Основы ботаники

Каротиноиды представляют собой высокомолекулярные углеводороды: оранжевый каротин и желтый ксантофилл. Каротиноиды хлоропластов, а также синие, красные, бурые пигменты хроматофоров водорослей называют дополнительными, вспомогательными пигментами, поскольку энергия, поглощенная ими, может передаваться на хлорофилл. Хлорофилл использует энергию красной части спектра, каротиноиды -- синей. Максимум поглощения красного и синего пигментов водорослей приходится на зеленую и желтую части спектра. Фотосинтез -- сложный многостадийный процесс; естественно, что для его осуществления необходима дифференцированная структура, которая и выработалась в процессе эволюции. В онтогенезе хлоропласты формируются из пропластид путем образования из впячиваний внутренней мембраны уплощенных мешков -- тилакоидов. Тилакоидная система состоит из гран -- пачек дисковидных тилакоидов (наподобие стопки монет) и тилакоидов стромы -- уплощенных канальцев, которые объединяют граны между собой. В тилакоидах гран локализованы хлорофиллы и каротиноиды. Тилакоиды гран не изолированные единицы, они связаны друг с другом таким образом, что их полости оказываются непрерывными. В строме хлоропластов содержится собственная белоксинтезирующая система: кольцевая ДНК и прокариотические рибосомы. Большинство белков мембран тилакоидов (в частности, ферменты, осуществляющие световые реакции) синтезируется на рибосомах хлоропластов, тогда как белок стромы и липиды мембран имеют внепластидное происхождение. Световая фаза фотосинтеза проходит на мембранах тилакоидов гран. Квантовая энергия света превращается в химическую энергию макроэргических связей АТФ, НАДФ * Н2; происходит фотолиз воды -- расщепление на водород (переносится на НАДФ) и кислород, который освобождается: свет Н₂0 + НАДФ + АДФ + Фн НАДФ * Н₂ + АТФ + 1/2 О₂ . Темновая фаза проходит в строме, где за счет энергии, накопленной в световой фазе в молекулах АТФ и НАДФ Н2, происходит восстановление СО₂ до глюкозы, а затем и ассимиляционного крахмала. В ходе фотосинтеза образуются также жиры, жирные и органические кислоты, аминокислоты.Пластиды. Эти органеллы, характерные только для растений, встречаются во всех живых растительных клетках. Совокупность всех пластид (греч.пластос -- оформленный) клетки носит название п л а с т и д о м а . В зависимости от окраски, связанной с функциями, различают три основных типа пластид: хлоропласты (пластиды зеленого цвета), хромопласты (пластиды желтого, оранжевого или красного цвета) и лейкопласты (бесцветные пластиды). Обычно в клетке встречаются пластиды только одного типа. Хлоропласты (греч. хлорос -- зеленый) -- это наиболее изученные и имеющие наибольшее значение пластиды. Они содержат зеленый пигмент хлорофилл, который существует в хлоропластах в нескольких формах. Кроме хлорофилла, в хлоропластах содержатся пигменты, относящиеся к группе каротиноидов (липоиды), в частности желтый -- ксантофилл и оранжевый -- каротин, но обычно они маскируются хлорофиллом. Хлоропласты встречаются почти во всех клетках надземных органов растений, куда проникает свет, но особенно сильно развиты они в листьях и незрелых плодах, где составляют основной объем протопласта клеток. Лишь немногие типы клеток освещенных частей растений (некоторые выделительные, половые и проводящие органические вещества клетки) в зрелом --состоянии вместо хлоропластов содержат лейкопласты или хромопласты. Нет, как правило, хлоропластов и в клетках корней. Форма хлоропластов обычно правильная, линзовидная, довольно постоянная. Однако в некоторых типах клеток хлоропласты имеют более сложную форму, оболочка их может в отдельных местах глубоко вдаваться в тело пластиды, в результате чего возникают значительные углубления, часто неправильной формы, в которых находятся гиалоплазма с рибосомами и элементами ретикулума, иногда митохондрия. Размер и число хлоропластов на клетку колеблются в зависимости от рода растения и типа клетки. Чаще всего их диаметр составляет 4--7 мкм, толщина 1--3 мкм. Число хлоропластов варьирует сильнее.

Общая численность хлоропластов в растении громадна. Например, во взрослом дереве их насчитываются сотни миллиардов.На величину и форму хлоропластов влияют внешние условия: у растений, растущих в затененных местах, хлоропласты в общем крупнее, чем у растений открытых пространств, и, как правило, богаче хлорофиллом. Поскольку хлоропласты сравнительно крупные органеллы (значительно крупнее митохондрий, а иногда д аже и ядра) и окрашены, их легко можно изучать в прижизненном состоянии в клетке под световым микроскопом. Значительно разнообразнее хлоропласты у водорослей. Здесь они могут иметь пластинчатую (мужоция), звездчатую (зигнема), лентовидную (спирогира) форму и форму ребристых цилиндров. Такие хлоропласты обычно очень крупные, численность их в клетке небольшая (от одного до нескольких). Хлоропласты водорослей называют т акже хроматофорами (греч. хромео -- крашу; форос -- несущий). Однако и у водорослей могут встречаться хлоропласты обычной линзовидной формы, в этом случае численность их в клетке обычно велика. В клетках высших растений хлоропласты расположены в постенной цитоплазме таким образом, что одной широкой стороной обращены к клеточной оболочке, причем особенно много их около межклетников, заполненных воздухом. Однако положение пластид в клетке может меняться в зависимости от внешних условий, и прежде всего от освещенности. Они располагаются в клетке так, что улавливают свет наилучшим образом и вместе с тем не подвергаются действию прямых солнечных лучей. На рассеянном свету они сосредоточиваются часто у тех стенок оболочки клетки, которые обращены к поверхности органа, на ярком же свету они перемещаются на боковые стенки или поворачиваются к лучам узкой стороной (ребром). Строение хлоропластов довольно сложно , но во многом сходно у разных растений. Как и митохондрии, они имеют двумембранную оболочку, изолирующую от гиалоплазмы основное вещество пластиды -- строму (греч. строма -- ложе ). Мембраны оболочки агранулярные (лишены рибосом). Наиболее характерная черта хлоропластов-- сильное развитие внутренних мембранных поверхностей в виде строго упорядоченной системы внутренних мембран, улавливающих свет. В них сосредоточен хлорофилл. Внутренние мембраны имеют форму плоских мешков, называемых тилакоидами (греч. тилакоидес -- мешковидный) или ламеллами. На срезах границы тилакоидов выявляются в виде двух темных линий. У высших растений, как правило, часть тилакоидов имеет дисковидную форму небольшого (около 0,5 мкм) диаметра и собрана наподобие стопки в группы, называемые гранами (греч. гранум -- зерно). В гране тилакоиды располагаются параллельно друг другу, контактируя мембранами. Число тилакоидов в гране колеблется в широких пределах в зависимости от вида растения и условий освещенности. Так, у некоторых высших растений их может быть всего 2--3, у других достигать нескольких десятков. Граны связаны между собой тилакоидами стромы, проходящими через них насквозь вдоль пластиды. В отличие от тилакоидов гран тилакоиды стромы часто не строго параллельны, удалены друг от друга на разное расстояние, имеют различный диаметр. В некоторых участках хлоропластов можно наблюдать складки внутренней мембраны пластидной оболочки, непосредственно переходящие в тилакоиды стромы. В отличие от митохондрий такие складки встречаются обычно редко. Однако в некоторых случаях эти выросты образуют сеть трубочек по периферии пластиды, называемую периферическим ретикулумом. У хлоропластов многих водорослей и в немногих типах зеленых клеток высших растений типичные граны не образуются. Основная функция хлоропластов -- фотосинтез (ассимиляция углекислого газа воздуха), образование органических веществ из неорганических за счет энергии света. Фотосинтез состоит из большого числа химических реакций, каждая из которых катализируется особым ферментом. Именно с этой функцией связана специфическая ультраструктура хлоропластов. В общем виде фотосинтез можно себе представить как процесс восстановления углекислого га за воздуха водородом воды с образованием органических веществ (в первую очередь глюкозы) и выделением в атмосферу кислорода. Центральная роль в этом процессе принадлежит хлорофиллу. Он поглощает энергию света и направляет ее на осуществление экзотермических реакций фотосинтеза. Эти реакции подразделяются на светозависимые и темновые (не требующие присутствия света). Светозависимые реакции состоят в преобразование световой энергии в химическую и разложении (фотолизе) воды. Они приурочены к мембранам тилакоидов. Темновые реакции -- восстановление углекислого газа воздуха водородом воды до углеводов (фиксация СОг) -- протекают в строме хлоропластов. Кроме того, в хлоропластах, как и в митохондриях, происходит синтез АТФ из АДФ. Однако, в отличие от митохондрий, источником энергии для этого процесса служит не энергия окисления органических веществ, а солнечный свет, поэтому его называют фотофосфорилированием. Хлоропласты способны также к синтезу и разрушению полисахаридов (к р ахмал а ), некоторых липидов, аминокислот. Синтезируемые ими вещества не только выполняют функцию конституционных молекул, но могут откладываться в них про апас в виде крахмальных зерен, белковых и липидных включений. Наличие ДНК и рибосом указывает на существование своей собственной белоксинтезирующей системы в хлоропластах. И действительно, было показано, что большинство белков мембран тилакоидов (в частности, ферментов, осуществляющих световые реакции) синтезируется на рибосомах хлоропластов, тогда как основное число белков стромы и липиды мембран имеют внепластидное происхождение.

13. Лейкопласты, хромопласты. Их структура, разнообразие, функции. Онтогенез и взаимопревращения пластид

Лейкопласты -- бесцветные округлые пластиды, в которых обычно накапливаются запасные питательные вещества, в основном крахмал. По строению лейкопласты мало отличаются от пропластид, из которых они образуются: двумембранная оболочка окружает бесструктурную строму. Внутренняя мембрана, врастая в строму, образует немногочисленные тилакоиды. В лейкопластах имеются ДНК, рибосомы, а также ферменты, осуществляющие синтез и гидролиз запасных веществ, в первую очередь крахмала. Лейкопласты, в которых синтезируется и накапливается запасной крахмал, называются амилопластами, белки -- протеинопластами, масла -- элайопластами. В одном лейкопласте могут накапливаться разные вещества. Запасной белок может откладываться в форме кристаллов или аморфных включений, масла -- в виде пластоглобул. Однако белки и масла встречаются в лейкопластах довольно редко. В амилопластах в связи с тилакоидами в строме возникают образовательные центры, вокруг которых в виде зерен откладывается вторичный запасной крахмал из растворимых углеводов, образовавшихся в хлоропластах в процессе фотосинтеза. Много амилопластов в клетках клубней картофеля, зерновок ржи, пшеницы и других органах растений, где откладываются запасные вещества. Лейкопласты могут и не накапливать запасные вещества. В секреторных клетках они в комплексе с агранулярным ретикуломом участвуют в синтезе эфирных масел. Хромопласты -- пластиды оранжево-красного и желтого цвета, образующиеся из лейкопластов и хлоропластов в результате накопления в их строме каротиноидов. Они встречаются в клетках лепестков (лютик, нарцисс, тюльпан, одуванчик), зрелых плодов (томат, тыква, арбуз, апельсин), редко -- корнеплодов (морковь, кормовая свекла), а также в осенних листьях. Хромопласты -- конечный этап в развитии пластид. По форме накопления каротииоидов различают следующие типы хромопластов: глобулярный -- пигменты растворены в липидных пластоглобулах; фибриллярный--пигменты накапливаются в белковых нитях; кристаллический -- пигменты откладываются в виде кристаллов. Кристалл разрывает мембраны пластиды, и она принимает его форму: игловидную, ромбическую, многогранную и т. д. Косвенное биологическое значение хромопластов в том, что ярко окрашенные плоды успешнее распространяются птицами и животными, а выделяющиеся яркой желто-красной окраской цветки привлекают насекомых-опылителей. В филогенезе первичным исходным типом пластид являются хлоропласты, из которых в связи со специализацией органов произошли лейко- и хромопласты. В онтогенезе взаимопревращения пластид происходят иными путями. Наиболее часто хлоропласты превращаются в хромопласты при осеннем пожелтении листьев или созревании плодов. В природе этот процесс необратим. Лейкопласты могут превращаться в хлоропласты (позеленение верхней части корнеплода моркови, оказавшейся на поверхности почвы) или хромопласты. Хлоропласты могут при помещении растения в темноту также превратиться в лейкопласты. Процесс этот обратим. Лейкопласты (греч. лейкос -- белый) -- это бесцветные, обычно мелкие пластиды. В световом микроскопе их часто трудно обнаружить, так как они лишены окраски и обладают тем же коэффициентом преломления света, что и гиалоплазма. Во многих случаях об их присутствии можно судить по наличию в них крупных включений. Лейкопласты встречаются в клетках органов, скрытых от солнечного света,-- в корнях, корневищах, клубнях, семенах -- и очень редко в клетках освещенных частей растения (многие выделительные клетки, ситовидные элементы). Характерная особенность лейкопластов -- многообразие их формы. Они могут быть шаровидными, эллипсоидальными, гантелевидными, чашевидными или аме боидными, причем форма пластид даже в одной клетке может быстро изменяться. Друга я характерная особенность лейкопластов, отличающая их от хлоропластов,-- обычно слабое развитие внутренней мембранной системы. В них мы, как правило, встречаем редкие, часто одиночные тилакоиды, ра спола гающиеся без определенной ориентации или параллельно пластидной оболочке, иногда трубочки и пузырьки. Такие особенности внутренних мембран обусловлены иными, чем фотосинтез (улавливание света), функциями лейкопластов. Остальные компоненты лейкопластов (оболочка, строма, рибосомы, фибриллы ДНК, пластоглобулы) сходны с описанными для хлоропластов. Во многих случаях лейкопласты -- это органеллы, связанные с синтезом и накоплением запасных питательных веществ, в первую очередь крахмала, иногда белков. Лейкопласты, накапливающие крахмал, называют амилопластами (греч. амилон -- крахмал ). Этот крахмал образуется из поставляемых фотосинтезирующими клетками сахаров. В отличие от ассимиляционного крахмала хлоропластов, он называется вторичным и имеет вид зерен. Запасной белок в лейкопластах может откладываться в форме кристаллов или аморфных включений (иногда вместе с кр ахмалом), жирные масла -- в виде пластоглобул. Однако эти запасные вещества встречаются в лейкопластах довольно редко. В некоторых типах клеток лейкопласты могут не накапливать крахмала и других включений. В этих случаях они могут играть центральную роль в синтезе жирных кислот клетки. В секреторных клетках они участвуют в синтезе эфирных масел, при этом они функционируют обычно в комплексе с элементами агранулярного ретикулума, которые располагаются близко от пластидной оболочки и параллельно ей, образуя своеобразные футляры. Хромопласты встречаются в клетках лепестков многих растений (лютик, калужница, нарцисс, тюльпан, одуванчик и др.), зрелых плодов (томаты, роза, банан, рябина, тыква, арбуз, апельсин), редко -- корнеплодов (морковь, кормовая свекла), а т акже в осенних листьях. Яркий цвет этих органов обусловлен различными пигментами, относящимися к группе каротиноидов (липоидов), которые сосредоточены в хромопластах. (Впрочем, желтая и красная окраска лепестков часто обусловлена пигментами клеточного сока вакуолей; см. ниже.) Они лишены хлорофилла и поэтому не способны к фотосинтезу. Внутренняя мембранная система в хромопластах, как правило, отсутствует. От хлоропластов хромопласты отличаютсят акже обычно меньшими размерами и нелинзовидной формой. Каротиноиды хромопластов чаще всего растворены в жирных маслах пластоглобул, занимающих значительный объем пластиды. Размер и число пластоглобул у разных растений колеблются и часто характерны для вида. Имеются переходные формы от хлоропластов к хромопластам -- хлорохромопласты, у которых сохраняются небольшое число мелких гран и межгранные тилакоиды и одновременно наблюдается образование большого числа крупных пластоглобул. Довольно редко (например, в клетках корнеплодов моркови, плодов арбуза) каротиноиды в хромопластах откладываются главным образом в форме кристаллов различной формы. Выкристаллизовавшийся пигмент часто составляет преобладающую по объему часть пластиды, поэтому форма хромопласта в конечном счете определяется формой кристалла (или кристаллов, если их несколько), она может быть зубчатой, серповидной, игловидной, пластинчатой, в виде треугольников, ромбов, пар Значение хромопластов в обмене веществ до конца еще не выяснено. По-видимому, большинство из них представляют собой стареющие пластиды. Косвенное биологическое значение хромопластов состоит в том, что они обусловливают яркую окраску цветков и плодов, привлекающую насекомых для перекрестного опыления и других животных для распространения плодов. Онтогенез и взаимопревращения пластид. В эволюционном смысле первичным, исходным типом пластид являются хлоропласты, из которых при расчленении тела растений на органы произошли пластиды остальных двух типов. В процессе индивидуального развития (онтогенеза) почти все типы пластид могут превращаться друг в друга. Наиболее обычные процессы -- превращение лейкопластов в хлоропласты и хлоропластов в хромопласты. Первый процесс наблюдается, например, при развитии листьев в почке или при развитии зародыша из оплодотворенной яйцеклетки. Он может происходить путем образования проламеллярных телец (очевидно, если проникающего света недостаточно) или путем постепенного формирования в лейкопластах характерной для зеленых пластид внутренней мембранной системы (включающей граны) за счет выростов в строму внутренней мембраны оболочки пластиды, синтеза хлорофилла и дальнейшего роста и организации мембран. Некоторые ученые называют лейкопласты делящихся (меристематических) клеток ростовой почки или кончика корня п ропластидами (т.е. зачаточными пластидами). Однако изучение строения этих телец в данных клетках показывает, что они очень похожи на лейкопласты мелкого размера. В некоторых случаях делящиеся клетки уже содержат пластиды с зачаточной системой гран, и развитие типичных хлоропластов происходит путем постепенного наращивания их внутренних мембран. Широко распространенным примером превращения хлоропластов в хромопласты является изменение пластид при осеннем пожелтении листьев или при созревании плодов некоторых растений. Этот процесс состоит в уменьшении размеров пластид, постепенном разрушении внутренних мембран (гран и тилакоидов стромы) и накоплении веществ в пластоглобулах, число и размер которых увеличиваются. В конце концов хлорофилл полностью разрушается и перестает маскировать каротиноиды, которые теперь отчетливо выступают и обусловливают желтую окрдску осенних листьев. Преобладающим компонентом пластид становятся пластоглобулы. Такой процесс превращения хлоропластов в хромопласты до определенной стадии обратим, и путем обработки некоторыми веществами (в особенности гормонами) или в определенных условиях желтый лист можно зас тавить позеленеть. Однако в природных условиях, как правило, превращение хромопластов в хлоропласты не происходит, и их можно рассматривать как конечный этап развития пластид (этап старения). В хромопласты могут превращаться и лейкопласты (например, в некоторых выделительных клетках при их старении). При превращении хлоропластов в лейкопласты, которое может происходить при поранении растения или при помещении его в темноту, внутренняя мембранная система также в значительной степени разрушается, хлорофилл исчезает, но накопления пластоглобул не происходит. Этот процесс обратим. Например, при выставлении на свет из лейкопластов опять развиваются хлоропласты. В процессе развития клетки пластиды возникают только из пластид, а не из других структур. Численность их в клетке увеличивается за счет деления путем образования перетяжек или почкования.

14. Методы изучения растительных клеток. Метод микроскопирования. Строение светового микроскопа. Приготовление временных и постоянных препоратов

Микроскопирование -- основной метод изучения микрообъектов, используемый в биологии более 300 лет. С момента создания и применения первых микроскопов они постоянно совершенствовались. Современные микроскопы представляют собой разнообразные сложные оптические системы, обладающие высокой разрешающей способностью. Размер самой маленькой структуры, которую можно видеть в микроскопе, определяется наименьшим разрешаемым расстоянием (б₀), которое в основном зависит от длины волны света (x) и длины волн электромагнитных колебаний потока электронов и др. Эта зависимость приближенно определяется формулой б₀ = ¹/₂х. Таким образом, чем меньше длина волны, тем меньше разрешаемое расстояние и тем меньшие по размерам микроструктуры можно видеть в препарате. Для изучения гистологических препаратов применяют разнообразные виды световых микроскопов и электронные микроскопы. Световая микроскопия. Для изучения гистологических микрообъектов применяют обычные световые микроскопы и их разновидности, в которых используются источники света с различными длинами волн. В обычных световых микроскопах источником освещения служит естественный или искусственный свет (рис. 1, а). Минимальная длина волны видимой части спектра равна примерно 0,4 мкм. Следовательно, для обычного светового микроскопа наименьшее, разрешаемое расстояние равно приблизительно 0,2 мкм (б₀ = у₂ 0,4 мкм = 0,2 мкм), а общее увеличение (произведение увеличения объектива на увеличение окуляра) может быть 1500--2500. Таким образом, в световом микроскопе можно видеть не только отдельные клетки размером от 4 до 150 мкм, но и их внутриклеточные структуры -- органеллы, включения. Для усиления контрастности микрообъектов применяют их окрашивание. Ультрафиолетовая микроскопия. Это разновидность световой микроскопии. В ультрафиолетовом микроскопе используют более короткие ультра-фиолетовых лучах невидимое глазом изображение преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств (люминесцентный экран, электронно-оптический преобразователь). Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Явления флюоресценции заключаются в том, что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротковолновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Обратный переход из возбужденного состояния в нормальное происходит с испусканием света, но с большей длиной волны. В флюоресцентном микроскопе в качестве источников света для возбуждения флюоресценции применяют ртутные или ксеноновые лампы сверхвысокого давления, обладающие высокой яркостью в области спектра 0,25--0,4 мкм (ближние ультрафиолетовые лучи) и 0,4-- 0,5 мкм (сине-фиолетовые лучи). Длина световой волны флюоресценции всегда больше длины волны возбуждающего света, поэтому их разделяют с помощью светофильтров и изучают изображение объекта только в свете флюоресценции. Различают собственную, или первичную, и наведенную, или вторичную, флюоресценцию. Любая клетка живого организма обладает собственной флюоресценцией, однако она часто бывает чрезвычайно слабой. Первичной флюоресценцией обладают серотонин, катехоламины (адреналин, норадреналин), содержащиеся в нервных, тучных и других клетках, после фиксации тканей в парах формальдегида при 60--80 °с (метод фалька). Вторичная флюоресценция возникает при обработке препаратов специальными красителями -- флюорохромами. Существуют различные флюорохромы, которые специфически связываются с определенными макромолекулами (акридин оранжевый, родамин, флюоресцеин и др.). Например, при обработке препаратов чаще всего употребляется флюорохром акридиновый оранжевый. В этом случае днк и ее соединения в клетках имеют ярко-зеленое, а рнк и ее производные -- ярко-красное свечение. Таким образом, спектральный состав излучения несет информацию о внутреннем строении объекта и его химическом составе. Вариант метода флюоресцентной микроскопии, при котором и возбуждение, и излучение флюоресценции происходят в ультрафиолетовой области спектра, получил название метода ультрафиолетовой флюоресцентной микроскопии. Фазово-контрастная микроскопия. Этот метод служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Как уже указывалось, в обычном световом микроскопе необходимая контрастность структур достигается с помощью окрашивания. Метод фазового контраста обеспечивает контрастность изучаемых неокрашенных структур за счет специальной кольцевой диафрагмы, помещаемой в конденсоре, и так называемой фазовой пластинки, находящейся в объективе. Такая конструкция оптики микроскопа дает возможность преобразовать не воспринимаемые глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменение его амплитуды, т. Е. Яркости получаемого изображения. Повышение контраста позволяет видеть все структуры, различающиеся по показателю преломления. Разновидностью метода фазового контраста является метод фазово-темнопольного контраста, дающий негативное по сравнению с позитивным фазовым контрастом изображение. Микроскопия в темном поле. В темнопольном микроскопе только свет, который дает дифракцию структур в препарате, достигает объектива. Происходит это благодаря наличию в микроскопе специального конденсора, который освещает препарат строго косым светом; лучи от осветителя направляются сбоку. Таким образом, поле выглядит темным, а мелкие частицы в препарате отражают свет, который далее попадает в объектив. Разрешение этого микроскопа не может быть лучше, чем у светлопольного микроскопа, так как используется такая же длина волны. Но здесь достигается больший контраст. Он используется для изучения живых объектов, авторадиографических объектов, например зерен серебра, которые выглядят светлыми на темном поле. В клинике его применяют для изучения кристаллов в моче (мочевая кислота, оксалаты), для демонстрации спирохет, в частности 1геропета рашйит, вызывающей сифилис, и др. Интерференционная микроскопия. Разновидностями фазово-контрастного микроскопа являются интерференционный микроскоп, который предназначен для количественного определения массы ткани, и дифференциальный интерференционный микроскоп (с особой оптикой), который специально используют для изучения рельефа поверхности клеток и других биологических объектов. В интерференционном микроскопе пучок света от осветителя разделяется на два потока: один проходит через объект и изменяет по фазе колебания, второй идет, минуя объект. В призмах объектива оба пучка соединяются и интерферируют между собой. В результате строится изображение, в котором участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности. Проведя количественную оценку изменений, определяют концентрацию и массу сухого вещества. Фазово-контрастный и интерференционный микроскопы позволяют изучать живые клетки. В них используется эффект интерференции, возникающий при комбинации двух наборов волн, который создает изображение микроструктур. Преимуществом фазово-контрастной, интерференционной и темнопольной микроскопии является возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью цейтраферной (покадровой) микрокиносъемки. Поляризационная микроскопия. Поляризационный микроскоп является модификацией светового микроскопа, в котором установлены два поляризационных фильтра -- первый (поляризатор) между пучком света и объектом, а второй (анализатор) между линзой объектива и глазом. Через первый фильтр свет проходит только в одном направлении, второй фильтр имеет главную ось, которая располагается перпендикулярно первому фильтру, и он не пропускает свет. Получается эффект темного поля. Оба фильтра могут вращаться, изменяя направление пучка света. Если анализатор повернуть на 90° по отношению к поляризатору, то свет через них проходить не будет. Структуры, содержащие продольно ориентированные молекулы (коллаген, микротрубочки, микрофиламенты), и кристаллические структуры при изменении оси вращения проявляются как светящиеся. Способность кристаллов или паракристаллических образований к раздвоению световой волны на обыкновенную и перпендикулярную к ней называется двойным лучепреломлением. Такой способностью обладают фибриллы поперечнополосатых мышц. Интерференционный и поляризационный принципы используются в настоящее время в так называемом лазерном микроскопе, в котором используется предварительно полученный с заданными оптическими свойствами (с помощью специального лазерного устройства) пучок света. Стандартный световой биологический микроскоп серии "биолам": 1 -- основание; 2 -- тубусо- держатель; 3 -- наклонный тубус; 4 -- окуляр; 5 -- револьвер; 6 -- объективы; 7 -- столик; 8 -- конденсор с ирисовой диафрагмой; 9 -- винт конденсора; 10 -- зеркало; 11 -- микрометрический винт; 12 -- макрометрический винт. Цито- и гистохимические методы. Эти методы позволяют выявлять локализацию различных химических веществ в структурах клеток, тканей и органов -- днк, рнк, белков, углеводов, липидов, аминокислот, минеральных веществ, витаминов, активность ферментов. Эти методы основаны на специфичности реакции между химическим реактивом и субстратом, входящим в состав клеточных и тканевых структур, и окрашивании продуктов химических реакций. Для повышения специфичности реакции часто применяют ферментативный контроль. Например, для выявления в клетках рибонуклеиновой кислоты (рнк) часто используют галлоцианин -- краситель с основными свойствами, а наличие рнк подтверждают контрольной обработкой рибонуклеазой, расщепляющей рнк. Галлоцианин окрашивает рнк в сине-фиолетовый цвет. Если срез предварительно обработать рибонуклеазой, а затем окрасить галлоцианином, то отсутствие окрашивания подтверждает наличие в структуре рибонуклеиновой кислоты. Процесс изготовления гистологического препарата для световой и электронной микроскопии включает следующие основные этапы: 1) взятие материала и его фиксация, 2) уплотнение материала, 3) приготовление срезов, 4) окрашивание или контрастирование срезов. Для световой микроскопии необходим еще один этап -- заключение срезов в бальзам или другие прозрачные среды. Фиксация обеспечивает предотвращение процессов разложения, что способствует сохранению целостности структур. Это достигается тем, что взятый из органа маленький образец либо погружают в фиксатор (спирт, формалин, растворы солей тяжелых металлов, специальные фиксирующие смеси), либо подвергают термической обработке. Под действием фиксатора в тканях и органах происходят сложные физико-химические изменения. Наиболее существенным из них является процесс необратимой коагуляции белков, вследствие которого жизнедеятельность прекращается, а структуры становятся мертвыми, фиксированными. Фиксация приводит к уплотнению и уменьшению объема кусочков, а также к улучшению последующей окраски клеток и тканей. Уплотнение кусочков, необходимое для приготовления срезов, производится путем пропитывания предварительно обезвоженного материала парафином, целлоидином, органическими смолами. Более быстрое уплотнение достигается применением метода замораживания кусочков, например в жидкой углекислоте. Приготовление срезов производится на специальных приборах -- микротомах (для световой микроскопии) и ультрамикротомах (для электронной микроскопии). Окрашивание срезов (в световой микроскопии) или напыление их солями металлов (в электронной микроскопии) применяют для увеличения контрастности изображения отдельных структур при рассматривании их в микроскопе. Методы окраски гистологических структур очень разнообразны и выбираются в зависимости от задач исследования. Гистологические красители подразделяют на кислые, основные и нейтральные. В качестве примера можно привести наиболее известный основной краситель азур ii, который окрашивает ядра в фиолетовый цвет, и кислый краситель -- эозин, окрашивающий цитоплазму в розово-оранжевый цвет. Избирательное сродство структур к определенным красителям обусловлено их химическим составом и физическими свойствами. Структуры, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями, называются оксифилъными (ацидофильными, эозинофильными), а окрашивающиеся основными -- базофильными. Структуры, воспринимающие как кислые, так и основные красители, являются нейтрофилъными (гетерофильными). Окрашенные препараты обычно обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и просветляют в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах. Для длительного сохранения обезвоженный гистологический срез заключают между предметным и покровным стеклами в канадский бальзам или другие вещества. Готовый гистологический препарат может быть использован для изучения под микроскопом в течение многих лет. Для электронной микроскопии срезы, полученные на ультрамикротоме, помещают на специальные сетки, контрастируют солями марганца, кобальта и др., после чего просматривают в микроскопе и фотографируют. Полученные микрофотографии служат объектом изучения наряду с гистологическими препаратами. Временные препараты. Подготовка материала для временных препаратов включает фиксацию и окраску. Фиксация. Фиксация - это процесс быстрой консервации клеточных структур, при котором все физиолого-биохимические процессы останавливаются, а водорастворимые вещества переходят в нерастворимое состояние. Окрашивание. Окрашивание позволяет выявлять внутриклеточные структуры, обладающие повышенным сродством к определенным красителям. Красители - это относительно низкомолекулярные органические вещества, обладающие повышенным сродством к определенным химическим компонентам клетки. Существует множество красителей, которые используются для различных целей. Нужно иметь в виду, что выбор красителя связан с характером фиксации и различными методами предварительной обработки клеток. Постоянные препараты. Постоянные препараты готовятся по специальным методикам, обеспечивающих их хранение в течение десятков лет. К постоянным препаратам относятся мазки, тотальные препараты и срезы. 1.Взятие материала (кусочка ткани или органа) для приготовления препарата. 2.Фиксация материала. Сразу после окончания фиксации производится промывка материала или водой (после водных фиксаторов), или 80%-ным спиртом (после спиртовых фиксаторов). Фиксация обеспечивает предотвращение процессов разложения, что способствует сохранению целостности структур. 3. Обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации. Параллельно происходит уплотнение материала. Последовательное перемещение материала через ряд растворов называется проводка.4. Просветление. Это пропитывание материала растворителем парафина - ксилолом (бензолом, хлороформом). 5. Заливка в парафин. Это замещение ксилола парафином. Образец помещают в смесь ксилола и парафина при температуре 55...57 градусов и оставляют в термостате при этой температуре до полного испарения ксилола (от нескольких часов до нескольких суток). 6. Приготовление срезов на специальных приборах (микротоме или ультрамикротоме) с помощью специальных ножей. Срезы для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной микроскопии - монтируется на специальные сеточки.7. Окрашивание срезов. Окрашивание срезов (в световой микроскопии) или напыление их солями металлов (в электронной микроскопии) применяют для увеличения контрастности изображения отдельных структур при рассматривании их в микроскопе.

15. Межклеточные связи-поры, перфорации, плазмодесмы. Типы, строение и значение в жизни растительного организма. Мацерация. Межклетники. Поры

Утолщается клеточная стенка неравномерно. Обычно неутолщенными остаются лишь небольшие участки первичной клеточной стенки в местах расположения первичных поровых полей -- поров ы е каналы. Поровые каналы двух соседних клеток располагаются обычно друг против друга и разделяются замыкающей пленкой поры -- двумя первичными клеточными стенками с межклеточным веществом между ними. В пленке сохраняются субмикроскопические отверстия, через которые проходят плазмодесмы. Таким образом, пора -- это два поровых канала и замыкающая пленка между ними. Поры бывают простые и окаймленные. В простых порах диаметр порового канала по всей длине одинаковый, поэтому полость канала цилиндрическая и поры округлые. Они характерны для паренхимных клеток. В прозенхимных клетках простые поры имеют щелевидные полости. Окаймленные поры встречаются в стенках клеток, проводящих воду и минеральные вещества, -- трахеидах и сосудах. Их поровый канал имеет форму воронки, которая своей широкой стороной прилегает к замыкающей пленке. В клетках хвойных замыкающая пленка окаймленных пор несет в центре дискообразное утолщение -- торус. Вода проходит через краевую зону замыкающей пленки, торус же одревесневает и становится непроницаемым для нее. Если давление воды в смежных клетках неодинаково, замыкающая пленка отклоняется и торус блокирует пору, перекрывая поровый канал. Плазмодесмы пронизывают замыкающие пленки пор. В каждой клетке имеется от нескольких сотен до десятков тысяч плазмодесм. Плазмодесмы встречаются только в растительных клетках, там, где имеются твердые клеточные стенки. Плазмодесмы образуются из канальцев ЭР, которые остаются в клеточной пластинке между двумя дочерними клетками после деления. При воссоздании ЭР обеих клеток они оказываются соединенными через плазмодесмы. Плазмодесма проходит через плазмодесменный канал в замыкающей пленке поры. Плазмалемма, выстилающая канал, и гиалоплазма между ней и плазмодесмой непрерывны с плазмалеммамм и гиалоплазмами смежных клеток. Таким образом, протопласты соседних клеток связаны между собой каналами плазмодесм и плазмодесмами. По ним происходит межклеточный транспорт ионов и молекул, а также гормонов. Объединенные плазмодесмами протопласты клеток в растении образуют единое целое -- симпласт. Транспорт веществ через плазмодесмы получил название симпластического в отличие от апопластического транспорта по клеточным стенкам и межклетникам. Мацерация -- растворение межклеточного вещества, приводящее к разъединению клеток. Естественная мацерация происходит в зрелых плодах. Искусственно ее проводят, например, при мочке льна для освобождения прядильного сырья -- групп клеток лубяных волокон. Мацерация, межклетники. Срединная пластинка склеивает соседние клетки. Поэтому если ее растворить с помощью некоторых веществ, то оболочки соседних клеток теряют связь друг с другом и клетки разъединяются. Процесс разъединения клеток вследствие разрушения срединной пластинки носит название мацерации. Довольно обычна естественная мацерация, при которой пектиновые вещества срединной пластинки переводятся в растворимое состояние с помощью выделяемого клеткой фермента пектиназы и затем вымываются водой. Естественная мацерация наблюдается, например, у перезрелых мясистых плодов груши, дыни, персика. Мучнистый характер

плода банана объясняется тем, что ко времени зрелости ткань плода в результате естественной мацерации распадается на отдельные клетки. Естественная мацерация происходит в черешках листьев перед листопадом, в плодоножках и лепестках перед их опадением. В основе процесса мочки льна лежит мацерация, которую производят микроорганизмы. Мацерация наглядно показывает, что каждая клетка обладает собственной оболочкой. При переходе клеток из эмбрионального в зрелое состояние очень часто наблюдается частичная мацерация клеток, при которой срединная пластинка растворяется не по всей поверхности, а лишь в некоторых участках, чаще всего по углам клеток. Вследствие тургорного давления соседние клетки в этих местах округляются, в результате чего образуются межклетники. Первоначально на поперечном срезе они имеют чаще форму трех или четырехугольников, а на продольном срезе -- вид узких щелей. Затем с ростом оболочки соседних клеток межклетники увеличиваются и сливаются, образуя связанную между собой разветвленную сеть, которая заполняется парами воды и газами. Таким образом межклетники улучшают газообмен клеток. Плазмодесмы. Плазмодесмы (греч. десмос -- связка) присущи только растительным клеткам. Они представляют собой тончайшие цитоплазматические нити, или каналы, пересекающие оболочку смежных клеток. Они выявлены у всех высших растений, а также у многих многоклеточных водорослей. Плазмодесмы были открыты с помощью светового микроскопа после специальной обработки препаратов, вызывающей разбухание оболочки. Хотя число плазмодесм на одну клетку сильно колеблется в зависимости от возраста, размера и типа клетки, оно всегда оказывается очень большим -- от нескольких сотен до десятков тысяч. В процессе отложения оболочки численность плазмодесм может уменьшаться за счет их блокирования откладывающимися слоями оболочки. Обычно плазмодесмы бывают собраны в группы, часто по нескольку десятков, реже они встречаются поодиночке, что характерно для ряда типов клеток, не образующих вторичной оболочки. Строение и образование плазмодесм были изучены с помощью электронного микроскопа. Оказалось, что при возникновении клеточной пластинки во время цитокинеза между сливающимися пектиновыми пузырьками Гольджи сохраняются содержащие ретикулярные элементы перешейки, в которых цитоплазма между дочерними клетками не разобщается, будущие плазмодесмы. Стенки канала плазмодесмы оказываются выстланными плазмалеммой, формирующейся при слиянии мембран пузырьков Гольджи. Диаметр канала составляет всего 30--60 нм, т. е. ниже разрешающей способности светового микроскопа. Плазмалемма, выстилающая плазмодесменный канал, непрерывна с плазмалеммой смежных клеток. В центре плазмодесмы проходит мембранный цилиндр -- центральный стержень плазмодесмы, непрерывный с мембранами расположенных у входа в плазмодесменный канал элементов эндоплазматического ретикулума обеих клеток. Между центральным стержнем и плазмалеммой в канале находится лишенная рибосом гиалоплазма, непрерывная.с гиалоплазмой смежных клеток. Таким образом, протопласты клеток не полностью изолированы друг от друга плазмалеммой и оболочкой, а сообщаются по каналам плазмодесм. По ним, очевидно, происходит (путем диффузии) межклеточный транспорт ионов и мелких молекул (таких, как аминокислоты, сахара, АТФ), а также передаются гормональные стимулы. Роль центрального стержня плазмодесм пока совершенно не известна. Поскольку плазмодесмы, за немногими исключениями, обнаружены между. всеми живыми клетками, протопласты клеток в растительном организме образуют единое целое, называемое симпластом, а транспорт веществ через плазмодесмы получил название симпластического в отличие от апопластического транспорта по оболочкам и межклетникам. Поры. Если в общеупотребительном смысле порами называют многочисленные мелкие отверстия в том или ином материале, то в анатомии растений применительно к оболочке в понятие ?пора? вкладывается иное содержание. Порой называют любое неутолщенное место оболочки (углубление). Сами поры часто содержат тончайшие отверстия, в которых проходят плазмодесмы, соединяющие протопласты соседних клеток. Возникновение пор связано с неравномерным утолщением вторичной оболочки. Те места, куда вещества вторичной оболочки не откладываются, становятся порами. Таким образом, поры -- это перерывы во вторичной оболочке. Если вторичная оболочка в клетке не достигает большой толщины, то поры выглядят как мелкие углубления. У клеток с мощной вторичной оболочкой поры в разрезе имеют вид радиальных каналов, идущих от полости клетки до первичной оболочки. В плане форма у этих каналов обычно округлая, реже эллиптическая, щелевидная или крестообразная. Особенно хорошо такие поровые каналы развиты у каменистых клеток, встречающихся в плодах. По форме порового канала обычно различают поры двух типов -- простые и окаймленные. У простых пор диаметр канала приблизительно одинаков на всем протяжении от полости клетки до первичной оболочки и канал имеет форму узкого цилиндра. У окаймленных пор канал резко суживается в процессе отложения вторичной оболочки, поэтому внутреннее отверстие поры, выходящее в полость клетки (апертура поры), гораздо уже, чем наружное, упирающееся в первичную оболочку. Поры в двух смежных клетках, как правило, возникают друг против друга. Поэтому каждой поре одной клетки соответствует пора в смежной стенке соседней клетки и диаметр их в месте встречи одинаков. В результате эти общие поры имеют вид одного канала, разделенного тонкой перегородкой из срединной пластинки и первичной оболочки. Такая совокупность двух пор смежных стенок оболочек соседних клеток носит название пары пор и функционирует как одно целое. Разделяющий их канал участок оболочки называют замыкающей пленкой поры. Поэтому, несмотря на отсутствие вторичного утолщения, поры не образуют открытой связи между клетками. Простые поры характерны для паренхимных клеток, лубяных и древесинных волокон. Диаметр порового канала у простых пор р а з личен. В клетках с тонкими вторичными оболочками он может быть настолько широким, что в них трудно узнать поры. В других клетках простые поры очень узки и поровый канал приобретает вид тонкой нити. У каменистых клеток каналы пор могут ветвиться. Ветвистые поры возникают в результате того, что каналы соседних пор в процессе отложения вторичной оболочки сливаются между собой. В живых клетках замыкающая пленка поры пронизана многочисленными (до нескольких десятков) плазмодесмами. Окаймленные поры характерны для рано отмирающих клеток водопроводящих элементов древесины. У них поровый канал по направлению к замыкающей пленке воронковидно расширяется, а вторичная оболочка нависает в виде валика над расширенной ч а стью канала, образуя камеру поры. Название окаймленной поры происходит от того, что при рассматривании ее с поверхности вход в канал поры из полости клетки (внутреннее отверстие) имеет вид маленького круга или узкой щели, тогда как наружное отверстие как бы окаймляет внутреннее в виде концентрического круга большего диаметра или более широкой щели. В клетках хвойных замыкающая пленка окаймленных пор несет в центре дискообразное утолщение, называемое торусом.

Торус представляет собой участок срединной пластинки, одетый с двух сторон первичной оболочкой. При отмирании клетки вещества матрикса в замыкающей пленке окаймленной поры за исключением зоны будущего торуса подвергаются гидролизу с помощью ферментов, освобождающихся из протопласта. В результате краевая зона замыкающей пленки, состоящая только из рыхлых тяжей микрофибрилл, оказывается пронизанной микрокапиллярами, через которые может течь вода. Торус же лигнифицируется и становится практически водонепроницаемым. Если давление воды в смежных клетках неодинаково, то он смещается к внутреннему отверстию поры клетки с более низким давлением, перекрывает его и блокирует пору. В замыкающей пленке окаймленных пор покрытосеменных растений вещества матрикса также гидролизуются, но торус у них, как правило, не встречается. Поры, как и плазмодесмы, облегчают транспорт воды и растворенных веществ от клетки к клетке. В то же время они не снижают прочности оболочки. Срединная пластинка соединяет клетки между собой. Разрушение срединной пластинки и разъединение клеток называют мацерацией. Она происходит в естественных условиях при перезревании плодов, в черешках листьев перед их опадением и т. д. При частичной мацерации, когда срединная пластинка разрушается только по углам клеток, происходит образование межклетников. Плазмодесмы. Это тончайшие цитоплазматические нити, которые осуществляют связь между клетками. Клеточная пластинка, образующа я с я при цитокинезе, пронизана трубочками эндоплазматического ретикулума, которые не разобщаются. На их основе и формируются плазмодесмы. Стенка плазмодесменного канала выстлана пла змалеммой, соединяющей плазмалеммы смежных клеток. В центре канала проходит трубка, сохраняющая непрерывность ретикулума обеих клеток. Между плазмалеммой и трубкой находится гиалоплазма, также непрерывная для обеих клеток. Пла змоде смы ч аще всего бывают собраны в группы по нескольку десятков. Поодиночке они ра сп о лагаются в стенках, не имеющих вторичных утолщений Поры -- это места, где не образуется вторичная стенка. Они имеют вид каналов, идущих от полости клетки до первичной стенки. По форме канала различают поры простые и окаймленные. У простых пор канал на всем протяжении имеет примерно одинаковый диаметр. С поверхности они имеют вид кружков. У окаймленных пор канал по направлению к первичной стенке расширяется. Поэтому с поверхности они выглядят, как две концентрические окружности. Обычно в двух смежных клетках поры образуются друг против друга и имеют вид канала, разделенного тонкой перегородкой из срединной пластинки и двух первичных стенок, называемой замыкающей пленкой. У окаймленных пор з амык ающа я пленка в центральной части имеет утолщение (торус). В живых клетках замыкающие пленки пронизаны многочисленными плазмодесмами. Поры, как и плазмодесмы, облегчают транспорт веществ между клетками. В стенках клеток, специализирующихся на передвижении веществ, под действием ферментов образуются крупные отверстия, называемые перфорациями.

16. Образование и рост оболочки клетки. Роль фрагмопласта в ее формировании. Клеточная пластинка. Первичная и вторичная оболочка. Образование, текстура, химический состав и физические свойства

Клетки растений в отличие от клеток животных имеют твердые клеточные стенки, которые придают клетке определенную форму, защищают протопласт, противостоят внутриклеточному тургорному давлению и препятствуют разрыву клетки. Они, являясь внутренним скелетом растения, обеспечивают его механическую прочность. Клеточные стенки, как правило, бесцветны и легко пропускают солнечный свет. По ним могут передвигаться вода и растворенные в ней низкомолекулярные вещества. Стенки соседних клеток скреплены межклеточным веществом -- срединной пластинкой. Срединная пластинка -- единый слой, общий для двух соседних клеток. Она представляет собой несколько видоизмененную клеточную пластинку, возникшую в процессе цитокинеза.