Полиморфизм генов, белковые продукты которых играют роль в развитии воспаления, при ишемическом инсульте

Среди всех полиморфизмов гена eNOS наиболее детально исследован минисателлитный полиморфизм eNOS 4a/4b. В китайской популяции аллель 4а рассматривается как независимый фактор риска развития атеросклероза и заболеваний, сопровождающихся нарушениями выработки NO, в том числе ИИ [176, 342]. Однако, в другом исследовании показана протективная роль аллеля 4a при развитии лакунарного инсульта в турецкой популяции [161, 407]. В китайской популяции была выявлена также достоверная ассоциация с ИИ биаллельных полиморфизмов ?922A>G и ?786T>C в промоторной области гена. Генотип eNOS*-786C/C и аллель eNOS*-922G чаще встречались у больных ИИ по сравнению с контрольной группой [100]. Вероятно, эти полиморфизмы оказывают влияние на уровень транскрипции гена, вызывая снижение активности NO и развитие гипертензии и/или вазомоторных реакций, что способствует атерогенезу и увеличивает риск инсульта [178].

Гены ренин-ангиотензин-альдостероновой системы

Нарушения в ренин-ангиотензин-альдостероновой системе (РААС) служат одной из главных причин развития инсульта и других сердечно-сосудистых заболеваний. Среди генов, кодирующих компоненты РААС, особое внимание привлекает ген ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ) и полиморфный маркер, расположенный в его 16-ом интроне, который характеризуется наличием или отсутствием (инсерция/делеция) фрагмента ДНК длиной 287 п.н. [105]. В результате проведенных исследований была выявлена позитивная связь делеции в данном участке с предрасположенностью к ИИ в европейских и азиатских популяциях [30, 330, 365, 377]. Также показаны ассоциации с инсультом полиморфизма генов AGT (кодирует ангиотензин) [34, 146, 322, 413] и REN (ренин)[138].

Ген метилентетрагидрофолатредуктазы

Изменения в метаболизме гомоцистеина приводят к нарушению функции эндотелия, агрегации тромбоцитов и как следствие к раннему развитию атеросклеротических поражений сосудов. Подобные изменения вызывает замена 677С>Т в гене MTHFR, которая приводит к замене валина на аланин в сайте связывания фолата метилентетрагидрофолатредуктазы, участвующей в превращении гомоцистеина в метионин, и к уменьшению ее ферментативной активности. Генотип MTHFR*677Т/Т связан с повышенным уровнем гомоцистеина в плазме [139]. Согласно исследованиям последних лет, ассоциацию с ИИ полиморфизма 667С>Т гена MTHFR выявляли в популяциях китайцев [143, 414], японцев [403], турок [332], индусов [75]. В работах японских и китайских исследователей была отмечена более высокая частота инсульта у женщин-носительниц аллеля MTHFR*667Т в период менопаузы; это может быть связано с тем, что недостаток эстрогенов снижает устойчивость организма к повышению уровня гомоцистеина и является предрасполагающим фактором к развитию ССЗ [64, 398]. В популяциях европейских стран cтатистически значимая позитивная ассоциация аллеля MTHFR*667Т с ИИ была описана у поляков [145], итальянцев [298] и голландцев [241].

Гены системы свертывания крови

Нарушения регуляции свертывающих и противосвертывающих систем крови, а также неспособность компенсировать эти нарушения часто приводят к возникновению инсульта и целого ряда других сердечно-сосудистых заболеваний. Увеличение концентрации фибриногена вызывает повышенную свертываемость крови и агрегацию тромбоцитов, что способствует образованию тромбов и окклюзии сосудов, как малого, так и крупного калибра [321, 333].

В виду того, что воспаление при ИИ развивается не только через механизмы атерогенеза, но и вследствие усиления свертывающей способности крови, значительный интерес представляет изучение функционально значимых полиморфизмов генов фибриногена. Наибольшее значение отводится полиморфным участкам -148C>Т и -455G>А в промоторной области гена FGB, которые участвуют в связывании транскрипционных факторов, влияя на уровень экспрессии гена в-фибриногена. Показано, что аллели FGB*?148T и FGB*455A ассоциированы с повышенной экспрессией гена, что приводит к увеличению содержания фибриногена в крови и повышает вероятность образования тромбов [98, 141]. Достоверная ассоциация обоих участков с ИИ была показана лишь для китайской популяции [98, 99, 402]. Исследования ассоциации этих полиморфизмов с ИИ были проведены ранее в нашей лаборатории. У русских наблюдали позитивную ассоциацию с ИИ аллеля FGB*?148C, в группе лиц, у которых заболевание развивается после 60 лет, а также в общей группе пациентов, но только в составе сочетания с аллелем LPL*1595C [31, 40]. У якутов был обнаружен протективный эффект аллеля FGB*?249T в сочетании с аллелем APOE*?491T в отношении развития ИИ. Был проведен анализ неравновесия по сцеплению и сравнение частот выявленных гаплотипов для полиморфных участков ?148C>T и ?249C>T гена FGB, а также полиморфизма 4266A>G гена FGA, расположенного в одном кластере с FGB, однако ни для русских, ни для якутов ассоциации какого-либо гаплотипа с ИИ не наблюдалось [30].

В ряде исследований авторы пришли к заключению, что наибольший вклад SNP -455G>А гена FGB вносит в развитие атеротромботического и лакунарного типов ИИ [219, 303, 399, 419].

Гены, кодирующие компоненты системы воспаления

Исследования последних лет показали, что в патогенезе ИИ, наряду с вышеперечисленными системами, важнейшую роль играют иммунологические механизмы. Ишемическое повреждение мозга характеризуется острым локальным воспалением и изменением концентрации цитокинов. Цитокины играют важную роль в регуляторных процессах и воспалительных реакциях и имеют большое значение в патогенезе инсульта и его основного фактора риска - атеросклероза [12, 16, 112].

В воспалении различают молекулярный и клеточный компоненты. Секретируемые одним из типов Т-хелперных (Th) клеток цитокины оказывают влияние на субпопуляции клеток других типов, вступая во взаимодействие друг с другом в сложной цитокиновой сети. Продуцируемые Th1 и Th17 цитокины, такие как интерлейкин-2 (IL2), фактор некроза опухолей (TNF), лимфотоксин (LT), интерферон-гамма (IFNг) и IL-17 играют роль индукторов воспаления. Th2 и регуляторные Т-хелперы (Treg) продуцируют IL-4, IL-10 и трансформирующий ростовой фактор бета-1 (TGFв1), которые обладают регуляторными и противовоспалительными свойствами [313]. При острой гипоксии мозговой ткани наблюдается миграция лейкоцитов в зону повреждения и активация клеток микроглии [417]. Местная выработка микроглией, астроцитами и эндотелиальными клетками цитокинов влияет на развитие воспалительной реакции.

При артериальной окклюзии возрастает продукция макрофагами воспалительных цитокинов интерлейкина-1 (IL-1) и интерлейкина-6 (IL-6), в результате чего эндотелиальные клетки усиленно экспрессируют молекулы адгезии, такие как ELAM-1, ICAM-1, VCAM-1, Р-селектин и Е-селектин, которые инициируют повышение проницаемости интимы, а также клеточную инфильтрацию стенки сосуда воспалительными клетками и миграцию их в ишемизированную ткань мозга [112, 179]. Происходит также активная пролиферация гладкомышечных клеток и продукция ими соединительной ткани, которая составляет основу фиброзной капсулы атеросклеротической бляшки [173]. В первые часы после острой церебральной ишемии возрастает концентрация C-реактивного белка (CRP), который запускает активацию системы комплемента и также способствует развитию воспаления в ишемизированной зоне и увеличению размера инфаркта мозга [2]. Происходит запуск механизмов вторичного повреждения, среди которых наибольшее значение имеют реакции локального воспаления и аутоиммунной агрессии.

Показано, что воспаление предрасполагает к развитию ИИ, а также влияет на степень повреждения мозга после ИИ [11, 341]. В остром периоде ИИ наблюдается сложная динамика изменения уровня интерлейкинов IL-lб и IL-10 с развитием цитокинового дисбаланса. Обнаружено, что высокий уровень IL-6 в плазме крови ассоциирован с нестабильными бляшками в сонной артерии, что может свидетельствовать о потенциальном риске развития инсульта [404]. Тяжесть клинических проявлений ИИ зависит от соотношения провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, а также от времени, прошедшего после начала заболевания, и от обширности ишемического повреждения. Соотношение провоспалительных и противовоспалительных цитокинов может служить маркером тяжести ИИ. Значительное снижение уровня провоспалительных цитокинов к концу острого периода инсульта по сравнению с первыми сутками заболевания может указывать на высокую вероятность благоприятного течения отдаленного периода заболевания. [404].

Установлена неоднозначная роль при ишемическом инсульте некоторых регуляторных молекул, в том числе TNF, IL-10 и TGFв1, которым свойственны как нейропротективные, так и нейротоксические свойства. Сейчас термины «про- и противовоспалительные» цитокины употребляются все реже. Чаще говорят о плейотропном или двунаправленном действии цитокинов.

На данный момент ассоциации с инсультом выявлены для полиморфных участков целого ряда генов системы воспаления: IL-1Ra, IL-1в, IL-4, IL-6, LT, CRP и TNF и др. Результаты довольно многочисленных исследований по поиску ассоциации полиморфизма генов системы воспаления с ИИ приведены в таблице 2. Анализ данных, полученных в разных работах для одного и того же полиморфного участка, свидетельствует о невысокой воспроизводимости полученных результатов. При этом противоречивость полученныхых данных часто возрастает по мере увеличения числа исследований, что можно объяснить этническими различиями, негомогенностью исследуемых популяций, а также трудностями в подборе контрольной группы. Как видно из таблицы 2, для одного и того же аллеля показана позитивная или, напротив, негативная ассоциация с развитем ИИ у представителей различных рас. Например, в случае генов PDE4D и TNF наблюдали протективное действие одного из аллелей/генотипов в популяции европеоидов [60, 324] и предрасполагающее действие этого же аллеля в популяции монголоидов [205, 416].

Некоторые проблемы возникают в связи клинической гетерогенностью ИИ. Различные исследователи формируют выборки больных в соответствии с различными классификациями ИИ. При классификации по патофизиологическим особенностям заболевания с разделением ИИ на лакунарный, кардиоэмболический, атеротромботический и другие была выявлена связь полиморфизма генов IL-6 и SELP с отдельными формами ИИ. Однако, во многих работах патогенетическая и этиологическая неоднородность ИИ не принимались в расчет. Этим можно объяснить как отсутствие в некоторых случаях выявленных ассоциаций, так и плохую воспроизводимость результатов.

В то же время, в ряде случаев наблюдается воспроизводимость полученных результатов (их валидация). Так, для аллеля IL1Ra*1 была показана позитивная ассоциация с ИИ для итальянской популяции[336], а затем была выявлена предрасполагающая роль данного аллеля и в китайской популяции [218], также подобная ассоциация c ИИ была найдена для аллеля IL-1б*-889T в китайской популяции, а позднее подтверждена в популяции индусов. Также в ряде работ для европейской популяции была показана ассоциация с ИИ аллелей IL6*?174G и TNF*?308A. Участие именно таких полиморфизмов в восприимчивовости к ИИ можно считать доказанным.

Из данных таблицы 2 можно видеть, что в предрасположенность к ИИ могут быть вовлечены полиморфные участки кодирующей и регуляторной (промотор, интроны или нетранслируемая область) областей генов. Для выявления того, какой именно из нескольких полиморфных участков, расположенных на одной хромосоме в одном гене или в кластере генов, отвечает за ассоциацию с заболеванием, проводится анализ неравновесия по сцеплению с определением возможных гаплотипов. Часто один из участков вносит главный вклад в риск развития заболевания, а вклад остальных обусловлен неравновесным сцеплением с ним. Подобный анализ удобен тем, что для выявления значительной части гаплотипов можно использовать один или несколько SNP (так называемые "SNP-метки"), и не требуется проведения генотипирования всех рассматриваемых SNP. Гаплотипы, ассоциированные с риском развития ИИ, были выявлены для генов CRP и PDE4D [248, 354, 387].

Таблица 2. Сведения об ассоциации полиморфизма генов системы воспаления человека с ИИ, полученные с использованием подхода «ген-кандидат» (представлены в соответствии с номерами хромосом, на которых локализованы исследованные гены)

Примечания: (+) - выявление позитивной ассоциации с аллелем (генотипом, гаплотипом);

(?) - выявление негативной ассоциации с аллелем (генотипом, гаплотипом);

(0) - отсутствие ассоциации

Полногеномный поиск и мета-анализ

В последнее время среди методов поиска генов предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям основным становится подход, основанный на полногеномном поиске ассоциаций (genome-wide association studies, или GWAS). Успешность этого подхода обеспечивается выполнением ряда требований, таких как анализ обширных выборок индивидов (несколько сотен или тысяч), репрезентативных для исследуемой популяции, и использование огромного набора (от 300 тысяч до 1 млн.) полиморфизмов, равномерно распределенных по геному и обеспечивающих репрезентативность в отношении вариабельности генома [172].

За последние годы исследования, выполненные методом GWAS, внесли большой вклад в понимание генетики большинства комплексных заболеваний, однако в отношении ИИ успех был достигнут сравнительно недавно. В таблице 3 приведены результаты исследований генетической предрасположенности к инсульту, полученные для европеоидов с использованием GWAS. Представлены только данные для полиморфизмов, ассоциированных с заболеванием с уровнем значимости <10-7 (получены для генов NINJ2, PITX2, IMPA2), которые соответствуют требованиям, предъявляемым к результатам GWAS. Была выявлена связь генов PITX2 и ZFHX3, лежащих на хромосомах 4q25 и 16q22 соответственно, с фактором риска кардиоэмболического ИИ - мерцательной аритмией [135, 150, 152]. Также данным методом была выявлена ассоциация с инсультом генов NINJ2 и IMPA2. Ген NINJ2 кодирует молекулу адгезии нинджурин 2(ninjurin 2), которая вырабатывается глией, причем синтез этой молекулы увеличивается при повреждении нервной ткани. Было показано, что данный ген ассоциирован с развитием атеротромботического инсульта и ИИ у представителей белой расы [185], а для японской популяции была выявлена ассоциация с атеротромботическим инсультом и атеросклерозом сосудов [260]. IMPA2 кодирует миоинозитолмонофосфатазу, которая участвует в метаболизме инозитола и катализирует превращение инозитолмонофосфата в свободный миоинозитол, роль данного фермента ранее была показана при биполярных расстройствах [251]. Кроме того, исследование локуса 9p21, ассоциация с которым была ранее показана при инфаркте миокарда и ишемической болезни сердца, выявило его ассоциацию с атеротромботическим ИИ, однако с другими подтипами инсульта ассоциации данного локуса обнаружено не было [151].

Таблица 3. Результаты полногеномного поиска ассоциаций с инсультом методом GWAS (Genome-Wide Association Screening) у европеоидов.

Среди методов выявления генетических детерминант комплексных заболеваний особое место занимает мета-анализ. Мета-анализ представляет собой методику объединения результатов различных исследований, складывающуюся из качественного компонента (например, использование таких заранее определенных критериев включения в анализ, как полнота данных, отсутствие явных недостатков в организации исследования и т.д.) и количественного компонента (статистическая обработка имеющихся данных). Преимуществом мета-анализа является возможность увеличения статистической мощности исследования, а, следовательно, точности оценки, что позволяет более точно, чем при анализе каждого отдельно взятого небольшого клинического исследования, определить категории больных, для которых применимы полученные результаты. Подобный подход обеспечивает уменьшение вероятности случайных и систематических ошибок и может служить гарантией объективности получаемых результатов. Данные подобных исследований позволяют с большей вероятностью говорить об ассоциации генов метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), ингибитора ангиотензин-превращающего фермента (ACE), коагуляционного фактора V Лейдена, а также протромбина с инсультом [55, 91, 111, 365, 402]. Однако, воспроизведение полученных результатов для некоторых генов, в частности ALOX5AP, на других выборках в странах Европы дало противоречивые результаты, а мета-анализ показал значительные различия среди исследований [9, 70, 214, 239, 420].

Подводя итоги сказанному в разделе 1.3, можно констатировать, что несмотря на многочисленные работы, направленные на поиск генов, определяющих предрасположенность к полигенным формам ИИ, проблема еще далека от своего разрешения. В то же время очевидна необходимость проводить независимые исследования для отдельных этнически гомогенных популяций.

1.4 Выбор генов-кандидатов и их полиморфных участков для настоящего исследования

Наше исследование проведено методом «случай - контроль» для больных ИИ, этнических русских, с использованием контрольной группы той же этнической принадлежности. В исследование были включены SNP 8 генов, участвующих в развитии воспаления: CTLA4, PDE4D, IL4, TNF, LTA, IL6, IFNG, TGFв1. Для анализа были выбраны функционально значимые полиморфные участки, расположенные в кодирующей или в регуляторной областях анализируемых генов. Ниже мы остановимся подробнее на описании выбранных генов, функции их белковых продуктов и выбранных полиморфимах.

Ген CTLA4, его белковый продукт и полиморфизм

Ген CTLA4 расположен на хромосоме 2q33.2 и кодирует антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (cytotoxic T lymphocyte antigen 4, CTLA4) - костимуляторный рецептор Т-лимфоцитов, важный негативный регулятор активности T-клеток, который участвует в поддержании перифиричекой T-клеточной стимуляции [113, 210, 256]. В активированных Т-лимфоцитах изоформа рецептора (full-length isoform -- flCTLA4) закодирована в 4 экзонах: лидерный белок кодируется экзоном 1, связывающий лиганды домен -- экзоном 2, трансмембранная область -- экзоном 3 и цитоплазматический домен -- экзоном 4 [375].

Для активации Т-лимфоцитов требуется, как минимум, два сигнала. Один из них реализуется в процессе взаимодействия Т-клеточных рецепторов (ТКР) с комплексом «процессированный пептид антигена - молекула ГКГ» представленным на поверхности антиген-презентирующих клеток (АПК), другой - за счет взаимодействия так называемых «ко-стимулирующих» рецепторов на Т-клетках и соответствующих лигандов на АПК. Ключевой «ко-стимуляторный» сигнал обеспечивается за счет взаимодействия CD28 на Т-лимфоцитах и СD80 и СD86 на АПК. При наличии обоих сигналов Т-лимфоциты синтезируют цитокины, которые, в свою очередь активируют другие клетки иммунной системы (прежде всего макрофаги). В отсутствие «ко-стимуляторного» сигнала Т-лимфоциты теряют способность эффективно «отвечать» на антигенные стимулы и подвергаются апоптозу. CTLA4 связывает CD80 и CD86 с более высокой авидностью (примерно в 500-2500 раз выше), чем CD28. Поэтому связывание CTLA4 с CD80 и CD86 предотвращает ко-стимулирующий эффект CD28 на Т-лимфоциты (ко-стимулирующий сигнал 2) и таким образом подавляет активацию Т-лимфоцитов [261, 290]. Известно, что после активации Т клеток лимфоциты секретируют интерлейкин-2 (ИЛ-2), который влияет на пролиферацию и дифференцировку клеток. Соответственно, было обнаружено, что когда CTLA4 стимулирован, происходит снижение продукции ИЛ-2 [232]. Кроме того, экстрацеллюлярный домен CTLA4 может связываться с IgG. Комплекс CTLA4-Ig блокирует продукцию ИЛ-2 и ко-стимуляцию CD28/B7 [77, 232]. Экспериментально было показано, что мыши, нокаутные по CTLA 4, погибали, так как из-за отсутствия ингибирующего сигнала происходило снижение пролиферации и дифференцировки Т клеток [97].

В гене CTLA4 выявлено более 30 точечных однонуклеотидных замен (SNP),ассоциированых с различными аутоиммунными заболеваниями, такими как, аутоиммунный тиреоидит, диабет типа I, ревматоидный артрит, РС [198, 230, 418]. Наибольший интерес представляет однонуклеотидный полиморфизм в положении 49 первого экзона, который приводит к замене треонина на аланин в 17-м положении сигнальной последовательности. Это вызывает у носителей генотипа CTLA4*49G/G повышение пролиферативной активности Т-лимфоцитов [282]. Была показана ассоциация с развитием гипертензии генотипа CTLA4*49A/A в японской популяции [209].

Ген PDE4D, его белковый продукт и полиморфизм

Ген PDE4D расположен на хромосоме 5q12 имеет семь промоторов, состоит из 22 экзонов и кодирует фосфодиэстеразу 4D (PDE4D), которая относится к металлофосфогидролазам суперсемейства фосфодиэстераз. В результате альтернативного сплайсинга или использования разных промоторов возможно образование как минимум восемь функционально различных изоформ белка: двух коротких форм (PDE4D1 и PDE4D2) и шесть длинных (PDE4D3, 4, 5, 7, 8 и 9), отличающихся по структуре N-концевого домена [149, 276]. Предполагается, что эти домены могут играть важную роль в регуляции активности фосфодиэстеразы [236]. Разные варианты PDE4D экспрессируются во многих типах клеток и тканей различных органов, включая мозг, легкие, почки, моноциты, B- и T-лимфоциты и сосудистые гладкомышечные клетки [71, 360].

PDE4D регулирует внутриклеточное соотношение циклических аденозинмонофосфата (цАМФ) и гуанозинмонофосфата (цГМФ) за счёт их расщепления до 5'-монофосфатных нуклеотидов. Было показано, что уменьшение уровня цАМФ вызывает усиление пролиферации и миграции сосудистых гладкомышечных клеток in vitro, что приводит к образованию фиброзной бляшки [140, 177, 293]. Показано, что ген PDE4D экспрессируется также в активированных макрофагах, таким образом, PDE4D принимает участие в процессах воспаления при атерогенезе и/или приводит к нестабильности атеросклеротичекой бляшки [245]. Показано, что активность фосфодиэстеразы 4D составляет 80% от активности всех фосфодиэстераз в клетках, участвующих в процессе воспаления [189]. Фосфодиэстераза 4D является одной из фосфодиэстераз, участвующих в регуляции проницаемости ГЭБ [170]. Повышение внутриклеточного уровня цАМФ увеличивает электрическое сопротивление эндотелия путем стабилизации межклеточных контактов и таким образом уменьшает проницаемость ГЭБ [132].

На модельных животных было показано ингибирование пролиферации гладкомышечных клеток при применении антагонистов PDE4 [187]. Также на животных было показано, что значительное увеличение уровня PDE4D играет роль в повреждении клеток гиппокампа, вызванном ишемией. В свою очередь повышение уровня PDE4D после ишемии головного мозга с учетом роли в изменении проницаемости ГЭБ вдвое увеличивает повреждающее действие ишемии [169, 171]. Ферментативная активность PDE4D может играть важную роль в риске развития инсульта посредством ее участия в воспалении, формировании физиологического ответа на повреждение сосудов, ангиогенезе [69, 70, 156].

В гене PDE4D было обнаружено 260 однонуклеотидных полиморфизмов (SNP). Gretarsdottir S.et al. выявили три гаплоблока, A, B и С, охватывающих первые три экзона гена PDE4D и прилежащие к ним участки [149, 276]. В настоящем исследовании выбраны полиморфные участки SNP87C>T и SNP41G>A, которые находятся в некодирующей области гена и относятся к гаплоблокам A и B, соответственно. Их функциональная значимость пока не ясна, однако, в исследовании [149] была показана их ассоциация с различными формами инсульта.

Ген IL4, его белковый продукт и полиморфизм

Ген IL4 картирован на длинном плече (с q31 по q33) 5-ой хромосомы, имеет 4 экзона и расположен в кластере нескольких других Th2-цитокинов, таких как IL-5 и IL-13 [223, 257].

Ген IL4 кодирует плейотропный цитокин интерлейкин 4 (IL-4), который продуцируют Th2-клетки и который ингибирует Th1-клетки и стимулирует иммунный ответ Th2-типа. Также IL-4 является сильным ингибитором функции макрофагов и индуцирует апоптоз моноцитов [250]. Он снижает продукцию провоспалительных цитокинов, таких как TNFб, IL-6, и IL-1б активированными моноцитами и таким образом оказывает противовоспалительное действие [101]. IL-4 также является ключевым фактором в дифференцировке Т-хелперов [269]. Показано, что IL-4, совместно с IL-10, тормозит экспрессию тканевого фактора, вызывая гипокоагуляцию и усиление секреции активатора плазминогена [347]. В центральной нервной системе (ЦНС) IL-4 ингибирует выработку TNF [95], провоспалительных цитокинов [62] фактора роста нервов (NGF) [242] и выработку микроглией NO [94]. В то же время он повышает цитокинетическую активность макрофагов, способствует миграции в очаг воспаления нейтрофилов, усиливает выработку колониестимулирующих факторов. Katsuno et al. показали, что уровень IL-4 повышен во внутренней яремной вене у пациентов с черепно-мозговыми травмами и субарахноидальными кровоизлияниями [197].

Описано несколько полиморфных участков гена IL4; некоторые из них вовлечены в регуляцию продукции IL-4. Наиболее изученным является находящийся в промоторной области гена IL4 полиморфный участок -590C>T [180], который и был выбран в нашем исследовании. Данные исследований in vitro и in vivo показали, что аллель IL4*-590T, который находится в жестком неравновесии по сцеплению с аллелем IL4*-33T, ассоциирован с повышенной экспрессией IL-4 [315, 316, 317].

Ген TNF, его белковый продукт и полиморфизм

Ген TNF картирован на хромосоме 6 в области 6p21.3, в пределах главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), имеет размер 2762 п.н. и содержит 4 экзона [281]. Транскрипция с гена TNF запускается NF-kappaB и может быть индуцирована различными цитокинами, например, г-интерфероном [382, 383].

Ген кодирует фактор некроза опухоли, который, как и IL-6, является ключевым цитокином с провоспалительным действием, играющим важную роль в апоптозе, дифференцировке и пролиферации. TNF представляет собой полипептид, секретируемый стимулированными макрофагами и моноцитами, влияющий на метаболизм липидов, свертывание крови, резистентность к инсулину, функционирование клеток эндотелия и обладающий цитолитическим или цитостатическим действием в отношении широкого спектра линий опухолевых клеток [58]. TNF, через активацию макрофагов и микроглии, что, в свою очередь, приводит к усилению их фагоцитирующих свойств, усиливает продукцию цитотоксических соединений, таких как окислительные радикалы, NO, протеазы и др [212]. TNF увеличивает экспрессию молекул адгезии, высвобождение эндотелиальных цитокинов, а также молекул HLA класса II, меняет архитектонику гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), модифицируя организацию плотных межклеточных контактов между эндотелиальными клетками, индуцируют продукцию хемокинов - хемоаттрактантов для клеток, участвующих в воспалении [137]. TNF, увеличивая экспрессию молекул адгезии на эндотелиальных клетках микрососудов в ЦНС [210], способствует гибели нейронов [94], повышает риск развития реперфузии ЦНС [68], а также увеличивает отек головного мозга [405].

TNF играет главную роль в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний посредством влияния на липидный обмен. Жировая ткань продуцирует TNF, который оказывает влияние на стенку сосуда или напрямую, или посредством изменения метаболизма инсулина. TNF снижает активность тирозинкиназы инсулинового рецептора, усиливает фосфорилирование серина в субстрате инсулинового рецептора, что приводит к ослаблению проведения инсулинового сигнала [107, 175, 229]. TNF может способствовать регенерации поврежденных аксонов и защите культивированных нейронов [89]. Однако, при внутрижелудочковом введении TNF крысам с окклюзией средней мозговой артерии отмечали увеличение объема инфаркта мозга [83]. Показано, что после окклюзии средней мозговой артерии наблюдается увеличение выработки TNF не только в нейронах, но и в астроцитах, микроглии, сосудистом сплетении и эндотелиальных клетках [154]. Данные эффекты можно объяснить тем, что активация специализированного рецептора TNF р55 может передавать сигналы , приводящие как к апоптозу, так и к выживанию клеток [201].

Из всех полиморфизмов в промоторной области гена TNF, наибольшее клиническое значение имеют ?238G>A и ?308 G>A, показана их ассоциация с изменениями в уровне белка и скоростью транскрипции [306, 334, 368 394].

Из литературы известно, что полиморфизм TNF ассоциирован с различными ССЗ. Показана ассоциация генотипов TNF*?308A/A и TNF*?308A/G полиморфного участка ?308A>G гена TNF с повышенным риском развития неблагоприятного исхода в группе больных, перенёсших острый коронарный синдром [7]. При исследовании ассоциации полиморфного участка ?308A>G гена TNF с риском развития инфаркта миокарда (ИМ) было выявлено, что частота аллеля TNF*?308A была выше в группе больных с подъемом сегмента ST по сравнению с контрольной группой и группой больных без подъема сегмента ST [52]. Этот полиморфный участок был выбран нами для анализа в нашем исследовании.

Ген LTA, его белковый продукт и полиморфизм

Ген LTA картирован на хромосоме 6p21.3, содержит 3 экзона и кодирует лимфотоксин альфа [193].

Лимфотоксин альфа (LTA, ранее называвшийся TNFв) - провоспалительный цитокин, лимфокин из суперсемейства факторов некроза опухоли, обладает рядом подобных TNF биологических активностей, также показана роль LTA в метаболизме липидов и его участие в развитии дислипидемий [238].

LTA не имеет трансмембранного домена, но способен удерживаться на мембране за счет образования комплекса с трансмембранным белком рЗЗ [86]. LTА синтезируется В - и Т - лимфоцитами и играет роль в лимфоидном органогенезе и в дифференцировке Т-клеток. Было обнаружено, что LTA способен привлекать нейтрофилы в очаг воспаления, индуцировать фагоцитоз и обладает способностью индуцировать защиту от микроорганизмов, таких как Plasmodium falciparum, Haemophilus influenzae, Mycobacterium tuberculosis [288, 311]. LTA активирует молекулы адгезии и цитокины эндотелия сосудов, гладкомышечных клеток и некоторых видов лейкоцитов, что приводит к прогрессированию атеросклероза и развитию ишемической болезни сердца (ИБС) и ИМ [133, 272, 285].

Messer et al. выявили SNP в положении 252 A>G в интроне LTA, который связан с повышенной экспрессией LTA [267]. В исследовании Liu Y et al. на американцах европеоидной расы и афроамериканцах было показано, что генотип LTA*252G/G также ассоциирован с увеличением толщины средней оболочки сонных артерий и как следствие, неблагоприятным прогнозом атеросклероза [237].Была показана ассоциация генотипа LTA*252G/G полиморфизма 252 A>G гена LTА с риском развития ИМ у японцев [291], однако в русской популяции с риском развития ИМ была выявлена ассоциация аллеля LTA*252A [37]. Учитывая эти данные, мы в настоящем исследовании остановились на анализе полиморфизма 252А>G гена LTА.

Ген IL6, его белковый продукт и полиморфизм

Ген IL6 находится на хромосоме 7p21 и содержит 4 экзона [80]. Промотор гена напрямую активируется различными цитокинами, в том числе IL-1 и TNF. Транскрипция IL6 запускается под действием IL-1 ядерным фактором NF-IL6 [47].

Ген IL6 кодирует мультифункциональный, плейотропный провоспалительный цитокин интерлейкин 6 (IL-6), который синтезируется различными типами клеток, такими как Т- и В-лимфоциты, фибробласты, эндотелиальные клетки, макрофаги/моноциты, мезангиальные и глиальные клетки [304, 396]. Данный цитокин играет значимую роль в развитии атеросклеротических бляшек в сосудах головного мозга [339] и в сонной артерии [404], а также обладает нейротрофическим действием при церебральной ишемии [356]. Синтез IL-6 индуцируется IL-1, TNF-б, колониестимулирующими факторами, а ингибируется IL-4, 10, 13, эндотоксинами и интерфероном г.

Рецептор IL-6 состоит из двух функциональных белков - мембранного IL-6 рецептора (mIL6-6R)и мембранного гликопротеина (gp130), передающих активационный сигнал [108, 163, 314]. Взаимодействие комплекса IL-6 и рецептора с gp130 запускает каскад реакций, приводящий в конечном итоге к индукции дифференцировки В-клеток и синтеза антител, активации Т-клеток и макрофагов, стимуляции пролиферации синовиоцитов и синтезу сосудистого эндотелиального фактора роста, активации остеокластов, индукции матриксных металлопротеиназ, активации эндотелия и пролиферации гладкомышечных клеток [314].

Нарушение продукции IL-6 приводит к нарушению взаимодействий гладкомышечных клеток с лейкоцитами, что в свою очередь приводит к накоплению внеклеточного матрикса, усилению миграции лейкоцитов в очаг поражения и изменению уровня медиаторов воспаления, усиливая атерогенез [242]. Синтезируясь в атеросклеротической бляшке, IL-6 стимулирует экспрессию матриксных металлопротеиназ, моноцит-хемоаттрактантного белка MCP-1 и TNF, способствуя нестабильности бляшки [326, 335]. IL-6 активирует также эндотелиальные клетки, что приводит к продукции молекул адгезии (ICAM-1) на поверхности эндотелия: это играет решающую роль в последующем запуске миграции лейкоцитов из сосудистого русла в зону фокальной ишемии с инфильтрацией ими поврежденной ткани. [203, 206].

IL-6, наряду с глюкокортикоидами, IL-1в и TNF, регулирует синтез фибриногена в острой фазе воспаления [141]. В промоторных областях генов, кодирующих субъединицы фибриногена человека (FGA, FGB, FGG), идентифицировано несколько IL-6 -респонсивных элементов, связывающих STAT3 - основной транскрипционный фактор, передающий сигнал от IL-6-рецептора к ядру [115, 164]. По этому механизму IL-6 вносит свой вклад в повышение свертываемости крови и, в частности, в усиление атеротромбоза.

Для гена IL6 известно несколько аллельных полиморфизмов. Наиболее изученным из описанных на данный момент четырех SNP является расположенный в 5'-фланкирующей области гена полиморфный участок ?174G>C [126], на котором мы и остановились в нашем исследовании. Показана ассоциация генотипа IL6*-174G/G с повышенным уровнем IL-6 в плазме, что связано с усилением транскрипции у носителей этого аллеля [126]. Анализ ассоциации данного полиморфизма показал, что аллель IL6*-174C связан с ревматоидным артритом [126], сахарным диабетом [213], метаболическим синдромом [186], диабетической ретинопатией [325], астмой [338] и другими заболеваниями.

Ген IFNG, его белковый продукт и полиморфизм

Ген IFNG, кодирующий провоспалительный цитокин интерферон гамма (IFNг), локализован на хромосоме 12 в области 12q24.1 и имеет размер около 6 т.п.н., содержит 4 экзона и 3 интрона.

IFNг продуцируется субпопуляцией Th1 и активированными NK-клетками; повышение экспрессии IFNг, вследствие активации лимфоцитов, является важным этапом в развитии воспаления. Он обладает множественным действием на рост и дифференцировку клеток самых разных типов. IFNг, действуя непосредственно на СD8+-лимфоциты, вызывает повышение на их поверхности рецепторов к IL2 и МНС II класса. В результате происходит активация как цитотоксической, так и антигенпрезентирующей активности Т-лимфоцитов [263]. При участии матриксных металлопротеиназ IFNг совместно с TNF могут модифицировать организацию плотных межклеточных контактов между эндотелиальными клетками ГЭБ, способствуя выходу лейкоцитов из сосудистого русла и миграции к очагу воспаления в ЦНС [289]. В исследовании Lambertsen et al. на мышах было сделано предположение, что IFNг существенно усиливает повреждения головного мозга, вызванные ишемией [221]. IFNг способен подавлять синтез коллагена гладкомышечными клетками и увеличивать синтез металлопротеиназ макрофагами, можно предположить, что этот цитокин активно участвует в атерогенезе, в частности, в реорганизации матрикса атеросклеротической бляшки [228].

В первом интроне гена IFNG расположены высокополиморфные (до 6 аллелей) микросателлитные повторы (вариабельное число динуклеотидных повторов СА в положении 1349; VNDR 1349). Показано, что аллель 2 (с 12 СА-повторами) ассоциирован с высоким уровнем продукции IFNг in vitro, а также связан с риском развития некоторых аутоиммунных, инфекционных и хронических воспалительных заболеваний [92, 300]. В непосредственной близости от данного микросателлитного повтора, расположен SNP 874A>T гена IFNG. Сцепление аллеля IFNG*874T и аллеля 2 микросателлитного повтора (с 12 СА-повторами) является абсолютным. Показано, что с высоким и низким уровнем продукции IFNг соответственно коррелируют аллели IFNG*874T и IFNG*874A [301]. Показана ассоциация данного полиморфного участка с различными заболеваниями, в том числе онкологическими [142, 195, 235].

Исследование Ianni et al. показало увеличение частоты IFNG*874A у пациентов с ИМ [182]. Показана связь носительства данного аллеля с неблагоприятным прогнозом и исходом в случае идиопатической дилатационной кардиомиопатии [45].Авторы работы [182] высказали предположение, что носительство IFNG*874A и как следствие снижение выработки IFNг может негативно влиять на протекание иммунных реакций в стенках сосудов, ускорение атерогенеза и увеличивают риск последующих осложнений.

Ген TGFB1, его белковый продукт и полиморфизм

Ген TGFB1, локализованый у человека на хромосоме 19p13.1 и содержащий 7 экзонов, кодирует трансформирующий фактор роста в1 (TGFв1). TGFв1 является плейотропным цитокином и принадлежит к обширному суперсемейству TGFв [96, 308]. Он принимает участие в регуляции иммунного ответа, пролиферации клеток, а также в процессах эмбрионального развития, фиброзирования ткеней, и апоптоза [165]. Регуляция внеклеточной активности TGFв1 осуществляется при переходе из неактивной (латентной) в активную форму TGFв1 [51]. При тканевом повреждении происходит активация латентной формы TGFв1, осуществляемая протеазами (плазмином, матриксными металлопротеиназами) [183]. TGFв1 способствует разрешению воспалительной инфильтрации, образовавшейся в очаге повреждения. TGFв1 секретируется регуляторными T-лимфоцитами (Tr) и является антагонистом провоспалительных цитокинов, он подавляет активность Th1-клеток, синтез провоспалительных цитокинов, адгезию лейкоцитов и миграцию нейтрофилов [76, 120, 225, 392]. Он играет важную роль в патогенезе ССЗ, в том числе в патогенезе атеросклероза (включая ИБС и ИМ), гипертонической болезни, гипертрофии миокарда и фибротических явлений в сердце [46]. В некоторых исследованиях обнаружено, что TGFв1 обладает антиатерогенным действием: он подавляет воспаление и усиливает стабилизацию атеросклеротической бляшки.

В экспериментах на мышах показано, что он способен снижать экспрессию аполипопротеина Е, таким образом, подавляя развитие и прогрессирование атеросклероза [147]. Протективное действие TGFв1 проявляется в угнетении адгезии лейкоцитов к эндотелию [348], подавлении выработки макрофагами повреждающих окислительных радикалов и NO-метаболитов. Показана нейропротективное действие TGFв1, связанное со стабилизацией нейронального кальциевого гомеостаза [302], что приводит к значительному торможению свободнорадикального повреждения, замедлению процессов некроза и апоптоза [119].

С другой стороны, показано, что высокий уровень TGFв1 ассоциирован со стенозом сосудов и тромбообразованием, усиливает фиброз и подавляет регенерацию эндотелия [202, 222], являясь, таким образом, проатерогенным фактором. В частности, он может способствовать раннему образованию липидного пятна, стимулируя продукцию экстрацеллюлярного матрикса и ингибируя его деградацию [46].

Исходя из этих данных о роли TGFв1, можно предположить, что в зависимости от совокупности других факторов неблагоприятным может оказаться как низкий, так и высокий уровень TGFв1, и, соответственно, носительство альтернативных аллелей полиморфных участков гена, влияющих на уровень продукции белка.

Для гена TGFB1 известно несколько аллельных полиморфизмов. Наиболее изученными из описанных SNP на данный момент являются: -509C>T, 869T>C и 915G>C.

Полиморфный участок -509C>T гена TGFB1 расположен в -509 положении промоторной области гена. Показано, что генотип TGFB1*?509T/T этого SNP ассоциирован с повышением в плазме уровня TGFв1 [349]. В исследовании Oda et al. показано, что аллель TGFB1*?509T является фактором риска атеросклероза мозговых артерий у японцев в пожилом возрасте [286]. Исследование на шведской популяции выявило связь аллеля TGFB1*?509C с повышенным уровнем ЛПНП у девочек подросткового возраста [284].

Полиморфный участок 869T>C гена TGFB1 расположен в положении 869 первого экзона и обуславливает замену Leu на Pro (10 кодон белка-предшественника). Показано, что данный полиморфизм влияет на концентрацию мРНК TGFв1 в мононуклеарных клетках периферической крови и уровень TGFв1 в сыворотке крови [355, 408]. Кроме того, опыты in vitro показали, что замена Pro10Leu приводит к значительному снижению выработки TGFв1 в клеточной линии HeLa [116]. Аллель TGFB1*869T ассоциирован с повышенным уровнем ЛП у больных ИМ в японской популяции [408], а также у больных ИМ молодых итальянцев [106], но в соответствующих исследованиях в других этнических группах ассоциации найдено не было [344, 357, 389].

Полиморфный участок 915G>C гена TGFB1 расположен в положении 915 первого экзона и обуславливает замену Arg (Аргинин) на Pro (Пролин) в 25 кодоне белка-предшественника. Показано, что аллель TGFB1*915C ассоциирован с низкой выработкой TGFB1 in vitro и in vivo [56, 57, 118]. В исследовании Wang Y. et al. была показана ассоциация генотипа TGFB1*915G/G с мерцательной аритмией, являющейся одним из факторов ИИ [390]. Перечисленные полиморфные участки гена были выбраны для анализа в нашем исслеовании.

Таким образом, можно видеть, что для некоторых генов, таких как MTHFR, ALOX5AP, APOE, PDE4D и ACE, была выявлена и подтверждена с использованием различных подходов ассоциация с развитием ИИ.

Несмотря на обширный экспериментальный материал, посвященный иммунно-воспалительному статусу пациентов с ИИ, роль генов воспаления в развитии инсульта изучена недостаточно, и многие вопросы остаются открытыми. Учитывая неоднозначность и противоречивость полученных ранее результатов, перспективным на сегодняшний день представляется анализ выборок больных определенной этнической принадлежности с ИИ, четко дифференцированным от других клинических форм инсульта. Также, помимо генетических, необходимо учитывать вклад в развитие ИИ других факторов риска, в частности, курения. Важную роль при анализе предрасположенности к ИИ могут играть такие немодифицируемые факторы риска как пол и возраст. Тщательный подход к формированию выборок позволит сделать более точные выводы о вкладе исследуемых генов в развитие ИИ.

К настоящему времени сложилось четкое представление, что генетической основой полигенных заболеваний, таких как ИИ, является совместный вклад ряда независимо действующих или взаимодействующих генов, причем вклад каждого из них по отдельности может быть невелик или вовсе не проявляться. Поэтому представляется перспективным выявление сочетаний полиморфных вариантов генов, участвующих в формировании индивидуального риска, которые можно будет использовать для проведения генетических скрининг-тестов у лиц из групп риска по развитию сосудистых заболеваний мозга. Исходя из этого, выполненная диссертационная работа была направлена на комплексный анализ вклада различных генов в развитие ИИ.

2. Материалы и методы

2.1 Объект исследования

В данном ретроспективном исследовании методом «случай-контроль» использовали образцы из коллекции крови и геномной ДНК 200 больных ишемическим инсультом (ИИ) русской этнической принадлежности, ср. возраст - 64.1 ± 10.8 лет. Из них 123 мужчины (ср. возраст - 61.2 ± 9.8) и 77 женщин (ср. возраст - 68.7 ± 10.7).

Все индивиды, вошедшие в исследование, были обследованы на кафедре неврологии и нейрохирургии Российского государственного медицинского университета на базе 12-го и 13-го неврологических отделений ГКБ №1 им. Н.И.Пирогова. Во всех случаях диагноз «ишемический инсульт» был подтвержден результатами КТ и/или МРТ. Через 3-5 дней после прекращения инфузионной терапии (10-14 дни заболевания) у больных ИИ определяли уровень фибриногена в плазме венозной крови (г/л) по методу Рутберга и агрегационную активность тромбоцитов по методу G. Born в модификации В.А. Люсова и Ю.Б. Белоусова.

Изучались процент изменения оптической плотности плазмы под воздействием адреналина (А тр), размер агрегатов (D агр) и скорость агрегации тромбоцитов ( ?). Взятие крови в количестве 4,5 мл (консервант - 0,5 мл цитрата натрия) осуществлялось из локтевой вены методом свободного вытекания в 900 - 1000 часов утра. Интервал между взятием крови и исследованием агрегации составлял 30-40 мин. Те же показатели определяли для контрольной группы при заборе крови.

Контрольная группа состояла из 146 русских без анамнестических и диагностических указаний на стойкие и преходящие нарушения мозгового кровообращения, ср. возраст - 61.8 ± 12.3 лет. Из них 83 мужчины (ср. возраст - 57.1 ± 11.9 лет) и 63 женщины (ср. возраст - 63.2 ± 14.2 лет). От всех больных или их родственников, а также индивидов контрольной группы получено информированное согласие на проведение исследования.

2.2 Использованные реактивы

В работе использовали Taq-полимеразу и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (ЗАО "Силекс", Россия); эндонуклеазы рестрикции, олигонуклеотиды и маркер молекулярной массы ДНК pUC19/Msp I (НПО "СибЭнзим", Россия); протеиназу K, SDS (додецилсульфат натрия) ("AppliChem", Германия); моноклональные антитела к Taq полимеразе, Taq-Start (АО"Мона", Россия); ЭДТА (этилендиаминтетраацетат) ("Merck", Германия); Трис, NP-40 ("Sigma", США); агароза ("Pancreac", Испания); акриламид, бромид этидия, DMSO (диметилсульфоксид) ("Fluka", Швейцария); N,N'-метиленбисакриламид, TEMED (N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин), бромфеноловый синий, ксиленцианол, в-SH (в-меркаптоэтанол) ("BioRad", США); персульфат аммония ("Promega", США), Tween 20, Triton X-100 ("Ferak", Германия). Остальные реактивы категории о.с.ч. получали из отечественных фирм.