Полиморфизм генов, белковые продукты которых играют роль в развитии воспаления, при ишемическом инсульте

2.3 Выделение геномной ДНК из периферической крови

Для получения ДНК необходимой чистоты и достаточного молекулярного веса применяли модифицированный метод выделения ДНК из крови с использованием экстракции смесью фенол-хлороформ [331].

1) В качестве образца брали 5 мл венозной крови, добавляли ЭДТА, pH 8.0, до 25 мМ и замораживали при ?20оС.

2). После размораживания образец смешивали с 8 мл раствора Т20Е5 (20 мМ Трис-HCl pH 7.5, 5 мМ ЭДТА) и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре.

3) Супернатант тщательно удаляли, добавляли 4-5 мл Т20Е5, осадок ресуспендировали, затем доводили объем раствора до 10 мл Т20Е5, перемешивали переворотом и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре.

4) Повторяли дважды предыдущий этап.

5) Ресуспендировали осадок в 5 мл Т20Е5.

6) Добавляли 150 мкл 10% SDS и 25 мкл протеиназы К (20 мг/мл).

7) Инкубировали 3 часа при 65оС

8) Добавляли равный объем фенола (5 мл). Центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю фазу в чистую пробирку. Добавляли равный объем фенол-хлороформа (5 мл). Центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Повторяли процедуру 2 раза.

9) Отбирали верхнюю фазу и добавляли по 4 мл хлороформа, центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю фазу.

10) К каждому образцу добавляли 1/12 объема 6 M NaCl и два объема 96% этилового спирта.

11) После преципитации ДНК проводили центрифугирование при 3000 об/мин 10 мин при комнатной температуре, отбирали этанол и подсушивали осадок на воздухе.

12) Осадок ресуспендировали в 100 мл Т10Е1 (10 мМ Трис-HCl, pH7.5, 1 мМ ЭДТА).

13) Растворяли ДНК в 400 мл Н2О.

Полученную пробу ДНК хранили при ?4 оС.

2.4 Геномное типирование

Геномное типирование проводили методами, основанными на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Применяли метод анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов продуктов ПЦР (метод ПЦР-ПДРФ), где олигонуклеотидная замена входит в состав сайта узнавания специфической рестриктазы, и генотипы определяют по наличию или отсутствию фрагментов рестрикции; и метод ПЦР с использованием аллелеспецифических праймеров (метод ПЦР-SSP), где генотипы определяют по наличию или отсутствию продукта амплификации в случае праймера, специфического для определенного аллеля. Геномного типирования полиморфных участков 41G>A и 87C>T гена PDE4D проводили методом ПЦР в реальном времени (Real-time PCR). Все праймеры сконструированы с помощью пакетов программ Vector NTI 7.1 и Primo [421]. В каждый эксперимент включали отрицательный контроль, где ДНК-матрицу для ПЦР заменяли dH2O. ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (АО «ДНК Технология», Россия) или Genius (Techne, Великобритания), ПЦР в реальном времени проводили в амплификаторе Mx3000P («Stratagene», США).

Геномное типирование полиморфного участка 49A>G в гене CTLA4

Для анализа однонуклеотидной замены A на G в 49-м положении первого экзона гена CTLA4, обуславливающей замену треонина на аланин в лидерном пептиде, фрагмент ДНК длиной 152 п.н., содержащий этот полиморфный участок, амплифицировали с использованием праймеров: 5'-AAGGCTCAGCTGAACCTGGT-3' и 5'-CTGCTGAAACAAATGAAACCC-3'. Амплификационная смесь в объеме 10 мкл содержала 0.05 М KCl, 0.01 М ТрисHCl (pH 9.0), 5% формамид, 1.5 мМ MgCl2, по 0.2 мМ каждого dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), по 5 пкмоль каждого праймера, 0.5 е.а. Taq-полимеразы и 100-200 нг ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло.

Программа амплификации:

1) 94°С - 5 мин

2) 30 циклов: 94°C - 1 мин; 58°С - 1 мин; и 72°С - 1 мин;

3) 72°С - 7 мин.

ПЦР проводили в амплификаторе Genius (Techne, Великобритания). Наличие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2% агарозном геле в присутствии бромида этидия. (1 мкг/мл). В качестве буфера для электрофореза использовали 1хTBE: 0.89 М Трис-борат; 0.89 М борная кислота; 0.002 М ЭДТА, pH 8.0; состав 5х буфера для нанесения проб: 30% глицерин, по 0.025% бромфенолового синего и ксиленцианола. В качестве маркера молекулярной массы использовали ДНК плазмиды pUC19, обработанную рестриктазой MspI. Анализ гелей проводили в системе видеодокументации гелей (UVP ImageSystem). По 5 мкл полученного продукта амплификации обрабатывали 5 ед. рестриктазы PspEI в течение 4 часов в реакционном буфере, поставляемом производителем фермента, при 37°С. Продукты рестрикции разделяли методом электрофореза в 3%-ном агарозном геле, содержащем бромид этидия, и визуализировали в проходящем УФ-свете. Наличие рестрицированного фрагмента длиной 130 п.н. свидетельствовало о присутствии аллеля A, наличие интактного фрагмента длиной 152 п.н. - аллеля G. Пример анализа данного полиморфного участка приведен на рис. 1.

Рисунок 1. Пример анализа полиморфизма 49A>G гена CTLA4.

a. схема набора рестрикционных фрагментов, характеризующих рассматриваемый полиморфизм.

b. Фрагменты рестрикции после электрофореза в 3%-ом агарозном геле. М- маркер молекулярной массы (ДНК pUC19, обработанная эндонуклеазой рестрикции Msp1); cтрелками показано положение фрагментов указанной длины (п.н.); 1-9 - образцы ДНК: 2, 3, 7 - гомозиготы G/G; 4, 8 - гомозиготы A/A; 1, 5, 6, 9 - гетерозиготы A/G; «-» - отрицательный контроль.

Геномное типирование полиморфных участков 41G>A и 87C>T гена PDE4D

Геномное типирование полиморфных участков 41G>A и 87C>T гена PDE4D проводили методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (технология TaqMan). Смесь для амплификации объемом 25 мкл содержала 2,5 мкл 10-кратного ПЦР-буфера; 2,5 мкл 25 мМ MgCl2, 2,5 мкл 2,5 мМ раствора каждого dNTP; 10 пМ каждого праймера; 4 пМ каждого зонда; 0,25 ед.HotTaq-полимеразы; 0.1-0.2 мкг геномной ДНК и деионизированной воды до 25 мкл.

Для анализа полиморфного участка 41G>A гена PDE4D (rs152312) использовали праймеры: 5'-CCACTAACGCGTCATCTAGCATTA-3' (прямой) и 5'-GAGCCTATTATATGGTGACTGCTCATT-3' (обратный), а также зонды PDE4D-41-A 5'-TCCCTCCTGACAATT-3' (краситель - FAM, тушитель - BHQ1) и PDE4D-41-G 5'-CCCTCCCGACAATT-3' (краситель - ROX, тушитель - BHQ2).

Для анализа полиморфного участка 87C>T гена PDE4D (rs2910829) использовали праймеры: 5'-GTGCTTGCTGGACATTCATAACATC-3' (прямой) и 5'-TGTTTAAAGATGAGGAAGAATAATGGATGCA-3' (обратный), а также зонды 3. PDE4D-87-C 5'-CTA GTT TGG GAA ATA TTG TGT-3' (краситель - FAM, тушитель - BHQ1) и PDE4D-87-T 5'-TCT AGT TTG GGA AAT GTT GTG T-3' (краситель - ROX, тушитель - BHQ2). Все реагенты фирмы "Синтол".

Программа амплификации:

1) 60єС - 30 сек

2) 95єС - 10 мин

3) 40 циклов: 95єС - 15 сек, 56°С (для 41G>A) или 58°С (для 87C>T) - 50 с

4) 25єС - 2 мин

ПЦР проводили в амплификаторе Mx3000P фирмы «Stratagene».

Геномное типирование полиморфного участка ?590C>T гена IL4

Для анализа однонуклеотидной замены C на T гена IL-4 фрагмент ДНК длиной 156 п.н., содержащий этот полиморфный участок, амплифицировали с использованием аллелеспецифических праймеров:

5'-CTAAACTTGGGAGAACATTGTC-3' (прямой С),

5'-TTCTTACAACACAAAATCAAATCA-3' (прямой T)

5'-AGTACAGGTGGCATCTTGGAAA-3' (общий обратный).

Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 70 мМ Tris-HCl (pH 9,5), 20 мМ (NH4)2SO4, 1 мМ MgCl2, 0,025% Tween 20, 0,025% NP-40, праймеры для выявления аллелей C или T (по 5 пмоль каждого), по 0,2 мМ каждого dNTP, 0,5 ед. Taq-полимеразы и 100-200 нг геномной ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло. ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (АО "ДНК Технология", Россия).

Программа амплификации:

1) 95°С - 5 мин

2) 10 циклов: 95°С - 1мин; 60°С - 1мин; 72°С - 1мин

3) 20 циклов: 95°С - 30 с; 56°С - 50 с; 72°С - 50 с.

Наличие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. В качестве маркера молекулярной массы использовали плазмиду pUC19, обработанную рестрикционной эндонуклеазой MspI. Пример анализа данного полиморфного участка приведен на рис. 2, где каждому образцу соответствуют две дорожки.

Рисунок 2. Пример анализа полиморфизма -590C>T гена IL4.

Фрагменты ДНК после электрофореза в 2%-ом агарозном геле. М- маркер молекулярной массы (ДНК pUC19, обработанная эндонуклеазой рестрикции Msp1); cтрелкой показано положение фрагментов указанной длины (п.н.); 1-4 -образцы ДНК (каждому образцу соответствует две дорожки, по одной для каждого аллеля): 1 - гетерозигота C/T; 2 - гомозигота T/T; 3, 4 - гомозиготы С/С; «-» - отрицательный контроль.

Геномное типирование полиморфного участка ?308A>G гена TNF

Для анализа однонуклеотидной замены A на G в положении ?308 гена TNF, фрагмент ДНК длиной 230 п.н., содержащий этот полиморфный участок, амплифицировали с использованием аллелеспецифических праймеров:

5'-AATAGGTTTTGAGGGGCATGA-3' (прямой A),

5'-ATAGGTTTTGAGGGGCATGG-3' (прямой G),

5'-CATGAGCTCATCTGGAGGAA-3' (обратный).

Для амплификации фрагмента длиной 577 п.н., служащего внутренним положительным контролем амплификации, использовали общий прямой праймер 5'-AGTCTCCGGGTCAGAATGAA-3'. Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 700 мМ Tris-HCI pH 9.5, 200 мМ (NH4)2SO4, 10 мМ MgCl2, 0. 25% Tween 20, 0.25% NP-40, праймеры для выявления аллеля C (по 5 пмоль каждого), 0,2 мМ dNTP, 0,5 ед. Taq полимеразы (Sileks, Россия), 0,2 мкг моноклональных антител к активному центру Taq полимеразы и 100-200 нг геномной ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло.

Программа амплификации:

1) 95°С - 5 мин

2) 30 циклов: 92°С - 50 c, 64°С - 1 мин 30 с, 72°С - 1 мин

3) 72°С - 7 мин

ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (АО "ДНК Технология", Россия).

Наличие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия (1 мкг/мл). В качестве буфера для электрофореза использовали 1хTBE: 0,89 М Tris-борат; 0,89 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА, pH 8.0; состав 5х буфера для нанесения проб: 50% глицерин, по 0.025% бромфенолового синего и ксилолцианола. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК плазмиды pUC19, обработанную рестриктазой MspI. Анализ гелей проводили в системе видеодокументации гелей (UVP ImageSystem). Пример анализа данного полиморфного участка приведен на рис. 3, где каждому образцу соответствует две дорожки.

Рисунок 3. Пример анализа полиморфизма -308A>G гена TNF.

Фрагменты ДНК после электрофореза в 2%-ом агарозном геле. М- маркер молекулярной массы (ДНК pUC19, обработанная эндонуклеазой рестрикции Msp1); cтрелками показано положение фрагментов указанной длины (п.н.); 1-4 -образцы ДНК (каждому образцу соответствует две дорожки, по одной для каждого аллеля): 1 - гомозигота A/A; 2 - гомозигота G/G; 3, 4 - гетерозиготы G/A; «-» - отрицательный контроль.

Геномное типирование полиморфного участка 252А>G в гене LTA

Геномное типирование полиморфного участка 252А>G гена LTA проводили методом анализа ПДРФ рестриктазы NcoI в фрагменте ДНК длиной 419 п.н., амплифицированом c использованием праймеров:

5'-TGCCCGTGCTTCGTGCTTTG-3' (прямой),

5'- GGTGTCATGGGGAGAACCTG -3' (обратный).

Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мM Tris-HCl, pH 9,5, 50 мM KCl, 1,5 мM MgCl2, 0,5мM dNTP, 0,5 ед. Taq-полимеразы, праймеры в количестве 10 пмоль каждый и 100 - 200 нг геномной ДНК.

Программа амплификации:

45 циклов: 1 мин - 92°С; 1 мин 30 с - 60°С; 2 мин - 72°С.

Далее 5 мкл продукта амплификации обрабатывали 5 ед. рестриктазы NcoI (СибЭнзим, Россия) в течение 4 часов и анализировали с помощью электрофореза в 3%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Изображение получали с помощью UVP ImageSystem. Продукты рестрикции разделяли методом электрофореза в 3%-ном агарозном геле, содержащем бромид этидия, и визуализировали в проходящем УФ-свете. Наличие рестрицированных фрагментов длиной 217 п.н. и 202 п.н. свидетельствовало о присутствии аллеля G, наличие интактного фрагмента длиной 419 п.н. - аллеля A. Пример анализа данного полиморфного участка приведен на рис. 4.

Рисунок 4. Пример анализа полиморфизма 252А>G в гене LTA.

Фрагменты рестрикции после электрофореза в 3%-ом агарозном геле. М- маркер молекулярной массы (ДНК pUC19, обработанная эндонуклеазой рестрикции Msp1); cтрелками показано положение фрагментов указанной длины (п.н.); 1-4 - образцы ДНК: 2 - гомозигота А/А; 3 - гомозигота G/G; 1,4 - гетерозиготы A/G; «-» - отрицательный контроль.

Геномное типирование полиморфного участка в положении ?174G>C промоторной области гена IL6

Для анализа однонуклеотидной замены G на С в промоторной области гена IL6, фрагмент ДНК длиной 230 п.н., содержащий этот полиморфный участок, амплифицировали с использованием прямых праймеров: 5'-ATGCCAAGTGCTGAGTCACTA-3' и 5'-TCGAGGGCAGAATGAGCCTC-3'. Амплификационная смесь в объеме 10 мкл содержала 70 мМ Трис-HCl pH 9.0, 20 мМ (NH4)2SO4, 1.0 мМ MgCl2, 0.025% Tween 20, 0.025% NP-40, по 0.2 мМ каждого dNTP, по 5 пкмоль каждого праймера, 0.5 е.а. Taq-полимеразы (Sileks, Россия) и 100-200 нг ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло.

Программа амплификации:

1) 94°С - 5 мин

2) 30 циклов: 94°C - 1 мин; 58°С - 1 мин; и 72°С - 1 мин;

3) 72°С - 7 мин.

ПЦР проводили в амплификаторе Genius (Techne, Великобритания). Наличие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2% агарозном геле в присутствии бромида этидия. (1 мкг/мл). В качестве буфера для электрофореза использовали 1хTBE: 0.89 М Трис-борат; 0.89 М борная кислота; 0.002 М ЭДТА, pH 8.0; состав 5х буфера для нанесения проб: 30% глицерин, по 0.025% бромфенолового синего и ксиленцианола. В качестве маркера молекулярной массы использовали ДНК плазмиды pUC19, обработанную рестриктазой MspI. По 5 мкл полученного продукта амплификации обрабатывали 5 ед. рестриктазы NlaIII (Biolabs) в течение 5 часов в реакционном буфере, поставляемом производителем фермента, при 37°С. Продукты рестрикции разделяли методом электрофореза в 3%-ном агарозном геле, содержащем бромид этидия, и визуализировали в проходящем УФ-свете. Наличие рестрикционных фрагментов длиной 121 п.н. и 109 п.н. свидетельствовало о присутствии аллеля C, наличие интактного фрагмента длиной 230 п.н. - аллеля G. Пример анализа данного полиморфного участка приведен на рис. 5.



Рисунок 5. Пример анализа полиморфизма ?174G>C гена IL6.

a. схема набора рестрикционных фрагментов, характеризующих рассматриваемый полиморфизм.

b. Фрагменты рестрикции после электрофореза в 3%-ом агарозном геле. М- маркер молекулярной массы (ДНК pUC19, обработанная эндонуклеазой рестрикции Msp1); cтрелками показано положение фрагментов указанной длины (п.н.); 1-9 - образцы ДНК: 1, 5, 7 - гомозиготы G/G; 2, 3 - гомозиготы C/C; 4, 8, 9 - гетерозиготы G/C; «-» - отрицательный контроль. ген ишемический инсульт кровь

Геномное типирование полиморфного участка 874A>T гена IFNG

Для анализа однонуклеотидной замены A на T в положении 874 гена IFNG фрагмент ДНК длиной 262 п.н., содержащий этот полиморфный участок, амплифицировали с использованием аллелеспецифических праймеров: 5'-TTCTTACAACACAAAATCAAATCA-3' (прямой A), 5'-TTCTTACAACACAAAATCAAATCT-3' (прямой T), 5'-GTTGCTCACTGGGATTTTGG-3' (обратный). Для амплификации фрагмента длиной 398 п.н., служащего внутренним положительным контролем амплификации, дополнительно использовали общий обратный праймер 5'-TCAACAAAGCTGATACTCCA-3'. Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 700 мМ Tris-HCl pH 9,5, 200 мМ (NH4)2SO4, 10 мМ MgCl2, 0,25% Tween 20, 0,25% NP-40, праймеры для выявления аллеля C (по 5 пмоль каждого), 0,2 мМ dNTP, 0,5 ед. Taq полимеразы (Sileks, Россия), 0,2 мкг моноклональных антител к активному центру Taq полимеразы и 100-200 нг геномной ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло.Программа амплификации:

1) 95°С - 5 мин

2) 10 циклов: 95°С - 1мин; 62°С - 1мин; 72°С - 1мин.

3) 20 циклов: 95°С - 30 с; 56°С - 50 с ; 72°С - 50 с.

ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (АО "ДНК Технология", Россия).

Наличие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия (1 мкг/мл). В качестве буфера для электрофореза использовали 1хTBE: 0,89 М Tris-борат; 0.89 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА, pH 8.0; состав 5х буфера для нанесения проб: 50% глицерин, по 0,025% бромфенолового синего и ксилолцианола. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК плазмид pUC19, обработанную рестриктазой MspI. Анализ гелей проводили в системе видеодокументации гелей (UVP ImageSystem). Пример анализа данного полиморфного участка приведен на рис. 6.

Рисунок 6. Пример анализа полиморфизма 874A>T гена IFNG. Фрагменты ДНК после электрофореза в 2%-ом агарозном геле.

М- маркер молекулярной массы (ДНК pUC19, обработанная эндонуклеазой рестрикции Msp1); cтрелками показано положение фрагментов указанной длины (п.н.); 1-4 -образцы ДНК (каждому образцу соответствует две дорожки, по одной для каждого аллеля): 1, 3 - гомозиготы T/T; 2 - гомозигота A/A; 4 - гетерозигота A/T, «-» - отрицательный контроль.

Геномное типирование полиморфного участка ?509С>Т в гене TGFB1

Для анализа однонуклеотидной замены C на T в положении ?509 промоторной области гена TGFB1 фрагмент ДНК длиной 265 п.н., содержащий этот полиморфный участок, амплифицировали с использованием аллелеспецифических праймеров: 5'-GGGCAACAGGACACCTGAA-3' (SSP A), 5'-GGGCAACAGGACACCTGAG-3' (SSP G) и общего праймера 5'-AAGGCATGGCACCGCTTCTG-3'. Амплификационная смесь в объеме 10 мкл содержала70 мМ Трис-HCI pH 9.0, 20 мМ (NH4)2SO4, 1.0 мМ MgCl2, 0.025% Tween 20, 0.025% NP-40, по 5 пкмоль каждого праймера, 0.2 мМ dNTP, 0.5 ед. Taq-полимеразы и 100-200 нг ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло.

Программа амплификации:

1) 95°С - 5 мин

2) 10 циклов: 95°С - 1 мин; 64°С - 1 мин; 72°С - 1 мин

3) 20 циклов: 95°С - 30 сек; 58°С - 50 сек; 72°С - 50 сек

ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (АО "ДНК Технология", Россия)

Наличие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2% агарозном геле в присутствии бромида этидия.

Пример анализа данного полиморфного участка приведен на рис. 7, где каждому образцу соответствует две дорожки.

Рисунок 7. Пример анализа полиморфизма -509C>T гена TGFB1.Фрагменты ДНК после электрофореза в 2%-ом агарозном геле.

М- маркер молекулярной массы (ДНК pUC19, обработанная эндонуклеазой рестрикции Msp1); cтрелкой показано положение фрагментов указанной длины (п.н.); 1-5 -образцы ДНК (каждому образцу соответствует две дорожки, по одной для каждого аллеля): 1 - гетерозигота С/T; 2, 4, 5 - гомозигота T/T; 3 - гомозигота С/С; «-» - отрицательный контроль.

Геномное типирование полиморфного участка 869T>C в гене TGFB1

Анализ полиморфного участка 869T>C гена TGFB1 проводили методом ПЦР-SSP. Фрагмент ДНК длиной 283 п.н., содержащий этот полиморфный участок, амплифицировали с использованием аллелеспецифических праймеров: 5'-AGCAGCGGTAGCAGCAGCA-3' (SSP T), 5'-GCAGCGGTAGCAGCAGCG-3'(SSP C) и общего праймера 5'-CTACCTTTTGCCGGGAGACC-3'. Амплификационная смесь в объеме 10 мкл содержала 70 мМ Tris-HCI pH 9.0, 20 мМ (NH4)2SO4, 1.0 мМ MgCl2, 0.025% Tween 20, 0.025% NP-40, по 5 пкмоль каждого праймера, 0.2 мМ dNTP, 0.5 ед. Taq-полимеразы и 100-200 нг ДНК, минеральное масло.

Программа амплификации:

1) 95°С - 5 мин,

2) 10 циклов: 95°С - 1 мин; 64°С - 1 мин; 72°С - 1 мин,

3) 20 циклов: 95°С - 30 с; 58°С - 50 с; 72°С - 50 с.

ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (АО «ДНК Технология», Россия). Присутствие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле в присутствии бромида этидия.

Пример анализа данного полиморфного участка приведен на рис. 8, где каждому образцу соответствует две дорожки.

Рисунок 8. Пример анализа полиморфизма 869T>C гена TGFB1.

Фрагменты ДНК после электрофореза в 2%-ом агарозном геле. М- маркер молекулярной массы (ДНК pUC19, обработанная эндонуклеазой рестрикции Msp1); cтрелкой показано положение фрагментов указанной длины (п.н.); 1-5 - образцы ДНК (каждому образцу соответствует две дорожки, по одной для каждого аллеля): 1-2 - гомозигота T/T; 3-4 - гетерозиготы C/T; 5 - гомозигота С/С; «-» - отрицательный контроль.

Геномное типирование полиморфного участка 915G>C в гене TGFB1

Анализ полиморфного участка 915G>C гена TGFB1 проводили методом ПЦР-SSP. Амплифицировали фрагмент ДНК длиной 125 п.н. с использованием аллелеспецифических праймеров: 5'-TGGTGCTGACGCCTGGCCG-3' (SSP G), 5'-TGGTGCTGACGCCTGGCCC-3'(SSP C) и общего праймера 5'-GGCGAGCCGCAGCTTGGACA-3'.. Амплификационная смесь в объеме 10 мкл содержала 70 мМ Tris-HCI pH 9.0, 20 мМ (NH4)2SO4, 1.0 мМ MgCl2, 0.025% Tween 20, 0.025% NP-40, по 5 пкмоль каждого праймера, 0.2 мМ dNTP, 0.5 ед. Taq-полимеразы и 100-200 нг ДНК, минеральное масло.

Рисунок 9. Пример анализа полиморфизма 915G>C гена TGFB1. Фрагменты ДНК после электрофореза в 2%-ом агарозном геле.

Программа амплификации:

1) 95°С - 5 мин,

2) 10 циклов: 95°С - 1 мин; 64°С - 1 мин; 72°С - 1 мин,

3) 20 циклов: 95°С - 30 с; 58°С - 50 с; 72°С - 50 с.

ПЦР проводили в амплификаторе МС16 (АО «ДНК Технология», Россия). Присутствие продуктов амплификации проверяли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле в присутствии бромида этидия.

Пример анализа данного полиморфного участка приведен на рис. 9, где каждому образцу соответствует две дорожки.

М- маркер молекулярной массы (ДНК pUC19, обработанная эндонуклеазой рестрикции Msp1); cтрелкой показано положение фрагментов указанной длины (п.н.); 1-5 - образцы ДНК (каждому образцу соответствует две дорожки, по одной для каждого аллеля): 1,2-гомозиготы G/G; 3,4 - гетерозиготы C/G; 5 - гомозигота С/С; «-» - отрицательный контроль.

2.5 Статистический анализ

У всех индивидов, составивших контрольную группу и группу больных, определяли частоты аллелей, частоты носительства аллелей и генотипов. Анализ отклонения наблюдаемых частот генотипов от равновесия Харди-Вайнберга и анализ неравновесия по сцеплению (LD) проводили с использованием свободно распространяемой программы Haploview 4.0 [423]. Сравнение частот аллелей, частот носительства аллелей и генотипов у больных ИИ и в контрольной группе проводили с помощью точного двустороннего критерия Фишера с использованием онлайн-версии программы GraphPad Instat [424]. Силу выявленных ассоциаций оценивали в значениях отношения шансов (ОШ) и его 95%-го доверительного интервала (ДИ) с использованием этой же программы. Статистически значимым считали различие сравниваемых величин при p<0.05, при условии, что значения 95% ДИ для ОШ не пересекают 1. Для сравнения концентраций фибриногена и агрегационной активности тромбоцитов в различных группах использовали непараметрический тест Манна-Уитни.

Для выявления значимой связи с заболеванием носительства сочетания аллелей/генотипов («генетических ансамблей»), содержащих n аллелей и/или генотипов (где n?1), применяли оригинальное ПО APSampler, использующее метод Монте-Карло Марковскими цепями и Байесовскую непараметрическую статистику [122, 422]. APSampler проводит также валидацию результатов работы алгоритма на основе традиционного статистического подхода, для чего в программный комплекс включена программа, которая оценивает значимость ассоциаций каждого найденного основным алгоритмом сочетания аллелей/генотипов с признаком по значениям точного критерия Фишера, ОШ и его 95%-го ДИ. В этом случае мы применяли односторонний точный критерий, поскольку программа APSampler вместе с сочетанием аллелей указывает также и знак наблюдаемой ассоциации. Различие сравниваемых частот считали значимыми при p<0.05, если значения 95% ДИ для ОШ не пересекали 1.

3. Результаты и их обсуждение

В работе проведено геномное типирование следующих полиморфных участков: 49A>G гена CTLA4 (цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный белок 4), 41G>A и 87C>T гена PDE4D (фосфодиэстераза 4D),?590C>T гена IL4 (интерлейкин 4), ?308A>G гена TNF (фактор некроза опухолей), 252G>A гена LTA (лимфотоксин б), ?174G>C гена IL6 (интерлейкин 6), 874A>T гена IFNG (интерферон г), ?509С>Т, 869T>C и 915G>C гена TGFB1(трансформирующий фактор роста в1), с последующим сравнением частот аллелей, частот носительства (встречаемости) аллелей и частот генотипов в группе пациентов с ИИ и в контрольной группе, все русские по этнической принадлежности. Для анализа были выбраны функционально значимые полиморфные участки, расположенные в кодирующей или в регуляторной областях анализируемых генов.

Возраст является существенным фактором риска мозгового инсульта, причем частота новых случаев инсульта увеличивается более чем в два раза в каждой следующей возрастной группе населения, отличающейся всего на 10 лет [27].

Исходя из предположения, что развитие инсульта в разном возрасте может быть связано с разными генетическими факторами, мы провели анализ распределения носительства аллелей и генотипов того или иного полиморфного участка у больных в зависимости от возраста развития ИИ. При этом больные ИИ были поделены на две подгруппы: лица, получившие ИИ в возрасте старше 60 лет и в возрасте моложе или равном 60 лет. Контрольная группа была разделена по возрасту на аналогичные подгруппы.

По эпидемиологическим данным у мужчин инсульт встречается значительно чаще, чем у женщин. Предположив, что это различие может определяться сцепленным с полом генетическим компонентом, мы провели сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов исследуемых полиморфных участков у больных ИИ и здоровых отдельно для мужчин и для женщин.

3.1 Анализ ассоциации полиморфных участков исследуемых генов с развитием ИИ

Анализ распределения аллелей и генотипов исследуемых полиморфных участков генов при сравнении общих групп больных ИИ и индивидов без ИИ и/или их подгрупп, сформированных в зависимости от пола и возраста, выявил значимые ассоциации с ИИ полиморфных участков ?174G>C гена IL6, 41G>A и 87C>T гена PDE4D, 874A>T гена IFNG, а также ?509С>Т и 915G>C гена TGFB1 (см. ниже).

Полиморфные участки 49A>G гена CTLA4, ?590C>T гена IL4, ?308A>G гена TNF, 252 A>G гена LTA

Для полиморфных участков 49A>G гена CTLA4,?590C>T гена IL4, ?308A>G гена TNF, 252А>G гена LTA, 869T>C гена TGFB1 не было выявлено значимых различий в частотах аллелей, частотах носительства аллелей и генотипов ни в общих группах больных ИИ и контролей (таблица 4), ни в их подгруппах.

Таблица 4. Частоты аллелей и носительства аллелей и генотипов полиморфных участков генов CTLA4, IL4, TNF, LTA у лиц русской этнической принадлежности, перенесших ИИ, в сравнении c контрольной группой той же этнической принадлежности

Полиморфный участок (N человек)	Аллели / генотипы	Больные ИИ	Группа контроля
	Аллели, число (%)
CTLA4 49A>G (200 больных ИИ, 144 индивидов контрольной группы)	A	217(54.2)	155(54)
	G	183(45.8)	133(46)
	Аллели, число (%) носителей
	A	147(73,5)	113(78)
	G	130(65)	102(71)
	Генотипы, число (%) носителей
	A/A	70(35)	42(29)
	A/G	77(38,5)	71(49)
	G/G	53(26,5)	31(22)
IL4 ?590C>T (199 больных ИИ, 141 индивид контрольной группы)	Аллели, число (%)
	С	301(75.6)	216(76.6)
	T	97(24.4)	66(23.4)
	Аллели, число (%) носителей
	C	183(91)	133(94)
	T	81(41)	58(41)
	Генотипы, число (%) носителей
	C/C	118(59)	83(59)
	C/T	65(32)	50(35)
	T/T	16(9)	8(6)
TNF ?308A>G (199 больных ИИ, 133 индивида контрольной группы)	Аллели, число (%)
	G	348(87)	234(88)
	A	50(13)	32(12)
	Аллели, число (%) носителей
	G	197(98.8)	133(100)
	A	48(24.2)	32(24)
	Генотипы, число (%) носителей
	G/G	151(75,8)	101(76)
	A/G	46(23)	32(24)
	A/A	2(1.2)	0(0)
LTA 252 A>G (200 больных ИИ, 140 индивидов контрольной группы)	Аллели, число (%)
	A	295(73.75)	211(75.3)
	G	105(26.25)	69(24.6)
	Аллели, число (%) носителей
	A	190(95)	132(94.4)
	G	95(47.5)	61(43.6)
	Генотипы, число (%) носителей
	A/A	105(52.5)	79(56.4)
	A/G	85(42.5)	53(38)
	G/G	10(5)	8(5.6)

Здесь и далее: значения р < 0.05 и OШ (95% ДИ) для этих случаев не приводятся

Отклонений распределения наблюдаемых частот генотипов всех исследуемых полиморфных участков от равновесия Харди-Вайнберга в контрольной группе не наблюдалось.

Полиморфный участок ?174G>C гена интерлейкина 6 (IL6)

Данные по частоте аллелей, частоте носительства аллелей и генотипов полиморфного участка ?174G>C гена IL6, полученные в настоящей работе, представлены в таблице 5. Выявлено, что частота аллеля IL6*-174G значимо выше, а аллеля IL6*-174С - ниже у больных ИИ в сравнении с группой контроля (p=0.037, OШ=1.39, 95%ДИ:1.02-1.91 и OШ=0.71, 95%ДИ:0.52-0.97, соответственно). Частота носительства аллеля IL6*-174G также значимо выше у больных (p=0.003, OШ=2.87, 95%ДИ:1.43-5.75). Это распространенный аллель; он встречается у 93% больных ИИ и 83% индивидов без ИИ. Полученные данные позволяют считать аллель IL6*-174G аллелем риска ИИ. Соответственно, выявлено значимое различие (p=0.003, OШ=0.34, 95%ДИ:0.17-0.69) в частоте генотипа IL6*-174C/C, которая была выше в контрольной группе.

Таблица 5. Частоты аллелей и носительства аллелей и генотипов полиморфного участка ?174G>C гена IL6 у лиц русской этнической принадлежности, перенесших ИИ, в сравнении c контрольной группой той же этнической принадлежности

Аллели / генотипы	Больные ИИ n=200	Группа контроля n=140	Значение p	OШ (95% ДИ)
Аллели, число (%)
С	141(35)	121(43)	0.037	0.71 (0.52-0.97)
G	259(65)	159(57)	0.037	1.39 (1.02-1.91)
Аллели, число (%) носителей
C	126(63,2)	96(69)	н.з.
G	186(93)	115(82)	0.003	2.87 (1.43-5.75)
Генотипы, число (%) носителей
C/C	14(7)	25(18)	0.003	0.34 (0.17-0.69)
C/G	113(56,2)	71(51)	н.з.
G/G	73(36,8)	44(31)	н.з.

При разделении группы больных ИИ и контрольной группы по гендерному признаку между подгруппами больных ИИ мужчин и мужчин из контрольной группы не было выявлено значимых различий в частоте аллелей, частоте носительства аллелей и генотипов.

Здесь и далее: н.з. - не выявлено значимых различий; OШ (95% ДИ) приведены только для значений p < 0.05 (даны жирным шрифтом)

В то же время, в подгруппе больных ИИ женщин наблюдалась в сравнении с женщинами из контрольной группы более высокая частота аллеля IL6*-174G (p=0.02, OШ=1.82, 95%ДИ: 1.12-2.97) и носительства этого аллеля (p=0.011, OШ=4.20, 95%ДИ: 1.40-12.40) и соответственно более высокая частота в контрольной группе аллеля IL6*-174C (p=0.02, OШ=0.55, 95%ДИ: 0.33-0.90) и генотипа IL6*-174C/C (p=0.011, OШ=0.23, 95%ДИ: 0.08-0.70) (таблица 6). Таким образом, выявлен половой диморфизм в распределении генотипов гена IL6 у больных ИИ и здоровых. Несмотря на меньшее количество женщин среди больных (77 человек из 200) и среди контролей (62 человек из 140), именно у женщин наблюдаются значимые ассоциации аллелей и генотипов полиморфного участка ?174G>C гена IL6 с ИИ.

Таблица 6. Частоты аллелей и носительства аллелей и генотипов полиморфного участка ?174G>C гена IL6 у лиц русской этнической принадлежности, перенесших ИИ, в сравнении c контрольной группой той же этнической принадлежности в зависимости от гендерного признака

Аллели / генотипы	Мужчины	женщины
	Больные ИИ n=123	Группа контроля n=78	Значение p	OШ (95% ДИ)	Больные ИИ n=77	Группа контроля n=62	Значение p	ОШ (95% ДИ)
Аллели, число (%)
C	91(37)	63(40)	н.з.		50(32)	58(47)	0.02	0.55(0.33-0.90)
G	145(63)	93(60)			104(68)	66(53)	0.02	1.82(1.12-2.97)
Аллели, число (%) носителей
C	82(67)	52(67)	н.з.		45(59)	44(71)	н.з.
G	114(93)	67(86)	н.з.		72(93)	48(77)	0.011	4.20(1.40-12.40)
Генотипы, число (%) носителей
C/C	9(7)	11(14)	н.з.		5(7)	14(23)	0.011	0.23(0.08-0.70)
C/G	73(59)	41(53)			40(52)	30(48)	н.з.
G/G	41(34)	26(33)	н.з.		32(41)	18(29)	н.з.

Больные ИИ были разделены на две подгруппы: лица, перенесшие ИИ в возрасте старше 60 лет и моложе или равном 60 лет. При сравнении с лицами контрольной группы тех же возрастных категорий у пациентов в группе старше 60 лет выявлена позитивная ассоциация с ИИ носительства аллеля IL6*-174G (p=0.003, OШ=3.80, 95%ДИ: 1.60-9.20) и негативная - генотипа IL6*-174C/C (p=0.003, OШ=0.26, 95%ДИ: 0.11-0.62) (таблица 7).

Таким образом, результаты, полученные для общих выборок больных ИИ и контрольных индивидов, находятся в полном соответствии с данными для подгрупп, разделенных по полу и возрасту. Во всех случаях более распространенный аллель IL6*-174G является аллелем риска ИИ. При этом наблюдаемые для общей группы больных ИИ и контрольной группы различия в частотах аллелей и генотипов полиморфного участка ?174G>C гена IL6 обусловлены в большей степени генетическим статусом женщин, а не мужчин, и проявляются более отчетливо в возрастной подгруппе старше 60 лет.

При всех типах анализа носительство аллеля IL6*-174G у русских является фактором риска ИИ с довольно высокими значениями ОШ - от 2.80 до 4.20.

Аналогичные результаты были получены для других европеоидов: итальянцев [127, 299], белых североамериканцев [192] и австрийцев [148]. Однако, в большинстве исследований не наблюдали ассоциации полиморфных участков гена IL6 с ИИ, сравнивая общую группу больных с контрольной группой [44, 59, 93, 220], хотя в некоторых из них ассоциация была выявлена при разбиении больных на различные подгруппы, например, по клиническим и лабораторным признакам, по субтипу инсульта и т.д.

В английском исследовании Rothwell P.M. выявил ассоциацию генотипа IL6*-174G/G с бессимптомным атеросклерозом сонных артерий [320], одним из ранних факторов риска развития сердечно-сосудистых патологий, в частности, ИИ. Одако, согласно исследованию Tso et al., проведенному у американцев, с бессимптомным атеросклерозом сонных артерий ассоциирован генотип IL6*-174C/C [372].

Таблица 7. Частоты аллелей и носительства аллелей и генотипов полиморфного участка ?174G>C гена IL6 у лиц русской этнической принадлежности, получивших ИИ в возрасте ? 60 лет и >60 лет, в сравнении c контрольной группой той же этнической принадлежности тех же возрастных категорий

Аллели / генотипы	лица в возрасте моложе или равном 60 лет	лица старше 60 лет
	Больные ИИ n=67	Группа контроля n=67	Значение p	ОШ (95% ДИ)	Больные ИИ n=133	Группа контроля n=73	Значение p	ОШ (95% ДИ)
Аллели, число (%)
C	46(34)	56(39)	н.з.		95(36)	65(44)	н.з.
G	88(90)	78(61)	н.з.		171(64)	81(56)	н.з.
Аллели, число (%) носителей
C	41(62)	47(72)	н.з.		86(65)	49(67)	н.з.
G	62(94)	58(81)	н.з.		124(93)	57(78)	0.003	3.80(1.60-9.20)
Генотипы, число (%) носителей
C/C	5(6)	9(19)	н.з.		9(7)	16(22)	0.003	0.26(0.11-0.62)
C/G	36(56)	38(53)			77(58)	33(45)	н.з.
G/G	26(38)	20(28)	н.з.		47(35)	24(33)	н.з.

Данных об исследовании в русской популяции ассоциации полиморфных вариантов гена IL6 с развитием ИИ в литературе мы не обнаружили.

Полиморфные участки 41G>A и 87C>T гена фосфодиэстеразы 4D (PDE4D)

Данные по частоте аллелей, носительству аллелей и генотипов полиморфных участков SNP41G>A и SNP87C>T гена PDE4D, полученные в работе, представлены в таблицах 8 и 9. Значения р, характеризующие различия в частоте носительства аллеля PDE4D*41G и генотипа PDE4D*41А/A достигали уровня значимости (p=0.049), однако значения ДИ при ОШ в обоих случаях пересекали 1 (OШ=0.15 , 95%ДИ: 0.02-1.17 и OШ= 6.78, 95%ДИ: 0.85-54.20, соответственно) (таблица 8). В то же время, частоты носительства аллеля PDE4D*87C (p=0.048, OШ=1.60, 95%ДИ:1.02-2.52) и генотипа PDE4D*87T/T (p=0.048, OШ=0.62 , 95%ДИ: 0.40-0.98) значимо различались у больных ИИ и в контрольной группе по обоим критериям (таблица 9); аллель риска PDE4D*87C встречался у 72% больных ИИ и у 62% индивидов контрольной группы.

При разделении группы больных ИИ и контрольной группы по гендерному признаку между подгруппами мужчин и женщин не было выявлено значимых различий в частоте аллелей, частоте носительства аллелей и генотипов обоих полиморфных участков.

Таблица 8. Частоты аллелей и носительства аллелей и генотипов полиморфного участка 41G>A гена PDE4D у лиц русской этнической принадлежности, перенесших ИИ, в сравнении c контрольной группой той же этнической принадлежности

Аллели / генотипы	Больные ИИ n=200	Группа контроля n=145	Значение p	ОШ (95% ДИ)
Аллели, число (%)
G	350(87,5)	265(91,4)	н.з.
A	50(12,5)	25(8,6)	н.з.
Аллели, число (%) носителей
G	191(95,5)	144(99,31)	0.049	0.15 (0.02-1.17)
A	41(20,5)	24(16,55)	н.з.
Генотипы, число (%) носителей
G/G	159(79,5)	121(83,45)	н.з.
A/G	32(16)	23(15,86)	н.з.
A/A	9(4,5)	1(0,69)	0.049	6.78 (0.85-54.20)

Таблица 9. Частоты аллелей и носительства аллелей и генотипов полиморфного участка 87C>T гена PDE4D у лиц русской этнической принадлежности, перенесших ИИ, в сравнении c контрольной группой той же этнической принадлежности

Аллели / генотипы	Больные ИИ n=200	Группа контроля n=146	Значение p	ОШ (95% ДИ)
Аллели, число (%)
T	217(54,25)	174(59,6)	н.з.
C	183(45,75)	118(40,4)	н.з.
Аллели, число (%) носителей
T	161(80,5)	118(80)	н.з.
C	144(72)	90(62)	0.048	1.6 (1.02-2.52)
Генотипы, число (%) носителей
T/T	56(28)	56(38)	0.048	0.62 (0.40-0.98)
C/T	105(52,5)	62(42)	н.з.
C/C	39(19,5)	28(20)	н.з.

Было также проведено сравнение частот аллелей, носительства аллелей и генотипов SNP41G>A и SNP87C>T гена PDE4D у больных ИИ и контрольной группой в разных возрастных группах. У пациентов, перенесших ИИ в возрасте не старше 60 лет частота аллеля PDE4D*41A значимо выше, а аллеля PDE4D*41G - ниже у больных ИИ в сравнении с группой контроля того же возраста (p= 0.0063, OШ= 1.54, 95%ДИ: 1.20-1.98, и OШ= 0.64, 95%ДИ: 0.50-0.83), также нами была выявлена положительная ассоциация с ИИ носительства аллеля PDE4D*41A (p=0.015, OШ=1.58, 95%ДИ: 1.15-2.2) и негативная ассоциация генотипа PDE4D*41G/G (p= 0.015, OШ= 0.63, 95%ДИ: 0.45-0.86) (таблица 10). Таким образом, мы наблюдали, что у пациентов, получивших ИИ в возрасте до 60 лет включительно, аллель PDE4D*41A является значимым аллелем риска ИИ, хотя в общих группах больных ИИ и контролей различия в частоте носительства этого аллеля не достигали уровня значимости по критерию значений ДИ при ОШ. Что касается полиморфного участка SNP87C>T гена PDE4D, то при сравнении частот аллелей, носительства аллелей и генотипов у лиц, получивших ИИ в возрасте старше 60 лет или 60 лет и младше, с лицами контрольной группы тех же возрастных категорий значимых различий выявлено не было.

Наши данные по анализу ассоциации полиморфных участков SNP41G>A и SNP87C>T гена PDE4D с ИИ в целом находятся в хорошем соответствии с результатами, полученными также на русской популяции, но для больных с диагнозом «острый инсульт» [10]. В этой работе выявлена ассоциация с заболеванием генотипов PDE4D*41A/A и PDE4D*41A/G, однако для полиморфного участка SNP87C>T гена PDE4D не наблюдали значимых различий. Как упоминалось выше выбранные полиморфные участки SNP87C>T и SNP41G>A гена PDE4D относятся к гаплоблокам A и B, соответственно, кроме того, исследования на различных популяциях не выявили между ними сцепления [214, 350, 354].

Полученные данные согласуются с результатами ряда исследований, выполненных для других популяций. В исследовании Milton et al. на австралийской популяции была показана предрасполагающая роль носительства аллеля PDE4D*41A в развитии атеротромботического типа ИИ [268]. В исследованиях на индийской популяции Munshi et al. выявили ассоциацию генотипа PDE4D*41A/A с фенотипическими характеристиками инфаркта мозга: его локализацией, размерами и тяжестью течения у курящих больных сахарным диабетом [275, 277].

В то же время, в исследовании на молдавской популяции данных об ассоциации с ИИ полиморфных участков SNP41G>A и SNP87C>T гена PDE4D получено не было [8]. В корейской и японской популяциях также не было обнаружено ассоциации SNP 41G>A гена PDE4D с риском развития ИИ ни в общей выборке, ни при разделении выборки по полу и возрасту, по наличию сопутствующих заболеваний (артериальная гипертензия, сахарный диабет) и в зависимости от курения [204, 259].

Таблица 10. Частоты аллелей и носительства аллелей и генотипов полиморфного участка 41G>A гена PDE4D у лиц русской этнической принадлежности, получивших ИИ в возрасте ? 60 лет и >60 лет, в сравнении c контрольной группой той же этнической принадлежности тех же возрастных категорий

Аллели / генотипы	лица в возрасте моложе или равном 60 лет	лица старше 60 лет
	Больные n=67	Группа контроля n=69	Значение p	ОШ (95% ДИ)	Больные n=133	Группа контроля n=76	Значение p	ОШ (95% ДИ)
Аллели, число (%)
A	25(18)	10(7)	0.0063	1.54 (1.2-1.98)	42(16)	15(10)	н.з.
G	110(82)	128(93)	0.0063	0.64 (0.50-0.83)	224(84)	137(90)	н.з.
Аллели, число (%) носителей
A	22(32)	10(14)	0.015	1.58 (1.15-2.2)	36(27)	14(18)	н.з.
G	64(96)	69(100)	н.з.		127(95)	75(99)	н.з.
Генотипы, число (%) носителей
A/A	3(4)	0(0)	н.з.		6(5)	1(1)	н.з.
A/G	19(28)	10(14)	н.з.		30(22)	13(17)	н.з.
G/G	45(68)	59(86)	0.015	0.63 (0.45-0.86)	97(73)	62(82)	н.з.

Полиморфные участки ?509С>Т, 869T>C и 915G>C гена трансформирующего фактора роста в1 (TGFB1)

При сравнении частот носительства аллелей и генотипов полиморфного участка ?509С>Т гена TGFB1 (таблица 11) выявлено значимое различие (p=0.02, OШ=0.43, 95%ДИ: 0.20-0.92) в частоте носительства аллеля TGFB1*?509C, которая в контрольной группе была выше. Соответственно, в группе больных ИИ генотип TGF*?509T/T встречался значимо чаще, чем в контроле (p=0.02, OШ=2.30, 95%ДИ: 1.08-4.89).

Аналогичные данные об ассоциации аллелей SNP TGFB1*?509C>Т с ИИ получены в ряде исследований. В исследовании Sie et al. на голландской популяции было выявлено, что носители аллеля TGFB1*?509T и генотипа TGFB1*?509C/T имеют повышенный риск развития заболевания [344]. Исследование на китайской популяции также выявило взаимосвязь полиморфного участка ?509С>Т гена TGFB1 с риском развития атеросклеротического инсульта; в группе больных инсультом была значимо выше частота генотипа TGFB1*?509T/T и аллеля TGFB1*?509T.

Таблица 11. Частоты аллелей и носительства аллелей и генотипов полиморфных участков ?509С>Т, 869T>C и 915G>C гена TGFB1 у лиц русской этнической принадлежности, перенесших ИИ, в сравнении c контрольной группой той же этнической принадлежности

Полиморфный участок	Аллели / генотипы	Больные ИИ n=200	Группа контроля n=146	Значение p	ОШ (95% ДИ)
TGFB1 ?509С>Т	Аллели, число (%)
	C	257(64.25)	202(69)	н.з.
	T	143(35.75)	90(31)	н.з.		<...

Подобные документы

• Аллельные варианты генов-кандидатов подверженности туберкулезу у русского населения Западной Сибири

  Роль наследственных факторов в возникновении и развитии туберкулеза. Молекулярные механизмы патогенеза туберкулеза у человека. Физиологические функции белковых продуктов генов-кандидатов. Молекулярно–генетические методы анализа полиморфизма генов.
  
  дипломная работа [851,1 K], добавлен 11.08.2010
  

• Сравнительный анализ структуры наследственной компоненты подверженности к бронхиальной астме и туберкулезу по генам ферментов метаболизма ксенобиотиков

  Ферментативная система биотрансформации ксенобиотиков. Полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и патология. Анализ роли полиморфных вариантов генов ферментов метаболизма ксенобиотиков в детерминации бронхиальной астмы и туберкулеза.
  
  диссертация [245,8 K], добавлен 15.01.2009
  

• Основные принципы картирования генов МФЗ

  Анализ ассоциаций генотипов и аллелей исследованных полиморфизмов с гестозом в популяциях русских и якутов. Оценка ассоциации tagSNPs генов LEP и ACVR2A с развитием клинических форм гесоза в русской и якутской популяциях. Анализ частот гаплотипов.
  
  дипломная работа [2,4 M], добавлен 11.02.2017
  

• Значимость острого воспаления в инициировании атеросклероза у детей

  Особенности и биохимическая основа патогенеза атеросклероза. Взаимоотношение воспаления и атеросклероза, его роль в развитии болезни. Действие на процессы клеточной адаптации вирусов и токсинов, изменение функции генов, деструкция клеточных мембран.
  
  доклад [7,0 M], добавлен 02.12.2010
  

• Антигены микроорганизмов

  Геномика и медицина. Структура вирусного генома. Другие геномы. Структура генома прокариот. Ориентация генов (направление транскрипции). Гомологичные гены и копийность генов. Изменение функции гена в процессе эволюции. Исследования генома человека.
  
  курсовая работа [2,2 M], добавлен 04.01.2008
  

• Гены, вызывающие бесплодие

  Причины и методы лечения генетического бесплодия. Отличительные черты женского (эндокринного, иммунологического) и мужского бесплодия. Характеристика генов, вызывающих исследуемую патологию. Нох-10 гены: общие сведения. Система гомеобоксных генов Нох.
  
  курсовая работа [69,2 K], добавлен 14.01.2017
  

• Физическая реабилитация больных ишемическим инсультом

  Клиническая характеристика инсультов. Общая характеристика реабилитационных мероприятий при ишемическом инсульте, лечебная физическая культура. Массаж и другие средства реабилитации при ишемическом инсульте. Оценка эффективности физической реабилитации.
  
  дипломная работа [571,6 K], добавлен 25.05.2012
  

• Геномный уровень организации наследственного материала

  Геном, генотип, кариотип. Проявление свойств наследственного материала на геномном уровне. Взаимодействие генов на уровне продуктов функциональной активности. Взаимодействие аллельных и неаллельных генов. Наследственный материал прокариотической клетки.
  
  контрольная работа [17,4 K], добавлен 02.12.2010
  

• Маркеры воспаления при атеросклерозе и ишемической болезни сердца. Их патогенетическое и прогностическое значение

  Патогенетическая роль хронического системного воспаления в развитии атеросклероза. Содержание в крови маркеров воспаления. Уровень в крови СРП имеет высокую прогностическую значимость как маркер риска развития коронарного атеросклероза и у женщин.
  
  реферат [25,8 K], добавлен 20.03.2009
  

• Лабораторная диагностика цитокинов в норме и патологии

  Общие представления о цитокинах: описание, физические и химические свойства, назначение. Определение концентраций цитокинов в биологических жидкостях, изучение их синтеза на уровне отдельных клеток. Изучение экспрессии генов и анализ полиморфизма.
  
  курсовая работа [45,5 K], добавлен 23.02.2012
  

• Генномодифицированные продукты, их влияние на организм и роль в стоматологии

  Создание генетически модифицированных продуктов путем добавления новых генов с целью улучшения селекции данного сорта. Влияние трансгенной сои и картофеля на организм человека. Применение природных и синтетических жиров, сахара, аспартама и сахарина.
  
  реферат [33,0 K], добавлен 22.03.2011
  

• Груз наследственной патологии в медицинском и социальном аспектах

  Наследственные болезни как заболевания, возникновение и развитие которых связано с дефектами в наследственном аппарате клеток, передаваемыми по наследству. Социальная и медицинская значимости их профилактики. Причины возникновения мутационных генов.
  
  презентация [143,8 K], добавлен 18.04.2015
  

• Изменение состава периферической крови под воздействием физических нагрузок

  Изучение различий в составе периферической крови до и после физических нагрузок. Оценка влияния интенсивности нагрузки и стажа тренировок на показатели периферической крови и адаптивные резервы организма человека. Техника проведения общего анализа крови.
  
  курсовая работа [1,3 M], добавлен 23.09.2016
  

• Реабилитация пациентов с ОНМК с применением инновационных технических средств

  Клиническая картина геморрагического инсульта, ишемического инсульта. Основные факторы риска. Первичная и вторичная профилактика инсульта. Эффективность лечения нервных болезней. Проведение реабилитации после инсульта с применением зеркальной терапии.
  
  курсовая работа [670,3 K], добавлен 01.08.2015
  

• Медицинские открытия

  Обзор основных медицинских открытий последних лет. Получение стволовых клеток из человеческой кожи. Определение генов болезни Альцгеймера. Определение синдрома Дауна по анализу крови. Разработка более эффективного способа лечения рака молочной железы.
  
  презентация [772,7 K], добавлен 10.04.2013
  

• Молекулярно-генетические методы исследования и их применение

  Сущность, значение и области применения молекулярно-генетических методов исследования. Специфика метода полимеразной цепной реакции. Блот-гибридизация по Саузерну. Картирование генов и идентификация хромосомных аберраций с помощью "FISH"-метода.
  
  презентация [971,4 K], добавлен 07.12.2014
  

• Полиморфизм по группам крови и их ассоциации с заболеванием вирусным гепатитом "С" (на примере пациентов КСТ "Садко")

  Генетический полиморфизм по группам крови системы АВО. Наследование резус-фактора крови. Ассоциации групп крови с гемотрансмиссивными вирусными инфекциями. Изучение зависимости развития заболевания вирусным гепатитом С от групп крови системы АВО.
  
  дипломная работа [213,8 K], добавлен 12.03.2014
  

• Ишемический инсульт в бассейне средней мозговой артерии. Острый период. Центральный правосторонний гемипарез

  Основные критерии постановки диагноза транзиторной ишемической атаки. Источники эмболии мозговых сосудов. Причины ишемического инсульта. Неврологический статус и топический диагноз больного. Основные принципы специального лечения ишемического инсульта.
  
  история болезни [31,5 K], добавлен 12.03.2013
  

• Коррекция двигательных нарушений после перенесенного ишемического инсульта у мужчин среднего возраста

  Современное состояние вопроса коррекции двигательных нарушений у больных церебральным ишемическим инсультом. Разработка комплексной методики физической реабилитации мужчин среднего возраста с гемипаретической формой церебрального ишемического инсульта.
  
  дипломная работа [324,0 K], добавлен 05.01.2015
  

• Гены, их роль и значение для жизни

  Открытие Менделем закономерностей расщепления. Гипотеза о происхождении психических болезней. Роль генов в определении и лечении различных заболеваний. Расстройства онтогенетического развития: гиперкинетический синдром, аутизм, заикание, синдром Туретта.
  
  реферат [43,3 K], добавлен 18.07.2015
  

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам