Полиморфизм генов, белковые продукты которых играют роль в развитии воспаления, при ишемическом инсульте

Известно, что интерферон гамма способен подавлять синтез коллагена гладкомышечными клетками и увеличивать синтез металлопротеиназ макрофагами. Высказывалось предположение, что этот цитокин активно участвует в атерогенезе, в частности, в реорганизации матрикса атеросклеротической бляшки [228].

Таблица 13. Частоты аллелей и носительства аллелей и генотипов полиморфного участка 874A>T гена IFNG у лиц русской этнической принадлежности при сравнении общей группы больных, перенесших ИИ, c контрольной группой той же этнической принадлежности (А) и больных, получивших ИИ в возрасте ? 60 лет и >60 лет, в сравнении c контрольными группами тех же возрастных категорий (Б).

Известно также, что полиморфизм участка 874A>T гена IFNG влияет на уровень продукции этого цитокина, причем носительство аллеля IFNG*874T коррелирует с высоким уровнем продукции IFNг [120, 300, 339, 378]. Следовательно, выявленная нами ассоциация аллеля IFNG*874T с ИИ может определяться ролью интерферона гамма в патогенетических событиях, приводящих к ИИ. Данных в литературе об ассоциации аллелей SNP 874A>T гена IFNG с ИИ мы не нашли.

Сводные данные по индивидуальным аллелям риска, выявленным нами при различных типах сравнения больных ИИ и индивидов контрольной группы (общие группы, только мужчины, только женщины, отдельно лица не старше 60 лет и лица старше 60 лет), представлены в таблице 14.

Таблица 14. Индивидуальные аллели риска, выявленные при сравнении больных ИИ и индивидов контрольной группы: общих групп, только мужчин, только женщин, отдельно лиц не старше 60 лет и лиц старше 60 лет

Примечание: «+» показывает, при каком типе сравнения больных ИИ с индивидами контрольной группы выявлен аллель риска.

При сравнении общей группы больных и контрольной группы показана ассоциация с ИИ генов IL6, PDE4D и TGFB1. При этом аллель IL6*?174G - единственный из всех - был выявлен как аллель риска не только в общей группе, но и при разбиении как по полу (у женщин), так и возрасту (у лиц старше 60 лет). Аллель PDE4D*41G оказался аллелем риска только в подгруппе лиц не старше 60 лет, а аллель PDE4D*87С - только в общей группе. Что касается гена TGFB1, то в общей группе была выявлена ассоциация ИИ с аллелем TGFB1*?509Т, а при разделении по полу - с аллелем TGFB1*915G у мужчин. Для гена IFNG наблюдали ассоциацию с ИИ только в подгруппе лиц старше 60 лет. Таким образом, выводы об ассоциации генов IL6, PDE4D и TGFB1 (но не IFNG) с ИИ воспроизведены при использовании в ходе нашего исследования сравнений разного типа.

При разделении больных ИИ и индивидов контрольной группы по полу ассоциации достигали уровня значимости только в одной из гендерных групп в двух случаях (для аллеля IL6*?174G у женщин и TGFB1*915G у мужчин), причем для полиморфизма TGFB1 915G>C в общей группе, несмотря на увеличение выборки, значимых различий не наблюдалось (см. таблицу 14). Подобные различия в ассоциации с ИИ у мужчин и женщин были выявлены в различных исследованиях в различных популяциях [159, 167, 227, 234, 253, 280, 364]. Эти результаты могут быть интерпретированы как следствие различий в проявлении генетической предрасположенности к ИИ у мужчин и женщин и объясняться гормональными различиями полов [312]. Известно, что для женщин характерно более позднее развитие ИИ, что может быть обусловлено способностью эстрогенов поддерживать в оптимальных значениях концентрацию липидов и влиянием эстрогенов на макрофаги, дендритные клетки и клетки эндотелия с дальнейшим повышением пролиферации, снижении адгезии, понижением уровня перекисного окисления и воспаления [174, 283].

Для всех анализированных генов, кроме TGFB1, факторы риска по-разному проявлялись в разных возрастных группах (см. таблицу 14). Аллели IL6*?174G и IFNG*874T были ассоциированы с развитием ИИ у лиц старше 60 лет, а аллель PDE4D*41A - в более «молодой» подгруппе. Эти результаты совпадают с данными, полученными для ИИ в других исследованиях [90, 114, 196, 266, 277, 400]. Они могут объясняться тем, что механизмы ишемического поражения мозга различаются у людей пожилого и молодого возраста [4], причем в отличии от пожилого возраста, когда основными факторами риска являются атеросклероз и гиперхолестеринемия, у лиц среднего возраста основную роль играет АГ [65].

3.2 Анализ ассоциации полиморфизма -174G>C гена IL6 с уровнями фибриногена и показателями тромбоцитарного гемостаза в плазме крови

Исходя из данных, что аллельный полиморфизм гена IL6 влияет на уровень продукта [386], а IL-6 регулирует синтез фибриногена [115], мы провели сравнение уровня фибриногена у носителей различных вариантов полиморфного участка ?174G>C гена IL6. Анализ проводили в объединенной группе из 127 человек, независимо от их статуса больной ИИ/здоровый. Сравнение по критерию Манна-Уитни не выявило значимых различий в концентрациях фибриногена в плазме крови у носителей различных аллелей и генотипов полиморфного участка ?174G>C (рис.1). Не наблюдали также значимых отличий уровня фибриногена у носителей аллеля IL6*?174G (в гомо- или гетерозиготном состоянии, генотипы IL6*?174G/G + IL6*?174C/G) и аллеля IL6*?174C (генотипы IL6*?174C/C + IL6*?174C/G) от неносителей этих аллелей.

Рисунок 1. Сравнение концентраций фибриногена в плазме крови носителей различных аллелей и генотипов полиморфного участка ?174G>C гена IL6 среди 127 индивидов (независимо от статуса больной/здоровый)

Анализ для той же группы агрегации тромбоцитов под воздействием адреналина (% изменения оптической плотности), размера тромбоцитарных агрегатов (мм) и скорости агрегации тромбоцитов (?б) также не выявил значимых различий между сравниваемыми группами (таблица 15).

Таблица 15. Агрегация тромбоцитов у носителей различных аллелей и генотипов полиморфного участка ?174G>C гена IL6 среди 127 индивидов (независимо от статуса больной/здоровый)

Примечание: А тр - агрегация тромбоцитов под воздействием адреналина, D тр - размер тромбоцитарных агрегатов, ?б - скорость агрегации тромбоцитов

3.3 Анализ ассоциации сочетаний аллелей и генотипов полиморфных участков генов CTLA4, PDE4D, IL4, TNF, LTA, IL6, IFNG, TGFB1 с использованием алгоритма APSampler

В настоящей работе с помощью динамического метода Монте-Карло с использованием программного обеспечения APSampler [122, 422], обладающего высокой статистической мощностью анализа [247], был проведен анализ совместного вклада в предрасположенность к ИИ возможных сочетаний аллелей или генотипов исследуемых генов. Анализ проводили как на полных выборках больных ИИ и индивидов контрольной группы, так и в подгруппах, сформированных по половому и гендерному признакам: только мужчин, только женщин, отдельно лиц не старше 60 лет и лиц старше 60 лет.

Ассоциации с ИИ, выявленные на полных выборках больных ИИ и индивидов контрольной группы, приведены в таблице 16. Обнаружены сочетания из двух и трех аллелей/генотипов различных генов, частота носительства которых значимо (р<0.01, 95% ДИ для ОШ не пересекает 1), различается у больных ИИ и в контрольной группе. Эти сочетания отвечают критерию минимального множества аллелей как фактора генетического риска [123]. Под этим понимается, что любой входящий в сочетание аллель/генотип характеризуется меньшей значимостью ассоциации, чем сочетание, а добавление к сочетанию каких-либо дополнительных аллелей не увеличивает значимости его ассоциации с заболеванием (т.е. не уменьшает величины р). Аллели/генотипы полиморфных участков ?174G>C гена IL6, 87C>T и 41G>A гена PDE4D и ?509С>Т гена TGFB1, поодиночке значимо ассоциированные с ИИ при сравнении общих групп (см. раздел 3.1), выявлены в составе таких сочетаний с аллелями/генотипами других генов, носительство которых в одиночку при таком сравнении не было значимо ассоциировано с ИИ. Это гены IFNG, CTLA4, IL4 и TNF. Кроме того, в состав ассоциированных с ИИ сочетаний вошел еще один полиморфный участок гена TGFB1 - 915G>C. С риском развития ИИ наиболее сильно ассоциировано сочетание IL6*?174G + TGFB1*915G/G (р=0.0003, ОШ=2.44, 95% ДИ: 1.47-4.02). Два других предрасполагающих сочетания несут аллель PDE4D*87С. Это сочетания PDE4D*87С + TGFB1*?509Т/Т (р=0.004, ОШ=4.16, 95% ДИ: 1.4-12.4) и PDE4D*87С + TGFB1*915G/G (р=0.01, ОШ=1.7, 95% ДИ: 1.1-2.6). Большая часть выявленных сочетаний, чаще встречающихся в контрольной группе и таким образом отрицательно ассоциированных с ИИ (ОШ<1), несет генотип IL6*?174C/C или аллель - TGFB1*?509С.

Как видно из таблицы 16, наиболее значимыми протективными сочетаниями являются IL6*?174C/C + IFNG*874A (р=0.0002, ОШ=0.23, 95% ДИ: 0.10-0.52) и IL6*?174C/C + TNF*?308G (р=0.0008, ОШ=0.3, 95% ДИ: 0.16-0.63). Сочетания, содержащие аллель TGFB1*?509С, имеют несколько большую величину р (от 0.0011 до 0.0078) и, следовательно, менее выраженное протективное действие.

Таблица 16. Ассоциация сочетаний аллелей и генотипов полиморфных участков исследованных генов при сравнении больных ИИ и индивидов контрольной группы (общие группы)

Жирным шрифтом выделены аллели/генотипы и сочетания с ОШ>1.

Это биаллельные сочетания TGFB1*?509С + IL6*?174C/C (р=0.0011, ОШ=0.31, 95% ДИ: 0.15-0.64) и TGFB1*?509С + PDE4D*41G (р=0.002, ОШ=0.36, 95% ДИ: 0.17-0.73) и триаллельные сочетания TGFB1*?509С + TNF*?308G + IL4*?590C (р=0.0061, ОШ=0.43, 95% ДИ: 0.22-0.82) и TGFB1*?509С + IL4*?590C + CTLA4*49A (р=0.0078, ОШ=0.55, 95% ДИ: 0.35-0.88).

Таким образом, комплексный анализ позволил выявить кумулятивный эффект SNP ряда генов на развитие ИИ. При этом полиморфные участки ?174G>C гена IL6, ?509С>Т гена TGFB1 и 87C>T гена PDE4D, ассоциированные с ИИ поодиночке, вносят более весомый вклад в генетическую предрасположенность к ИИ. Полиморфные локусы других исследованных генов, выявленные только в составе сочетаний, вносят более слабый вклад. Во всех случаях, когда в составе различных сочетаний выявляются оба аллеля однонуклеотидного полиморфизма (SNP), соблюдается закономерность: аллель, входящий в протективное сочетание, является альтернативным для аллеля из предрасполагающего сочетания. Выявленные сочетания представляют собой составные генетические маркеры ИИ как полигенного заболевания.

Данные, полученные при разделении выборки больных ИИ и контрольной группы по гендерному признаку с последующим комплексным анализом (таблица 17) выявили в подгруппах и мужчин, и женщин только биаллельные сочетания и обладают некоторыми отличиями от общей группы.

У мужчин (таблица 17А) в сочетания входят аллели или генотипы SNP TGFB1*915 C>G (ассоциирован с ИИ у мужчин поодиночке, см. раздел 3.1) и TGFB1*?509C>T, а также полиморфные участки генов IL6, PDE4D и TNF. В целом, в состав ассоциированных с ИИ сочетаний входят 5 полиморфных участков 3 генов, все из которых были выявлены при сравнении общих групп больных ИИ и здоровых. Наиболее значимо у мужчин позитивно ассоциировано с ИИ сочетание IL6*?174G + TGFB1*915G/G (р=0.00025, ОШ=3.425, 95% ДИ: 1.75-6.8), выявленное и в общей группе как самое значимое предрасполагающее сочетание. Также наблюдаются предрасполагающие сочетания PDE4D*41A + PDE4D*87C (р=0.008, ОШ=2.73, 95% ДИ: 1.22-6.10) и IL6*?174G/G + PDE4D*41A (р=0.02, ОШ=4.8, 95% ДИ: 1.06-21.80). У них с развитием ИИ отрицательно ассоциировано носительство сочетаний: TGFB1*915С + TNF*?308G (p=0.00075, ОШ=0.25, 95% ДИ: 0.11-0.57) и PDE4D*41G + TGFB1*?509C (p=0.023, ОШ=0.38, 95% ДИ: 0.15-0.94).

У женщин (таблица 17Б) в сочетания входят аллели или генотипы SNP IL6*?174G>C (ассоциирован с ИИ у женщин поодиночке, см. раздел 3.1), оба полиморфных участка гена PDE4D, SNP TGFB1*915G>C, IFNG*874A>T и LTA*252G>A. Всего в состав ассоциированных с ИИ сочетаний у них входят 6 полиморфных участков 5 генов, 4 из которых были выявлены при сравнении общих групп больных ИИ и здоровых. Особый интерес представляет появление в составе предрасполагающего сочетания аллеля LTA*252G гена LTA, который не был выявлен при сравнении общих групп. Наиболее значимо позитивно ассоциировано с ИИ у женщин IL6*?174G + TGFB1*915G (р=0.001, ОШ=4.6, 95% ДИ: 1.56-13.5), сходное с наблюдаемым у мужчин и в общей группе. Выявлены также другие биаллельные предрасполагающие сочетания, несущие тот же аллель IL6*?174G в сочетании с PDE4D*87С (р=0.01, ОШ=2.36, 95% ДИ: 1.18-4.72) и с IFNG*874Т (р=0.017, ОШ=2.22, 95% ДИ: 1.11-4.44), а также сочетание LTA*252G + PDE4D*41A (р=0.013, ОШ=5.63, 95% ДИ: 1.21-26.2). У женщин выявлено также протективное для общей выборки сочетание IL6*?174C/C + IFNG*874A (р=0.001, ОШ=0.11, 95% ДИ: 0.02-0.51).

В целом, распределение в составе сочетаний аллелей/генотипов, выявленное в общей группе, сохраняется и при разделении выборки на мужчин и женщин. Так, присутствие аллелей SNP?174G>C гена IL6, 41G>A и 87C>T гена PDE4D в составе сочетаний наблюдается во всех трех группах, ?308A>G гена TNF - в общей группе и у мужчин, 874A>T гена IFNG - в общей группе и у женщин. SNP TGFB1*?509С>Т и/или TGFB1*915G>C в составе сочетаний ассоциированы с ИИ и в общей группе, и после разделения по гендерному признаку, хотя вклад разных полиморфных участков оказывается различным; это согласуется с представлением об отсутствии жесткого сцепления между этими SNP (см. выше).

Таблица 17. Ассоциация ИИ с носительством сочетаний аллелей и генотипов SNP исследованных генов в подгруппах, сформированных по гендерному признаку А. Мужчины

Жирным шрифтом выделены аллели/генотипы и сочетания с ОШ>1

Б. Женщины

Жирным шрифтом выделены аллели/генотипы и сочетания с ОШ>1

В то же время, SNP ?590C>T гена IL4 и 49A>G гена CTLA4 входят в состав сочетаний, ассоциированных с ИИ, только в общей группе, а 252А>G гена LTA - только у женщин. Наблюдаемые различия могут быть связаны с уменьшением размера выборок при разделении общей группы по полу, но это объяснение вряд ли подходит для полиморфизма гена LTA.

Данные, полученные при разделении выборки больных ИИ и контрольной группы в зависимости от возраста с последующим комплексным анализом (таблица 18) выявили, что аллели/генотипы полиморфного участка ?174G>C гена IL6 входят практически во все предрасполагающие и протективные сочетания, ассоциированные с ИИ в возрастной группе старше 60 лет (таблица 18А).

Комплексный анализ выявил у них следующие предрасполагающие к ИИ сочетания: IL6*?174G + TGFB1*915G (р=0.00088, ОШ=4.18, 95% ДИ: 1.75-9.95) и IL6*?174G + IFNG*874T (р=0.0036, ОШ=2.36, 95% ДИ: 1.3-4.3), причем первое сочетание выявлялось также в общей группе, а второе сочетание было выявлено у женщин. Таким образом, носительство этих сочетаний может рассматриваться как фактор риска ИИ. Как и в общей группе, наиболее мощным протективным сочетанием являлось сочетание IL6*?174C/C + IFNG*874A (р=0.00036, ОШ=0.17, 95% ДИ: 0.06-0.48). У лиц старше 60 лет также была выявлена отрицательная ассоциация с ИИ сочетаний IL6*?174C/C + TGFB1*?509T (р=0.00085, ОШ=0.13, 95% ДИ: 0.03-0.48) и IFNG*874A/А + TGFB1*869G (р=0.004, ОШ=0.37, 95% ДИ: 0.19-0.74), что касается последнего сочетания, то ни в общей группе, ни при разделении по гендерному признаку не была выявлена ассоциация с ИИ полиморфного участка TGFB1 869T>C. Также стоит отметить, что генотип TGFB1*?509T/Т был ассоциирован в общей группе с развитием ИИ как один (см. раздел 3.1), так и в составе сочетания. Таким образом, у лиц старше 60 лет наибольшее значение в развитии ИИ играют полиморфизм ?174G>C гена IL6, как и в общей группе, и полиморфизм 874A>T гена IFNG. У лиц с ранним ИИ (моложе или равном 60 лет) (таблица 18Б), в отличие от общей группы, мы не

Таблица 18. Ассоциация ИИ с носительством сочетаний аллелей и генотипов SNP исследованных генов в разных возрастных группах

Жирным шрифтом выделены аллели/генотипы и сочетания с ОШ>1

Лица в возрасте не старше 60 лет

Жирным шрифтом выделены аллели/генотипы и сочетания с ОШ>1наблюдали ассоциированных с ИИ сочетаний, включающих аллели или генотипы полиморфного участка ?174G>C гена IL6.

Основной вклад в предрасположенность к ИИ у лиц данного возраста по нашим данным вносят полиморфизмы 41G>A и 87C>T гена PDE4D и ?509С>Т гена TGFB1. С риском развития ИИ ассоциированы сочетания: PDE4D*41А+ PDE4D*87С (р=0.008, ОШ=3.57, 95% ДИ: 1.31-9.72) и PDE4D*87С + TGFB1*?509T/T (р=0.014, ОШ=9.35, 95% ДИ: 1.14-77.03). Ассоциация сочетания PDE4D*41А + PDE4D*87С с ИИ наблюдалась также у мужчин, а сочетание PDE4D*87С + TGFB1*?509T/T было ассоциировано с развитием ИИ в общей группе. Протективными для развития ИИ в подгруппе ?60 лет является сочетание PDE4D*41G/G + TGFB1*?509C(р=0.002, ОШ=0.30, 95% ДИ: 0.14-0.66). В общей группе мы наблюдали протективное сочетание PDE4D*41G + TGFB1*?509C (р=0.002, ОШ=0.36, 95% ДИ: 0.17-0.73).

Как и в случае разделения больных и контролей по полу, при их разделении по возрасту сохраняются некоторые закономерности распределения отдельных аллелей/генотипов в составе сочетаний, обнаруженные в общей группе. SNP ?174G>C гена IL6, ?509С>Т и 915G>C гена TGFB1 и 874A>T гена IFNG входят в состав ассоциированных с ИИ сочетаний как в общей группе, так и в подгруппе старше 60 лет, а 41G>A и 87C>T гена PDE4D и 915G>C гена TGFB1 - в общей группе и в подгруппе до 60 лет включительно. При этом SNP ?590C>T гена IL4, 49A>G гена CTLA4 и ?308A>G гена TNF выявлены в составе ассоциированных с ИИ сочетаний только в общей группе. Интересно, что первые два SNP не входили в состав составных маркеров и в подгруппах мужчин и женщин.

Обращают на себя внимание существенные различия в распределении SNP, входящих в состав сочетаний, ассоциированных с ранним и более поздним ИИ. Если в возрастной группе ?60 лет включительно с ИИ ассоциированы сочетания, несущие аллели SNP 41G>A и 87C>T гена PDE4D, а также 509С>Т гена TGFB1, то в группе старше 60 это оказались аллели SNP ?174G>C гена IL6, 509С>Т, 869T>C и 915G>C гена TGFB1 и 874A>T гена IFNG. Единственный SNP, входящий в состав сочетаний, ассоциированных с развитием ИИ в обеих возрастных группах - это ?509С>Т гена TGFB1, однако при этом аллель TGFB1*?509Т входит в состав разнонаправлено ассоциированных сочетаний.

Следует отметить, что при разделении больных ИИ и контрольной группы по полу и возрасту, как и в общей группе, соблюдается закономерность: аллель полиморфного участка, входящий в протективное сочетание, является альтернативным для аллеля из предрасполагающего сочетания.

В целом, анализ совместного вклада в предрасположенность к ИИ сочетаний аллелей или генотипов исследуемых генов позволил увеличить число генов, влияющих на восприимчивость к ИИ, с 4 до 8. Действительно, если объединить результаты всех проведенных сравнений, ассоциация ИИ с аллелями генов IL6, PDE4D, TGFB1 и IFNG была показана как поодиночке (см. таблицу 14), так и в составе сочетаний, тогда как аллели генов CTLA4, IL4, TNF и LTA были ассоциированы с ИИ только в составе сочетаний. При этом важно отметить, что из последних только в случае гена LTA его аллель LTA*252G входил в состав предрасполагающих сочетаний, а аллели остальных генов были компонентами протективных сочетаний.

В таблице 19 представлены сводные данные об аллелях риска, выявленных нами в составе сочетаний при различных типах сравнения больных ИИ и индивидов контрольной группы (общие группы, только мужчины, только женщины, отдельно лица не старше 60 лет и лица старше 60 лет). Данные этой таблицы полностью подтверждают выводы об индивидуальных аллелях риска, которые были сделаны для аналогичных групп сравнения (см. таблицу 14). Более того, они свидетельствуют о повышении мощности анализа при использовании комплексного подхода, основанного на анализе сочетаний генов. Действительно, ряд аллелей выявлен в сравниваемых подгруппах в составе значимых предрасполагающих сочетаний (выделены жирным), тогда как при анализе поодиночке для них не был достигнут уровень значимости. Особое положение в этой таблице занимает аллель риска LTA*252G, который был выявлен только в составе сочетания при комплексном анализе в подгруппе женщин.

Таблица 19. Аллели риска, выявленные в составе сочетаний при сравнении больных ИИ и индивидов контрольной группы: общих групп, только мужчин, только женщин, отдельно лиц не старше 60 лет и лиц старше 60 лет

Примечание: «+» показывает, при каком типе сравнения больных ИИ и индивидов контрольной группы выявлен аллель риска. Без выделения цветом показаны аллели риска, которые были выявлены также поодиночке (представлены в таблице 14), цветом выделены аллели риска, выявленные только в составе сочетаний.

В целом, проведенный нами комплексный анализ показал, что аллель IL6*?174G и генотип IL6*?174G/G полиморфизма ?174G>C гена IL6 вносят существенный вклад в наследственную предрасположенность к ИИ во всех подгруппах, кроме лиц не старше 60 лет. Наши данные о значимости этого аллеля/генотипа совпадают с результатами [127, 192, 372], полученными для европеоидов. Полиморфизм ?174G>C влияет на продукцию IL6. Показана ассоциация носительства генотипа IL6*-174G/G с более высоким, а аллеля IL6*-174C - с более низким уровнем IL-6 в плазме крови [126, 386], однако в ряде аналогичных работ различия не достигали уровня значимости. Известно, что повышение продукции IL-6 вызывает нарушение взаимодействия гладкомышечных клеток в стенке сосуда с клетками иммунной системы, что в конечном итоге приводит к усилению атерогенеза [242]. Кроме того, IL-6 обладает нейротрофическим действием при церебральной ишемии [356].

В результате проведенного комплексного анализа нами были выявлены позитивные и негативные ассоциации с ИИ обоих исследованных полиморфных участков гена PDE4D в составе сочетаний - в общей группе и во всех подгруппах, кроме лиц старше 60 лет. Ранее позитивные ассоциации однонуклеотидных полиморфизмов в гене PDE4D с инсультом были показаны на выборках из неевропейских стран [69, 84, 277]. Выявленная в этих исследованиях роль гена PDE4D в формировании риска развития ИИ носила самостоятельный характер и не зависела от таких факторов риска как возраст и пол [72, 239, 264, 409]. Данные о позитивной ассоциации с аллелем PDE4D*41A были получены ранее в исследовании на несколько иной выборке - у больных острым инсультом из московской популяции [10].

Комплексный анализ выявил существенный вклад в развитие ИИ генотипа риска TGFB1*?509T/T в общей группе и в подгруппе лиц не старше 60 лет; соответственно, аллель TGFB1*?509С был обнаружен во многих протективных сочетаниях. Подобная ассоциация наблюдалась в голландской [344] и китайской [295] популяциях. Как было сказано выше, носительство генотипа TGFB1*?509T/T ассоциировано с более высоким содержанием триглицеридов в плазме крови [295] и может способствовать росту атеротромботической бляшки, что в свою очередь может приводить к сужению просвета сосудов и развитию ишемических процессов. Также был выявлен вклад в развитие ИИ и предрасполагающая роль генотипа TGFB1*915G/G в подгруппе мужчин, также данный генотип входил в состав сочетаний с аллелями полиморфных участков ?174G>C гена IL6 и 87C>T гена PDE4D общей группы. Кроме того, в сочетании с аллелем IL6*-174G, генотип TGFB1*915G/G играл предрасполагающую роль у мужчин и у лиц старше 60 лет, а аллель TGFB1*915G был положительно ассоциирован с ИИ у женщин, соответсвенно, аллель TGFB1*915C в сочетании TNF*?308G был негативно ассоциирован с ИИ у мужчин. Полученные данные соответствуют результатам исследования на китайской популяции, где показана ассоциация генотипа TGFB1*915G/G с мерцательной аритмией, являющейся одним из факторов ИИ [390]. Что касается полиморфного участка 869C>Т, то его аллелей мы не наблюдали в составе предрасполагающих сочетаний ни в общей группе, ни при разделении по гендерному признаку. Однако, аллель TGFB1*869C входил в состав протективного сочетания с IFNG*874А/А у лиц, получивших инсульт в возрасте старше 60 лет, что согласуется с данными исследования китайской популяции [295].

Мы наблюдали, что аллель IFNG*874T входит в состав предрасполагающих к развитию ИИ сочетаний как в группе старше 60 лет, так и у женщин, а в качестве индивидуального аллеля риска был выявлен для индивидов старше 60 лет. Вовлечение в формирование предрасположенности к ИИ участка IFNG*874A>T, по-видимому, выявлено нами впервые: в опубликованной литературе мы не нашли других работ, посвященных анализу связи с ИИ этого полиморфного участка. Однако, по мнению некоторых исследователей у пациентов с артериальной гипертензией 3 степени (АГ III), перенесших ИИ, совместно с выработкой IL-6 наблюдалась гиперсекреция IFNг, и данная комбинация является наиболее опасной для развития воспалительных процессов [14]. Из указанных выше данных о влянии аллелей на уровень продукции IFNг [182, 301], можно предположить, что носительство аллеля IFNG*874T усиливает в бляшке синтез коллагена, что приводит к увеличению ее размера.

Проведенный комплексный анализ не выявил позитивной ассоциации носительства того или иного аллеля/генотипа SNP ? 308A>G гена TNF с развитием ИИ, однако, нами была обнаружена негативная ассоциация с ИИ данного полиморфного участка в составе протективных сочетаний в общей группе и в подгруппе мужчин. Обнаруженная нами негативная ассоциация аллеля TNF*?308G согласуется с данными, полученными для греческой популяции [254], но не для венгерской популяции, где была показана протективная роль аллеля TNF*?308A [160]. Этот вопрос нуждается в дальнейшем исследовании.

Мы наблюдали также присутствие аллеля IL4*?590C в общей группе в составе протективных сочетаний с аллелями и генотипами полиморфных участков других генов. Как уже указывалось, в литературе мы не обнаружили аналогичных данных; при этом в исследовании на греческой популяции была выявлена роль альтернативного IL4*?589T аллеля с рецидивами инсульта [255].

Мы не обнаружили в составе сочетаний, ассоциированных с ИИ, полиморфного участка 252A>G гена LTA c ИИ ни в общей группе, ни в обеих возрастных группах, что, впрочем, согласуется с данными ряда других работ, например, для немецкой и японской популяций [136, 155]. В то же время, в иследовании на венгерской популяции было показано, что аллель LTA*252G служит фактором риска для развития ИИ [358]. С этим заключением согласуются полученные нами данные об ассоциации аллеля LTA*252G в составе сочетания с риском развития ИИ у женщин.

Заключение

В целом, результаты, полученные при анализе 11 полиморфных участков 8 генов, свидетельствуют о том, что наиболее значимый вклад в развитие ИИ у этнических русских вносят гены IL6, PDE4D и TGFB1, белковые продукты которых участвуют в формировании патогенетических событий на различных стадиях, предшествующих ишемии (Ларина Н.В. с соавт. 2012). Проведенный анализ ассоциации полиморфного участка -174G>C гена IL6 с уровнями фибриногена и показателями тромбоцитарного гемостаза в плазме крови не выявил значимых различий. При сравнении общих групп больных и контролей аллели или генотипы полиморфных участков этих генов являются индивидуальными факторами риска. Ассоциации с SNP каждого из них наблюдаются и при стратификации сравниваемых групп на подгруппы по полу или по возрасту, причем каждая из этих ассоциаций сохраняется по крайней мере в одной из подгрупп.

Аллели или генотипы генов IL6, PDE4D и TGFB1 входят в состав ассоциированных с ИИ сочетаний из двух и трех аллелей/генотипов различных генов. Выявленные при сравнении общих групп больных ИИ и контролей сочетания представляют собой составные генетические маркеры ИИ как полигенного заболевания, в которых аллели названных генов присутствуют попарно и/или совместно с аллелями других исследованных генов, а именно генов IFNG, CTLA4, IL4 и TNF, носительство которых в одиночку не было значимо ассоциировано с ИИ. Ассоциация ИИ с выявленными сочетаниями характеризуется бульшим уровнем значимости, чем с одиночными аллелями. Распределение в составе сочетаний аллелей/генотипов, выявленное в общей группе, в целом сохраняется при разделении выборок на мужчин и женщин, однако у женщин обнаружен новый компонент предрасполагающего сочетания - аллель LTA*252G. При их разделении больных ИИ и контрольной группы на подгруппы по возрасту наблюдаются существенные различия в распределении SNPs, входящих в состав сочетаний, ассоциированных с ранним (не старше 60 лет) и более поздним ИИ.

Полученные данные позволяют предполагать аддитивность вклада рассмотренных генов в предрасположенность к ИИ. По нашим данным, наибольшее прогностическое значение из изученных SNPs имеет анализ полиморфизмов ?174G>C гена IL6, 87C>T гена PDE4D и ?509С>Т гена TGFB1, а также анализ их сочетаний. Так, носительство сочетания аллеля PDE4D*87C с генотипом TGFB1*?509Т/T увеличивает риск развития ИИ более чем в 4 раза, а в возрасте ?60 лет ? более чем в 9 раз.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о важной роли воспаления при ИИ, а выявленные в работе одиночные и составные маркеры могут в дальнейшем послужить маркерами для определения индивидуального риска развития ИИ.

1. Сравнительный анализ частот аллелей, частот носительства аллелей и генотипов полиморфных участков генов CTLA4, IL6, TGFB1, IL4, TNF, IFNG, LTA и PDE4D у больных ИИ и здоровых индивидов, русских по этнической принадлежности, выявил значимые позитивные ассоциации с развитием ИИ носительства аллелей IL6*-174G и PDE4D*87C и генотипа TGFВ1*?509T/T. Частоты аллелей, носительства аллелей и генотипов полиморфных участков 41G>A гена PDE4D, 49A>G гена CTLA4, ?590C>T гена IL4, ?308A>G гена TNF, 252G>A гена LTA, 874A>T гена IFNG, 869T>C и 915G>C гена TGFB1 при этом значимо не отличались.

2. При разделении группы больных ИИ и контрольной группы по гендерному признаку наблюдали значимую позитивную ассоциацию с ИИ частоты носительства аллеля IL6*-174G у женщин и генотипа TGFB1*915G/G у мужчин. При разделении больных ИИ на две группы по возрасту (лица, перенесшие ИИ в возрасте старше 60 лет и в возрасте моложе или равном 60 лет) и их сравнении с лицами контрольной группы тех же возрастных категорий у лиц старше 60 лет выявлена позитивная ассоциация с ИИ носительства аллелей IL6*-174G и IFNG*874Т, а у лиц ?60 лет - носительства аллеля PDE4D*41А.

3. При анализе уровней фибриногена и показателей тромбоцитарного гемостаза в плазме крови не было выявлено значимых различий между носителями различных аллелей и генотипов полиморфного участка -174G>C гена IL6.

4. Анализ совместного носительства аллелей/генотипов исследованных полиморфных участков с помощью ПО APSampler у больных ИИ и здоровых индивидов выявил позитивно и/или негативно ассоциированные с ИИ би- и триаллельные сочетания аллелей/генотипов генов IL6, PDE4D и TGFB1 с аллелями других исследованных генов, а именно IFNG, CTLA4, IL4 и TNF, носительство которых в одиночку не было значимо ассоциировано с ИИ. Ассоциация ИИ с выявленными сочетаниями характеризуется бульшим уровнем значимости, чем с одиночными аллелями. Носительство каждого из трех сочетаний: IL6*-174G + TGFB1*915G/G; PDE4D*87C + TGFB1*?509T/T и PDE4D*87C + TGFB1*915G/G - оказалось маркером риска ИИ.

5. При разделении больных ИИ и контрольной группы по гендерному признаку и последующем комплексном анализе у мужчин наблюдали позитивную ассоциацию с ИИ в составе различных сочетаний носительства аллеля IL6*-174G или генотипа IL6*-174G/G, аллелей PDE4D*41А или PDE4D*87C, а также генотипа TGFB1*915G/G, а у женщин ? тех же аллелей IL6*-174G, PDE4D*41А, PDE4D*87C и TGFB1*915G, что и у мужчин. Кроме того, в состав предрасполагающих сочетаний у женщин входил аллель LTA*252G>A, который не был выявлен при сравнении общих групп, и аллель IFNG*874T.

6. Комплексный анализ в подгруппе лиц в возрасте старше 60 лет выявил значимые позитивные ассоциации с ИИ в составе различных сочетаний аллелей IL6*?174G, TGFB1*915G и IFNG*874T, а у лиц в возрасте ? 60 лет - аллелей PDE4D*41GA, PDE4D*87C и генотипа TGFB1*?509Т/Т.

7. В целом, результаты, полученные при анализе 11 полиморфных участков 8 генов воспаления, свидетельствуют о том, что наиболее значимый вклад в развитие ИИ у этнических русских вносят гены IL6, PDE4D и TGFB1. аллели или генотипы полиморфных участков которых являются индивидуальными маркерами риска. Выявлены также составные генетические маркеры ИИ, представляющие собой «генетические ансамбли» ? сочетания 2 или 3 аллелей названных генов между собой или с аллелями генов IFNG, LTA, CTLA4, IL4 и TNF. Для них характерно повышение уровня значимости по...