольку установлено, что в разных популяциях может различаться представленность того или иного аллеля (в том числе мутации), связанного с развитием заболевания. Таким образом, для проведения подобных исследований очень важен выбор этнически гомогенных популяций.

Моногенные формы ИИ

Моногенные нарушения, обуславливающие ИИ, наследуются по классическому менделевскому типу как рецессивные, аутосомно-доминантные или сцепленные с X-хромосомой признаки (таблица 1). Большинство из представленных в таблице 1 наследственных моногенных заболеваний могут служить частью системного поражения; для некоторых из них инсульт является лишь одним из клинических проявлений, как, например, при болезни Фабри, серповидноклеточной анемии, гомоцистинурии, митохондриальном синдроме MELAS. В других случаях инсульт может являться основным проявлением моногенных заболеваний, таких как CADASIL (церебральная аутосомно-доминантная артериопатия с субкортикальными инфарктами и лейкоэнцефалопатией), болезнь Мойя-Мойя и др. Характерными особенностями моногенных форм инсульта являются низкая частота встречаемости.

Таблица 1. Моногенные заболевания, приводящие к инсульту (по данным [110, 252, 309])

Заболевание	Тип наследования	Вовлеченный ген
Семейные кардиомиопатии	не установлен (возможно, сцеплен с Х-хромосомой)	Различные
Семейные дислипидемии	аутосомно-доминантный или аутосомно- рецессивный	Различные
CADASIL	аутосомно-доминантный	NOTCH3
CARASIL	аутосомно-рецессивный	HTRA1
Болезнь Фабри	сцепленный с X-хромосомой	GAL
Синдром Марфана	аутосомно-доминантный	FBN1
Синдром Элерса-Данлоса, тип IV	аутосомно-доминантный	COL3A1
Аутосомно-доминантная васкулопатия сетчатки	аутосомно-доминантный	TREX1
Эластическая псевдоксантома	аутосомно-рецессивный	ABCC6
Гомоцистинурия	аутосомно-рецессивный	MTHFR
MELAS	по материнской линии	MTTL1 в митохондриальной ДНК
Серповидно-клеточная анемия	аутосомно-рецессивный	HBB

Данные таблицы 1 показывают, насколько широк спектр мутаций и заболеваний, которые могут приводить к сходным проявлениям, в частности, к развитию инсульта. Моногенные заболевания, приводящие к инсульту, как правило, проявляются у лиц молодого возраста и в основном в форме лакунарного (микроциркуляторного) и атеротромботического, поражающего сосуды крупного калибра, инсультов.

Диагностика моногенных форм ИИ наиболее актуальна у лиц молодого и среднего возраста без признаков атеросклероза и артериальной гипертензии, особенно при наличии указаний на развитие ИИ у родственников молодого возраста.

Полигенные формы ИИ

Наиболее значимыми и распространенными на популяционном уровне являются полигенные формы ИИ, которые не подчиняются законам Менделя, как это имеет место при моногенных формах, и имеют сложный характер наследования [82].

Влияние каждого вовлеченного локуса на конкретный патофизиологический процесс может обуславливать незначительный относительный риск и вносить небольшой вклад в развитие заболевания. Варианты аллелей могут оказывать влияние на чувствительность к другим факторам риска, формирование предрасположенности индивида к конкретным подтипам ИИ, а также воздействовать на опосредующие факторы или оказывать непосредственный эффект на риск развития ИИ [130, 287]. Различные гены могут оказывать влияние на эффекты друг друга или взаимодействовать с провоцирующими развитие заболевания внешними факторами, приводя на популяционном уровне к различной пенетрантности конкретного аллеля [162]. Исходя из этого, в случае такого полигенного заболевания, как инсульт, выявление генетических детерминант является сложной задачей.

В силу этих причин некоторые исследователи изучают генетическую предрасположенность не к самому ИИ как окончательному проявлению заболевания, а к его возможным промежуточным стадиям, таким, например, как утолщение стенок каротидных артерий и гипертинтенсивные очаги в белом веществе головного мозга, которые могут предшествовать развитию заболевания [135, 319]. К промежуточным стадиям ИИ некоторые авторы относят также артериальную гипертензию и атеросклероз магистральных артерий, ранее упомянутые нами как модифицируемые факторы риска заболевания [128, 129, 131].

Такой подход имеет ряд преимуществ: во-первых, подобные состояния представляют собой промежуточные стадии в патогенезе ИИ и поэтому могут быть обусловлены полимрфизмом меньшего количества генов; во-вторых, эти состояния легко поддаются выявлению и точной оценке; в-третьих, являясь количественными признаками, они позволяют применять более мощные способы статистического анализа. Кроме того, при исследовании методом "случай-контроль" акцент на промежуточных фенотипах позволяет в значительной степени избежать недостатков при формировании контрольной группы, связанных с включением в нее недостаточно обследованных индивидов. Действительно, включение в контрольную группу индивидов по принципу отсутствия проявлений нарушений мозгового кровообращения в анамнезе не гарантирует, что у этих лиц они не появятся в короткие сроки после включения в исследование [110].

Экспериментальные модели для изучения генетики ИИ

Так как ИИ представляет собой сложное комплексное полигенное заболевание, возникает ряд серьезных трудностей для идентификации генов, определяющих риск его развития. Генетические исследования на животных моделях ИИ позволяют контролировать влияние факторов внешней среды на объект.

Наиболее широко используются в качестве модели ИИ склонные к возникновению инсульта спонтанно-гипертензивные крысы (spontaneously hypertensive stroke-prone rats, SHRSP). Данная модель была разработана в 1974 г. в Японии Okamoto et al. [406] и показала сходство патогенетических механизмов развития инсульта у SHRSP и человека. В результате полногеномного поиска, проведённого на F2-гибридах SHRSP и инсульт-резистентных спонтанно-гипертензивных крыс (SHRSR), выявили так называемые локусы количественных признаков (quantitative trait locus, QTL), связанные с количественными показателями фенотипических признаков, использующихся для оценки риска возникновения инсульта, например, с уровнем артериального давления. Установлено, что QTL на 1-ой хромосоме локализован вблизи гена, кодирующего адреномедуллин, а на 5-ой - рядом с генами предсердного и мозгового натрийуретических факторов (ANP и BNP, соответственно). В дальнейших работах вклад полиморфных участков гена ANP в риск развития инсульта был подтвержден у F2-гибридов, для других указанных генов подобных данных получено не было [323]. В исследованиях на F2-гибридах SHRSP и нормотензивных крысах линии Wistar-Kyoto [184, 191] были идентифицированы QTL на 4-ой и 5-ой хромосомах.

Главной проблемой подобного моделирования заболеваний человека на животных остается соотнесение выявленных у животных локусов с соответствующими участками генома человека. Успех был достигнут только в соотнесении QTL на 5-ой хромосоме крысы с областью хромосомы человека 1p35-36. В этой области расположены гены, кодирующие ANP и метилентетрагидрофолатредуктазу (MTHFR).

Безусловно, эти исследования помогли в понимании механизма развития ИИ, а также в определении генов-кандидатов для генетических исследований у людей.

1.3 Поиск генов, определяющих предрасположенность к полигенным формам ИИ

До начала 2000-х годов для идентификации генов, определяющих предрасположенность к инсульту как комплексному заболеванию, использовали два основных подхода: метод «ген-кандидат» (функциональное картирование) и полный геномный поиск (позиционное картирование, сканирование), основанный на анализе сцепления с анонимными генетическими маркерами с известной хромосомной локализацией, распределенными по геному.

При наиболее распространенном подходе «ген-кандидат» предположение о возможном участии гена выдвигается исходя из участия его белкового продукта в этиопатогенезе заболевания (путь от фенотипа к гену). Далее проводится анализ его ассоциации (реже - сцепления) с заболеванием. Об ассоциации судят исходя из сравнения частот аллелей гена или генетического маркера в группах больных и здоровых индивидов из одной популяции. При обнаружении статистически значимых различий данный генетический маркер считается ассоциированным с болезнью. Однако, исследователи не должны упускать из рассмотрения возможность, что наряду с прямой связью между исследованным локусом и наследственной патологией в основе ассоциации может лежать неравновесие по сцеплению между маркерным локусом и локусом болезни, если эти локусы расположены достаточно близко друг от друга [134].

При полном геномном поиске, основанном на анализе сцепления с анонимными генетическими маркерами, после локализации областей, вовлеченных в развитие заболевания, проводят в них поиск генов, ассоциированных с заболеванием (путь от генома к гену). Анализ сцепления проводится в семьях с несколькими пораженными членами и основан на наблюдении, что тот или иной полиморфный вариант (аллель или гаплотип) участка ДНК, связанного с заболеванием, встречается у пораженных заболеванием членов семьи с более высокой вероятностью, чем случайная. В отличие от ассоциации, сцепление прямо доказывает роль гена (маркера) в предрасположенности к заболеванию, однако этот метод является менее чувствительным. Выявляемые в результате анализа сцепления вовлеченные участки достаточно протяженны и могут включать сотни различных генов, а сила сцепления может быть недостаточной в случае, когда генетические варианты оказывают незначительный эффект или когда они часто встречаются в популяции. Данный анализ эффективен для моногенных нарушений, приводящих к инсульту и наследующихся по классическому менделевскому типу (например, в случае CADASIL). Что касается выявления участков, вовлеченных в формирование предрасположенности к полигенному инсульту, то, в дополнение к приведенным выше недостаткам, часто не представляется возможным проводить семейные исследования с привлечением родственников и трудно составлять выборки семей с несколькими пораженными индивидами [265, 397]. Другие проблемы при использовании данного подхода связаны с обусловленной различиями в этиологии и патогенезе клинической гетерогенностью (гетерогенность фенотипов) заболевания, а также с генетической гетерогенностью, когда один и тот же фенотип заболевания может возникать в результате мутаций в различных генах.

В результате полногеномного поиска, основанного на анализе сцепления, было обнаружено два локуса, участвующих в формировании восприимчивости к инсульту, один из них, картированный на хромосоме 5q12 у человека, называется STRK1. Дальнейший анализ выявил ассоциацию полиморфных участков этого локуса с инсультом, причем наибольший вклад вносили аллели и гаплотипы полиморфных участков в гене, кодирующем фосфодиэстеразу 4D (PDE4D) [70, 149, 350]. Предполагается, что PDE4D играет важную роль в патогенезе инсульта за счет участия в воспалении, формировании физиологического ответа на повреждение сосудов и ангиогенезе.

Другой обнаруженный локус расположен на хромосоме 13q12-13. В этом участке находится ген ALOX5AP, который кодирует белок, активирующий 5-липоксигеназу (ALOX5AP). Этот фермент участвует в лейкотриеновом пути и может быть вовлечен в развитие инсульта за счет активации воспалительных процессов и/или через увеличение проницаемости сосудов и ускорения развития атеросклероза [166]. Известно, что экспрессия участников данного пути, таких как ALOX5AP и его мишени - 5-липоксигеназы (ALOX5), увеличивается в атеросклеротических бляшках на различных стадиях их развития [166]. В то же время, данные об ассоциации полиморфизмов гена ALOX5AP с риском развития острого инсульта противоречивы. В исследовании Helgadottir et al. [166, 239] были выявлены полиморфные варианты гена ALOX5AP, которые ассоциированы с повышенным риском развития инсульта. В другом исследовании на выборке из Центральной Европы также была обнаружена ассоциация гена ALOX5AP с ИИ [239]. Однако, в двух последующих исследованиях, проведенных в США на популяции европейского происхождения, не удалось подтвердить эти данные [264, 410]. Исследование на русской популяции также не выявило достоверных ассоциаций между однонуклеотидными полиморфизмами в гене ALOX5AP и острым инсультом [9].

Подход «ген-кандидат» имеет бульшую статистическую мощность в сравнении с анализом сцепления, так как наследование выявляемых аллелей рассматривается на уровне популяции, и нет необходимости составлять большие семейные выборки. Однако, он требует предварительного целевого выбора анализируемых генов-кандидатов, а также дополнительных доказательств того, что наблюдаемые различия частот аллелей между больными и здоровыми индивидами не являются случайными, а действительно обусловлены ассоциацией с заболеванием. При данном подходе проводится анализ распределения у больных и здоровых таких полиморфных вариантов генома, как однонуклеотидные замены (single nucleotide polymorphisms, или SNP), инсерционно-делеционные мутации, вариации числа копий отдельных участков генома (размером от 1 000 п.н. и более) (copy number variation, CNV), тандемные повторы различной длины (мини- и микросателлиты). Крайне важен правильный выбор функционально значимого полиморфного участка исследуемого гена, что в большинстве случаев представляет определенные сложности.

Гены, принимающие участие в развитии ИИ, можно разделить на основе их функциональной связи с патофизиологией ИИ и отнести к пяти основным группам по названию систем, компоненты которых данные гены кодируют. Это гены системы липидного и гомоцистеинового метаболизма, гемостаза, продукции оксида азота, ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) и воспаления.

Гены системы липидного метаболизма

Большое значение в этиологии ИИ могут играть гены системы липидного метаболизма, поскольку патологические изменения в регуляции липидного профиля плазмы крови являются ключевым моментом в развитии атеросклероза и таким образом лежат в основе большинства случаев инсульта. В качестве одних из главных генов-кандидатов рассматривают гены

Аполипопротеин Е (АроЕ) представляет собой гликопротеид, играющий существенную роль в процессах активации некоторых липолитических ферментов (липазы печени, липазы липопротеинов и лецитин-холестерин ацилтрансферазы) и в регуляции распределения и транспорта холестерина от глиальных клеток мозга до нейронов. Выявлен двадцать один полиморфный участок в гене APOE, в том числе мультиаллельный локус в 4-ом экзоне (полиморфизм эпсилон-apoE), который определяется сочетанием двух однонуклеотидных замен в положениях 3937T>C и 4075C>T внутри четвертого экзона гена [85]. Аллели эпсилон-полиморфизма называются эпсилон-2 (2), эпсилон-3 (3) и эпсилон-4 (4) и кодируют три изоформы белка АроЕ (Е2, Е3 и Е4). Данные изоформы различаются аминокислотными остатками в положениях Cys112Arg и Arg158Cys, находящимися в участке связывания apoE с соответствующими рецепторами.

Аллель е3 кодирует нормальную изоформу белка, для которой в европейской популяции не было выявлено ассоциации с повышенным риском развития сердечно-сосудистых заболеваний. Частота аллеля е3 в Европейской популяции составляет 70-80% [292].

Наличие в геноме человека аллель АPOЕ е2 связан со сниженными уровнями холестерина, триглицеридов и бета-липополипротеинов в сыворотке крови [104, 246], что может приводить к снижению риска развития атеросклеротических изменений и возникновения ИИ. Действительно, в популяции европеоидов показано протективное действие аллеля е2 при формировании предрасположенности к ИИ, однако, у представителей монголоидной популяции, по данным [125 , 208], он ассоциирован с ИИ.

Носительство аллеля е4 ассоциировано с повышенным уровнем триглицеридов и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) [87, 345]. Однако, в европейской популяции вовлеченность данного аллеля в предрасположенность к ИИ остается спорной. Несмотря на наблюдавшуюся ассоциацию аллеля е4 с повышенным уровнем холестерина, ЛПНП и риском сердечно-сосудистых заболеваний и ИИ [63, 66, 353], в результате последующих исследований не было выявлено явной связи между аллелем и инсультом, хотяи была показана роль повышенной концентрации холестерина в плазме как фактора риска инсульта [346]. Более того, выявлена ассоциация между уровнем ApoE и смертностью в пожилом возрасте от сердечно-сосудистых заболеваний независимо от генотипа индивида и уровня липидов в плазме [271, 380]. В то же время, исследования в китайской популяции продемонстрировали потенциальную ассоциацию полимрфизма APOE е2/е3/е4 с риском ИИ и артериальной гипертензией [74].

Среди работ, посвященных поиску связи гена АРОЕ с риском развития ИИ, представляют интерес исследования двух полиморфных областей этого гена: участков биаллельного полиморфизма -491А>Т и -472T>С в промоторной области, влияющих на уровень продукции белка. Согласно исследованию [294], у больных ИИ мужчин-якутов была выявлена достоверно меньшая частота аллеля АРОЕ*-427С и генотипа АРОЕ*-427Т/С, оказывающих протективное действие, и достоверно большая частота аллеля АРОЕ*-427Т и генотипа АРОЕ*-427Т/Т, предрасполагающих к развитию ИИ. Для атеротромботического типа инсульта сохранялись все перечисленные выше ассоциации, а также была выявлена ассоциация с риском развития ИИ полиморфного участка -491А>Т, что может свидетельствовать о генетических различиях между атеротромботической и другими формами инфаркта мозга [294]. У русских больных ИИ в возрастной группе до 60 лет аллель АРОЕ*-427Т также оказался ассоциированным с риском развития заболевания [31].

Другим ключевым ферментом метаболизма липидов является липопротеинлипаза (LPL). Она играет важную роль в формировании липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), гидролизе триглицеридов плазмы до диглицеридов и участвует во взаимодействии липопротеинов с клеточными рецепторами [273]. В гене LPL выявлено несколько полиморфных участков, причем аллели некоторых из них критичны для ферментативной активности.

Полиморфизм 495T>G располагается в восьмом интроне гена LPL и ассоциирован с повышением концентрации триглицеридов, участвующих в процессе атерогенеза и повышающих риск развития инсульта. При исследовании якутской популяции у женщин была выявлена позитивная ассоциация аллеля LPL*495G полиморфизма 495T>G и негативная ассоциация аллеля LPL*495T с риском развития инсульта [294].

Наибольшее значение придается однонуклеотидному полиморфизму 1595С>G, который расположен в 9-ом экзоне LPL. В случае аллеля LPL*1595G происходит замена кодона 447Ser на стоп-кодон, вследствие чего LPL становится короче на две С-концевые аминокислоты: серин и глицин. При укороченном LPL увеличивается уровень липопротеинов высокой плотности, что может привести к ослаблению процессов атерогенеза. Была показана негативная ассоциация аллеля LPL*1595G данного полиморфного участка с ИИ [278, 343, 401, 415].

Ген eNOS системы продукции оксида азота

Исследования системы продукции оксида азота (NO) свидетельствуют о важной роли эндотелиальной синтазы NO, кодируемой геном eNOS (или NOS), в развитии повышенной чувствительности мозга к ишемии и в формировании очага повреждения при развитии инсульта. Оксид азота оказывает влияние на тонус, целостность, рост и тромбогенные свойства кровеносных сосудов, играет важную роль в развитии артериальной гипертензии. В результате снижения мозгового кровотока и дефицита кислорода в митохондриях снижается скорость аэробного окисления, что приводит к снижению соотношения АТФ/АДФ+АМФ и активации фосфофруктокиназы (ФФК) и как следствие к активации анаэробного гликолитического пути.

Гликолиз в анаэробных условиях ведёт к образованию молочной кислоты (лактата). Усиленное освобождение лактата при гипоксии, в условиях недостаточного кровообращения, приводит к метаболическому лактатацидозу и дефициту АТФ; а дефицит энергии в свою очередь - к нарушению калий-натриевого градиента. В результате клетки утрачивают ионы калия, а вне клеток возникает его избыток. Важнейшим из прямых последствий повреждения калий-натриевого насоса является проникновение в клетку избытка натрия, стимулирующего гипергидратацию и церебральный отек. Затем происходит выброс глутамата с развитием глутаматной "эксайтотоксичности". Возбуждение глутаматных NMDA-рецепторов активирует Са2+-каналы, что приводит к усилению поступления внеклеточного кальция в клетку и высвобождению внутриклеточного кальция из депо, что активизирует различные ферментные системы. Образующиеся при этом продукты перекисного окисления липидов тормозят активность натрий/калиевой аминотрансферазной ферментной системы, усугубляя изменения энергозависимого ионного транспорта, а также ингибируют фермент глутаминсинтетазу в астроглии, нарушая метаболизм глутамата и способствуя его накоплению в синаптической щели. Все эти процессы приводят к быстрому входу ионов кальция и натрия в нейрон, что усугубляет все реакции глутамат-кальциевого каскада, а также обусловливает активацию NO-синтазы и тем самым к избыточной продукции радикала NO-. В результате создаются условия для образования пероксинитрита (ONOO-), что стимулирует генерацию гидроксил-радикалов и способствует нитрированию тирозиновых остатков белков, а также инактивирует фермент супероксиддисмутазу и вызывает углубление свободнорадикального окисления, приводящего к гибели клетки. Кроме того, пероксинитрит способен тормозить тирозинкиназу, входящую в активный центр нейротрофических факторов, увеличивая степень недостаточности трофического обеспечения мозга [20, 32, 42, 103, 231]. Таким образом, в условиях церебральной ишемии перевозбуждение глутаматных рецепторов и избыточная продукция NO приводят к усилению процессов свободнорадикального окисления, вызывающих гибель клетки [190, 407].

...