Основы генетики как науки

По мере увеличения разрешающей способности генетического анализа стало очевидно, что ген делим и не является единицей мутации и рекомбинации. Первые эксперименты, доказавшие сложное строение гена у дрозофилы, были выполнены в 20--30-х гг. XX в. советскими учёными А. С. Серебровским, Н. П. Дубининым и др. Это открытие нашло подтверждение в исследованиях зарубежных авторов, работавших с дрозофилой, а также с низшими грибами, бактериями. В 1953 Дж. Уотсоном и Ф. Криком была раскрыта трёхмерная структура ДНК, что позволило говорить о том, каким образом детали данной структуры определяют биологические функции ДНК в качестве материального носителя наследственной информации.

В 60-х гг. американский исследователь С. Бензер доказал, что ген бактериофага Т4, развивающегося на кишечной палочке, состоит из линейно расположенных, независимо мутирующих элементов, разделимых рекомбинацией. Исходя из доказанной к тому времени генетической роли нуклеиновых кислот, С. Бензер показал, что наименьшими мутирующими элементами гена являются отдельные пары нуклеотидов ДНК.

Существенную роль в теории гена сыграла концепция «один ген -- один фермент», выдвинутая в 40-е гг. Дж. Бидлом и Э. Тейтемом, согласно которой, каждый ген определяет структуру какого-либо фермента. После множества уточнений эта концепция сводится к тому, что для каждого типа полипептидных цепей в клетке существует так называемый структурный ген, определяющий чередование аминокислотных остатков в ней. Эта концепция вместе с представлениями о сложной структуре гена и генетической роли нуклеиновых кислот послужила отправной точкой для установления Ф. Криком и др. основных параметров генетического кода для белков, а затем его полной расшифровки в 1965г. C. Очоа, М. Ниренбергом и др. К этому времени утвердилось представление об универсальности основных черт строения и функции гена как сложной линейной структуры участка ДНК, который в результате транскрипции и последующей трансляции определяет первичную структуру полипептидной цепи.

Химический состав и строение молекулы ДНК.

Уотсон и Крик предположили, что природная (нативная) молекула ДНК представляет собой две полимерные цепи, соединенные между собой и закрученные в форме двойной спирали.

Основная структурная единица одной цепи -- нуклеотид. Он состоит из трех химически различных частей, соединенных ковалентными связями: дезоксирибозы, азотистого основания и фосфатной группы. ДНК содержит пуриновые азотистые основания -- аденин (А) и гуанин (Г) -- и пиримидиновые основания -- цитозин (Ц) и тимин (Т). Азотистое основание ковалентно соединено с первым атомом углерода сахара и формирует структуру, называемую нуклеозидом. Фосфатные группы соединяют соседние нуклеозиды в полимерную цепочку посредством фосфодиэфирных связей между 5'-атомом углерода одного сахара и 3'-атомом углерода другого. Сцепление между цепями обеспечивается особыми водородными связями между аденином и тимином и между гуанином и цитозином. Водородные связи много слабее ковалентных, соединяющих отдельные атомы каждого нуклеотида, но достаточно сильны, чтобы обеспечить специфичность образования пар А-Т, Г-Ц. Такое попарное сопоставление нуклеотидов, при котором А комплементарен Т, а Г комплементарен Ц, было выведено с помощью построения молекулярных моделей, в которых точно воспроизводились в масштабе все межатомные расстояния. Пространственная модель молекулы ДНК показала характер закрученности цепей друг относительно друга и плотность упаковки пар азотистых оснований в двойной спирали. Кроме того, построение молекулярной модели гипотетической двойной спирали потребовало «антипараллельности» нуклеотидных цепочек.

Нуклеиновые кислоты -- это очень длинные полимерные цепочки. Молекулы ДНК содержат в зависимости от вида организмов от нескольких тысяч до многих миллионов нуклеотидов. Для любой последовательности азотистых оснований возможна равная ей по длине комплементарная последовательность, составляющая вторую цепь двойной спирали. Конкретная последовательность пар А-Т и Г-Ц не влияет на структуру молекулы ДНК, образующей двойную спираль. Возможное число различных последовательностей пар оснований в молекуле ДНК практически бесконечно и способно кодировать колоссальное количество информации.

Из модели следует, что физическая структура природной ДНК может сильно изменяться при нагревании или титровании, когда не нарушаются ковалентные, но разрываются водородные связи, в результате чего две цепи отделяются друг от друга.

Поскольку цепи ДНК комплементарны, каждая из них при расплетании двойной спирали способна служить матрицей для синтеза новой комплементарной цепи. Последовательность оснований во вновь синтезируемой цепи будет определяться спецификой водородных связей между азотистыми основаниями родительской и вновь синтезируемой цепи. Таким образом, генетическая информация, содержавшаяся в последовательности пар оснований родительской молекулы, будет полностью воспроизведена в двух дочерних молекулах. Более того, если в процессе удвоения ДНК произошла ошибка и какой-либо нуклеотид во вновь образуемой цепи выпал или оказался некомплементарным исходному, то это может изменить информационное содержание молекулы, причем логично ожидать, что ошибка будет передана дочерним молекулам ДНК в следующих поколениях. Такая замена пары нуклеотидов будет обладать свойствами генетических мутаций. Модель структуры ДНК Уотсона и Крика объясняет как способность генов к самоудвоению (репликации), так и их информационные свойства.

Генетический код - свойственная живым организмам единая система записи наследственной информации в молекулах нуклеиновых кислот в виде последовательности нуклеотидов; определяет последовательность включения аминокислот в синтезирующуюся полипептидную цепь в соответствии с последовательностью нуклеотидов ДНК гена. В узком смысле генетический код -- словарь кодонов (триплетов иРНК), кодирующих те или иные аминокислоты и знаки пунктуации процесса белкового синтеза. Реализация генетического кода в живых клетках, т. е. синтез белка, кодируемого геном, осуществляется при помощи двух матричных процессов -- транскрипции и трансляции.

Общие свойства генетического кода:

· триплетность (каждая аминокислота кодируется тройкой нуклеотидов);

· неперекрываемость (кодоны одного гена не перекрываются);

· вырожденность (многие аминокислотные остатки кодируются несколькими кодонами);

· однозначность (каждый отдельный кодон кодирует только один аминокислотный остаток);

· компактность (между кодонами в иРНК нет «запятых» -- нуклеотидов, не входящих в последовательность кодонов данного гена);

· универсальность (генетический код одинаков для всех исследованных организмов, хотя известно, что несколько изменённые генетические коды функционируют в митохондриях);

· считывание начинается с определенной точки (начало определяет кодон-инициатор) и идёт в одном направлении в пределах одного гена.

Постановка проблемы генетического кода и теоретическое рассмотрение некоторых возможных его вариантов принадлежат А. Даунсу (1952) и Г. Гамову (1954). Основные свойства генетического кода (триплетность, вырожденность) выявлены в 1961 в генетических экспериментах Ф. Крика и С. Бреннера.

Молекулы ДНК в эукариотических клетках очень велики. Так, длина молекул ДНК, выделенных из клеток человека, достигает нескольких сантиметров. Принято считать, что каждая эукариотическая хромосома содержит одну -- единственную непрерывную молекулу ДНК. Учитывая видовое количество хромосом у млекопитающих, можно сказать, что в среднем у них на интерфазное ядро приходится около 2 м ДНК, находящейся в сферическом ядре диаметром менее 10 мкм. При этом в ядре должен сохраняться определенный порядок расположения молекул ДНК, чтобы обеспечить ее упорядоченное функционирование.

Молекулы ДНК в ядрах эукариотических клеток всегда находятся в комплексе с белками в составе хроматина, представляющего собой нуклео-протеидные нити, из которых состоят хромосомы клеток эукариот. Термин введён В. Флеммингом (1880г.). В цитологии под хроматином подразумевают дисперсное состояние хромосом в интерфазе клеточного цикла. Основные структурные компоненты хроматина -- ДНК (30--45%), гистоны (30--50%) и негистоновые белки (4--33%). На электронных микрофотографиях хроматин напоминает бусы, «снизанные» из нуклеосом -- частиц диаметром около 10 нм. Высшие порядки структурной организации хроматина (хромосомы) образуются из линейного пучка элементарных нитей хроматина-- нуклеосом -- за счёт суперспирализации, образования петель прикрепления к «осевому скелету» из негистоновых белков. В этих процессах участвуют гистоны, ионы металлов и т. д. Различие между активным и неактивным хроматином связывают прежде всего с различиями состава и со структурными переходами последнего (главным образом плотностью упаковки). Возможно, что эти типы хроматина различаются нуклеосомной организацией.

Общая организация хромосом человека традиционна: в метафазе хромосома состоит из двух сестринских хроматид, соединенных между собой в районе первичной перетяжки (центромеры). Центромера делит хроматиду на два плеча. Плечи могут быть равными, тогда хромосома называется мета-центрической. Если одно плечо немного короче другого, то хромосомы именуются субметацентрическими. В нескольких парах хромосом человека одно плечо гораздо короче другого, такие хромосомы носят название акроцентрических. Тонкая морфология хромосом зависит от фазы митоза. Наиболее сильно спирализованы хромосомы в мета- и анафазе.

Информация о первичной структуре полипептидов (последовательности аминокислот в них) записана в ДНК в виде трехбуквенного кода, составленного из первых букв названий четырех азотистых оснований, входящих в состав ДНК (АТГЦ). Каждой аминокислоте соответствует определенный триплет из трех соседних нуклеотидов. Например, аминокислоте фенилаланин в ДНК соответствует кодон AAA, a аминокислоте серин -- АГА. Из 64 возможных триплетов 61 кодирует 20 аминокислот, обнаруженных в составе клеточных белков, а 3 кодона являются стоп-сигналами, прекращающими синтез полипептидной цепи. Если триплет, соответствующий метионину, стоит в начале цепи ДНК, то он выполняет функцию возбуждения считывания. (Кодоны, выполняющие сигнальные функции, называют нонсенс -- кодонами). Генетический код вырожден, т. е. каждая аминокислота может кодироваться несколькими вариантами триплетов. Для осуществления синтеза полипептидов генетическая информация, закодированная в ДНК в составе хроматина, переписывается (процесс транскрипции) по принципу комплементарности азотистых оснований на информационную РНК, которая переходит из ядра в цитоплазму, где принимает участие в процессе трансляции: переводе информации с языка нуклеотидов на язык аминокислот, т. е. процессе синтеза белка. Каждому данному кодону соответствует одна и только одна определенная аминокислота. Процесс считывания генетического кода не допускает возможности перекрывания кодонов. Начавшись на определенном кодоне, считывание следующих идет без знаков препинания и пропусков вплоть до нонсенс-кодонов. Положение первого кодона определяет границы рамки считывания. Генетический код человека не отличается по каким-либо параметрам от генетического кода любых других эукариотических организмов.

В пределах одного гена, который кодирует полипептид, участок молекулы ДНК подразделяется на функционально различные единицы. Отличительная черта строения многих генов эукариот -- прерывистость структуры смысловой части. Смысловые участки, несущие информацию о последовательности аминокислот в белке -- экзоны, чередуются с участками некодирующих последовательностей -- интронами. Часто интроны по длине могут превосходить экзоны. Наличие избыточных последовательностей приводит к тому, что длина гена может быть в несколько раз больше, чем требуется для кодирования аминокислот в белке. Гаплоидный набор хромосом человека содержит 3000000000 нуклеотидных пар, что по количеству соответствует примерно 1,5 млн. пар генов. Однако данные по изучению генома человека показывают, что организм человека имеет не более 100 тыс. генов. Это значит, что в клетках человека только 1% ДНК выполняет кодирующие функции. В отношении оставшихся 99% существуют разные гипотезы, обосновывающие их регуляторные и структурные функции.

Процесс транскрипции на ДНК, как на матрице, связан с синтезом комплементарной последовательности РНК, включающей и интроны, и экзоны. Затем в ходе созревания РНК в ядре из нее удаляются интроны, а концы соседних экзонов сшиваются стык в стык. Процесс удаления последовательностей РНК, соответствующих интронам, и соединение участков с транскрибируемыми последовательностями экзонов называется сплайсингом.

История развития цитогенетики человека.

Впервые митотические хромосомы человека были описаны в работах Дж. Арнольда (1879) и В. Флемминга (1882). В последующие годы различные оценки их количества давали результаты от 47 до 49 хромосом, причем у мужчин и женщин находили разное их число. Эти первые исследования проводились на гистологических срезах яичников. В то время техника получения срезов была такова, что митозы в готовых препаратах были, как правило, разрушены. Хромосомы на них накладывались одна на другую, образовывали клубки и плохо поддавались анализу. Эти трудности удалось преодолеть только к 50-м гг. XX в., когда для получения препаратов хромосом стали использовать суспензии клеток, выращенных в клеточных культурах. Пользуясь подобным методическим подходом, в 1955 году А. Леван и Дж. Тио, изучив 261 метафазную пластинку, пришли к выводу, что количество хромосом в клетках человека равно 46, причем как в мужских, так и в женских клетках. Эти результаты ознаменовали возникновение новой отрасли исследований -- клинической цитогенетики. В настоящее время цитогенетика человека достигла высокого уровня и находится на переднем крае фундаментальной цитогенетики.

Нормальный кариотип человека.

Препараты хромосом человека можно приготовить из любых тканей и клеточных суспензии, если в них содержатся делящиеся клетки, т. к. вне деления (во время интерфазы) хромосомы деспирализуются и переходят в состояние хроматина. Чаще всего препараты готовят из клеток костного мозга, кратковременной культуры клеток крови. Когда с помощью стандартных методов хромосомы окрашиваются целиком, равномерно и интенсивно, их систематизируют согласно Денверской классификации, принятой в 1960 г., нумеруя пары хромосом от 1 до 23.

Учитывая относительную длину плечей, положение центромеры и центромерный индекс, который отражает процентное соотношение длин короткого плеча и всей хромосомы, 23 пары хромосом человека разбивают на 7 групп. В группу А (№ 1-3) входят пары наиболее крупных метацентрических аутосом. Группа В (№ 4-5) объединяет две пары субметацентрических хромосом, неразличимых между собой. Группа С (№ 6-12) содержит семь пар аутосом среднего размера. Размеры и форма этих хромосом неодинаковы, однако стандартные методы окрашивания не позволяют их идентифицировать. В группу D (№ 13-15) объединены три пары акроцентрических хромосом среднего размера, морфологически сходных между собой. Все хромосомы группы D содержат спутник, который не всегда выявляется, может быть очень большим, а иногда и двойным. Длина короткого плеча этих хромосом также изменчива. К группе Е (№ 16-18) относятся три пары почти метацентрических хромосом, из которых в 16-й паре центромера наиболее близка к середине, а две другие пары неотличимы друг от друга. Группа F содержит мелкие метацентрические аутосомы (№ 19-20), группа G -- мелкие акроцентрические (№ 21-22). Внутри групп F и G пары хромосом неразличимы. Длина коротких плечей у них изменчива, как и у хромосом группы D. Перечисленные 22 пары хромосом относятся к аутосомам, одинаковым у мужчин и женщин.

Половые хромосомы составляют 23-ю пару. У женщин -- это две Х-хромосомы. У мужчин -- Х- и Y-хромосомы. Половая Х-хромосома неотличима от аутосом группы С. Мужская половая Y-хромосома является акроцентрической, сходна по морфологии с хромосомами группы G, но ее легко отличить по морфологическим критериям. Длина короткого плеча Y-хромосомы изменчива и индивидуальна, причем варианты длины плеча наследуются от отца к сыну. Y-хромосома, в отличие от хромосом последней группы, не имеет спутников.

Во многих хромосомах человека обнаружены ломкие (фрагильные) участки, подверженные хромосомным и хроматидным разрывам. Такие разрывы легко получить в клеточных культурах, удаляя фолиевую кислоту из питательной среды культивируемых клеток, В настоящее время показано, что одна из форм умственной отсталости человека связана с наличием определенного фрагильного участка в концевом районе длинного плеча Х-хромосомы.

Половой гетерохроматин.

В соматических клетках женщин половой хроматин выявляется в виде гетерохроматина -- небольшой хорошо окрашенной округлой структуры, размером 0,8-1,1 мкм, находящейся возле ядерной мембраны. Половой хроматин называют также тельцем Барра, т. к. впервые он был описан этим ученым в нейронах кошки. Позже оказалось, что половой гетерохроматин присутствует в соматических клетках всех млекопитающих женского пола, в том числе и человека. Половой гетерохроматин -- это одна из Х-хромосом, которая находится в неактивном, суперспирализованном состоянии. Известно, что фенотипически пол у человека определяется наличием или отсутствием Y-хромосомы, а не количеством Х-хромосом. Если в кариотипе зиготы присутствует хотя бы одна Y-хромосома, а количество Х-хромосом превышает единицу, то по фенотипу формируется мужчина. Количество телец Барра в клетках всегда на одно меньше, чем число Х-хромосом. То есть только одна Х-хромосома в соматических клетках человека, и мужчины, и женщины, всегда находится в активном состоянии. В норме женщина имеет две, а мужчина одну Х-хромосому, в связи с чем инактивация второй Х-хромосомы у женщин в виде полового гетерохроматина служит механизмом компенсации различий в дозе генов, не оказывающих влияния на развитие половых признаков и признаков, сцепленных с Х-хромосомой. Этот же механизм оказался фактором, благоприятствующим носителям Х-хромосомных анеуплоидий. Какое бы количество Х-хромосом они не несли, генетически активна только одна. Остальные же Х-хромосомы существуют в виде факультативного полового гетерохроматина. Поэтому по количеству телец Барра в соматических клетках можно диагносцировать форму анеуплоидий. Например, у женщин с кариотипом 47, XXX обнаруживаются два тельца Барра, а с кариотипом 45, ХО -- ни одного. У мужчин с кариотипом XXY -- одно.

Программа «Геном человека».

С развитием новых технологий молекулярных исследований, основанных на быстрых методах работы с ДНК, с введением в практику молекулярно-генетических исследований компьютерных технологий сравнительного анализа строения геномов представителей разных систематических групп, с развитием техники направленного воздействия на генетический аппарат клетки и организма в целом и возможности создания искусственных ферментов по нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК темпы развития молекулярной генетики обрели стремительный характер и привели к возникновению в конце 80-х гг. международной программы «Геном человека». Этот глобальный проект предполагал завершить определение полной последовательности всех трех миллиардов нуклеотидных звеньев, составляющих геном человека. Принятие такой программы означает, что характер развития молекулярной биологии достиг совершенно нового уровня. Произошедший качественный скачок в технологии позволяет решать принципиально новые задачи.

Более ранние молекулярно-генетические работы проводились с целью исследовать строение генов, идентифицировать их в целом геноме, изучить по возможности функцию гена и уровни его регуляции. Методы современной молекулярной генетики позволяют отследить эффект действия того или иного гена на уровне целого организма, изучать не отдельные гены, а структуры и функции целых геномов. На сегодняшний день изучены геномы 141 вируса, более 50 геномов митохондрий из разных объектов, большое количество геномов бактерий. Установлено, что бактериальный геном содержит 5-6 тыс. генов, из представителей эукариот наиболее близки к завершению изучение геномов дрожжей и нематод. Показано, что геном дрожжей имеет в своем составе около 6 тыс. генов.

Суммарная длина нуклеотидных последовательностей генома человека соответствует 3 миллиардам. По данным разных авторов, такая гигантская нуклеотидная последовательность может содержать от 50 до 100 тыс. генов. В настоящее время известна структура около 7 тыс. генов. Изучение структуры генов -- не конечная цель программы. Помимо анализа последовательности нуклеотидов, проводится их картирование. Каждый ген приписывается к определенной хромосоме в строго определенное место -- локус, устанавливается расстояние между генами, составляется карта хромосом человека. В настоящее время картированы около 8 тыс. генов. Увеличению скорости картирования генов на хромосомах способствует выявление маркерных последовательностей для каждой хромосомы. Эти маркерные последовательности много раз повторяются вдоль хромосомы и как бы делят ее на ограниченные участки. Работа с таким небольшим участком хромосомы облегчает процедуру выделения гена. Благодаря существованию маркерных последовательностей, геном человека разбит на отдельные фрагменты, и каждый фрагмент в случае необходимости может быть легко размножен вне организма.

Помимо задачи картирования генов и установления их структуры, программа «Геном человека» ставит цель определить структурно-функциональную взаимосвязь генов. Для решения этой задачи используются совершенно новые подходы, которые просто невозможно было представить себе несколько лет назад. Так, по дефектному ферменту, который является причиной наследственного заболевания, зная последовательность аминокислот в его составе, можно искусственно синтезировать информационную РНК, а затем соответствующий участок ДНК, идентифицировать его на хромосомной карте, выделить нативный ген и клонировать его вне организма, чтобы установить, в чем причина образования дефектного фермента. Таким способом были изучены гены дистрофии Дюшена, рака молочной железы, мутантной фенилаланингидроксилазы, являющейся причиной наследственной фенилкетонурии, и ряда других генов.

Еще один новый методический подход в изучении функции генов связан с использованием информационно-компьютерных технологий. Этот путь исследований основан на следующем предположении: если у представителей разных систематических групп имеются одинаковые по структуре гены, то они выполняют одинаковую функцию. Таким образом, была установлена причина развития рака толстой кишки у человека. Методами клонирования и картирования была изучена структура генов, отвечающих за развитие рака толстой кишки. Затем был проведен поиск в информационном поле с помощью компьютерных технологий. В процессе этого поиска была предпринята попытка найти в геноме дрожжей, который уже полностью расшифрован, гены, сходные по структуре с исследуемыми генами человека. И они были обнаружены. Оказалось, что у дрожжей такие же гены отвечают за репарацию ДНК. Таким образом, было установлено, что рак толстой кишки связан с мутациями генов, кодирующих ферменты репарации ДНК.

Важнейшую роль в структурных исследованиях генома человека играет изучение его полиморфизма. Популяционный полиморфизм генома человека является основой для понимания принципов молекулярной эволюции, механизмов возникновения патологических мутаций, для оценки факторов риска при воздействии потенциально токсических агентов окружающей среды на человеческий организм, наконец, для понимания основ различной индивидуальной восприимчивости лекарств. Эти исследования получили новый импульс с открытием полиморфных мини- и макросателлитных последовательностей ДНК, которые используют в качестве маркеров при картировании генома человека.

Новым этапом в изучении структурно-функциональных связей между генами в программе «Геном человека» является возможность клонирования крупных фрагментов генома в специальных векторах, способных размножаться в клетках вместе со встроенными в них фрагментами.

Выполнение программы «Геном человека» приближает возможность использования генной терапии для лечения патологий, связанных с изменением наследственной информации. Генная терапия основана на введении в организм больного искусственных генетических конструкций. Лечебный эффект достигается в результате работы введенного гена либо за счет подавления функции «больного» гена. Современная генная терапия делает первые шаги и имеет дело с соматическими клетками в постнатальном периоде жизни человека, но в то же время разрабатываются подходы к генной терапии клеток эмбриона.

Перспектива использования достижений программы «Геном человека» многопланова: от идентификации генов, ответственных за возникновение наследственных и приобретенных заболеваний, до развития систем лечения, основанных на введении в организм новой генетической информации, корректирующей генетические дефекты (генная терапия), и интенсивных методов диагностики, основанных на выявлении генетических дефектов, и перехода в диагностике к наиболее полному обследованию популяций для выявления предрасположенности к болезни.

4. Передача генетического материала

Материальной основой биологической преемственности поколений у человека является процесс оплодотворения: слияние гамет -- яйцеклетки и сперматозоида -- с образованием зиготы. Каждая из гамет приносит равное количество хромосом. Если число хромосом в гамете обозначить буквой n (гаплоидный набор), то число хромосом в зиготе будет равно 2n (диплоидный набор). Образовавшаяся зигота многократно делится митозом и дает начало новому организму. В результате каждого митотического деления из одной клетки образуются две дочерние. Число хромосом в них идентично их числу в родительской клетке, равно как и качественный набор генетического материала. Образование гамет у человека, как и у других многоклеточных эукариотических организмов, связано с мейотическим делением. В результате этого деления количество хромосом в половых клетках уменьшается в 2 раза и становится гаплоидным (n). Равные по числу хромосом, образовавшиеся гаметы отличаются друг от друга по качеству генетического материала в результате двух видов генетической рекомбинации: независимого распределения гомологичных хромосом к полюсам деления и обмена участками между гомологичными хромосомами в процессе кроссинговера.

Митоз. Клеточный цикл.

Общепризнано, что митоз -- это самый древний способ клеточного размножения, а все остальные формы деления возникли в процессе эволюции как его регуляционные или патологические изменения. В основе этого взгляда лежит представление о митозе как надежном способе распределения наследственного материала между дочерними клетками. Характерной чертой митоза является авторегуляция, проявляющаяся в цикличности протекания событий, связанных с подготовкой клеток к митозу и самим процессом деления. Эта цикличность послужила основанием для возникновения понятия о митотическом цикле.

Известно, что делящаяся клетка, а вместе с ней и ядро, могут находиться в двух состояниях: в митозе (деление) и интерфазе (состояние между двумя митозами). Во время митоза наследственная информация, упакованная в хромосомах, поровну распределяется между дочерними клетками. В интерфазе, когда геном находится в «рабочем состоянии», наследственная информация реализуется. При этом хромосомы переходят в состояние хроматина. Суперспирализованная с помощью специальных белков ДНК, частично раскручивается, сохраняя структуру двойной спирали.

На молекулах ДНК как на матрицах, по принципу комплементарности, синтезируются все три типа молекул РНК: информационная, транспортная и рибосомная. Новосинтезированные молекулы РНК в комплексе с белками дозревают и покидают ядро, попадая в цитоплазму, где с их участием происходит синтез белков.

Интерфаза подразделяется на три периода: G1; S и G2. В период G1 дочерние клетки вступают после митоза. Количество хромосом в них диплоидное, каждая хромосома состоит из одной хроматиды. Соответственно у человека количество двуспиральных молекул ДНК равно 46, по одной нитевидной молекуле на хромосому, перешедшую в состояние хроматина. Объем же клеток, общее содержание органелл, белков и РНК вдвое меньше, чем в исходной родительской клетке. В это время начинается рост клеток за счет накопления клеточных белков, мембранных структур и органелл. Продолжительность периода G1 непостоянна, и, в отличие от других фаз клеточного цикла, может изменяться от нулевых значений до многих часов, (в некоторых случаях даже месяцев) в зависимости от сроков эмбрио- и онтогенеза, от особенностей ткани и ряда других факторов.

В S-периоде удваивается ДНК каждой хроматиновой нити, при этом общее количество ДНК возрастает в 2 раза. В клетках человека, как и в эукариотических клетках других организмов, репликация ДНК происходит одновременно на множестве отдельных участков вдоль каждой хромосомы с последующим соединением концов, образовавшихся соседних отрезков. За счет того, что репликация происходит в сотнях точек, сокращается время, необходимое для удвоения молекул ДНК, длина которых у человека измеряется в сантиметрах. Продолжительность S-периода у млекопитающих варьирует в пределах от 7 до 9 ч. Во время и после репликации сестринские хроматиды могут обмениваться сегментами: идет процесс сестринских хроматидных обменов. Так что обе хроматиды митотической хромосомы содержат участки другой хроматиды. В этом можно убедиться с помощью специального окрашивания хромосом.

В результате репликации образуются две идентичные молекулы ДНК, упакованные с помощью белков в хроматине. Эти молекулы отделены друг от друга, но остаются соединенными в центромерном районе хромосом. Центромера располагается внутри гетерохроматического района. Предполагается, что гетерохроматин обеспечивает ее стабильность. В районе центромеры расположена сателлитная ДНК, представленная кластерами высокоповторяющихся последовательностей. Кроме того, внутри центромеры находятся уникальные последовательности ДНК, которые, как полагают, несут информацию о расхождении хромосом к противоположным полюсам клетки.

Наличие множества точек начала репликации ДНК на каждой хромосоме не означает одновременного начала этого процесса в каждой точке. Для репликации в клетках человека характерна асинхронность его в разных участках хромосом. В то же время порядок репликации участков каждой хромосомы строго постоянен, поэтому воспроизведение его последовательности служит важнейшей характеристикой каждой хромосомы человека.

Каждая хромосома состоит из участков, реплицированных в разное время. Районы с ранней и поздней репликацией четко чередуются. В метафазной хромосоме расположение светлых и темных участков можно видеть с помощью светового микроскопа. Строгая специфичность картины позволяет уверенно идентифицировать хромосомы в норме, а также при изменении кариотипа в целом, равно как и отдельной хромосомы.

В G2-периоде число молекул ДНК -- удвоенное. Количественное содержание ДНК соответствует тетраплоидному (4п) набору хромосом. Уровень синтеза РНК и белка достигает максимума. Клетки готовятся к вступлению в митоз, поэтому иначе эта часть клеточного цикла называется премитотическим периодом. Продолжительность G2-периода у млекопитающих около 4 ч.

Процесс митоза в соматических клетках человека идет стандартно. К концу профазы хромосомы становятся отчетливо видимыми, причем каждая состоит из двух хроматид. Обе сестринские хроматиды прилежат одна к другой. Центромера во всех хромосомах представлена небольшой светлой кольцеобразной зоной. Она удерживает две сестринские хроматиды вместе. Ядрышко исчезает, ядерная оболочка распадается на фрагменты. Хромосомы располагаются в цитоплазме центральной части клетки, оттесняя все органоиды к периферии.

Во время метафазы центромеры всех хромосом располагаются в экваториальной плоскости между двумя полюсами клетки. В это время они утрачивают вид четко выраженной перетяжки. Хроматиды каждой хромосомы начинают отделяться одна от другой, оставаясь соединенными только в центромерной области. В районе же центромер с противоположных сторон прикрепляются нити веретена деления. Их количество может достигать нескольких десятков в районе каждой центромеры.

Анафаза начинается с одновременного разделения всех центромер и расхождения сестринских хроматид каждой хромосомы к противоположным полюсам. Утрата синхронности этого процесса может привести к неправильному их расхождению. Центромеры с помощью специальных белков связываются с нитями веретена деления, которые и увлекают за собой дочерние хроматиды к противоположным полюсам. Анафаза заканчивается с прекращением движения хроматид, которые становятся хромосомами. У каждого полюса клетки должно оказаться по 46 состоящих из одной хроматиды таких хромосом.

Телофаза связана с образованием ядерных оболочек вокруг хромосом на двух полюсах клетки и началом перехода хромосом в состояние хроматина. Завершается телофаза возникновением перетяжки в центральной части делящейся клетки, которая завершает деление клетки надвое.

Значение митоза.

1. Генетическая стабильность. В результате митоза получаются два ядра, содержащие каждое столько же хромосом, сколько их было в родительском ядре. Эти хромосомы происходят от родительских хромосом путем точной репликации ДНК, поэтому гены их содержат совершенно одинаковую наследственную информацию. Дочерние клетки генетически идентичны родительской клетке, так что никаких изменений в генетическую информацию митоз внести не может. Поэтому клеточные популяции (клоны), происходящие от родительских клеток, обладают генетической стабильностью.

2. Рост. В результате митозов число клеток в организме увеличивается (процесс, известный под названием гиперплазии), что представляет собой один из главных механизмов роста.

3. Регенерация.

4. Замещение клеток.

Для эукариот известно, что прохождение митоза может быть заблокировано, физиологически или экспериментально, что приводит к развитию полиплоидных клеток. Системная полиплоидия не характерна для человека. Так, полиплоидные эмбрионы погибают на ранних стадиях развития, и это -- одна из причин спонтанного прерывания беременности на ранних сроках. В то же время наличие полиплоидных клеток в некоторых органах человека не является патологией. Они встречаются в сердечной мышце, особенно в предсердиях, в печени и ряде желез. При этом клетки могут быть одноядерными и двуядерными, а уровень их полиплоидии невысок: обычно в пределах 4 -- 8n.

Мейоз.

Мейоз -- это особый тип клеточного деления, возникший с появлением полового размножения, при котором два родителя -- отец и мать -- дают начало новому организму. В процессе оплодотворения сливаются гаплоидные ядра половых клеток родителей, что вдвое увеличивает количество хромосом в зиготе. Следовательно, при образовании половых клеток должно в два раза уменьшаться количество хромосом, но таким образом, чтобы совокупность генетического материала обеспечивала преемственность поколений. Закономерное чередование репликации ДНК (а соответственно и хромосом), митозов и мейозов обеспечивает сохранение видоспецифического кариотипа как в индивидуальном развитии -- онтогенезе, так и в череде поколений организмов.

При мейозе из одной диплоидной клетки образуется 4 гаплоидных. Кроме того, в ходе этого деления происходит два вида перегруппировки генетического материала хромосом, т.е. два вида генетической рекомбинации:

1) независимое распределение гомологичных хромосом к полюсам деления;

2) кроссинговер -- обмен участками между гомологичными хромосомами.

Эти процессы обеспечивают широчайший спектр наследственной изменчивости и генетическую неповторимость индивидов даже среди потомков одной пары родителей.

Изучение мейоза у человека связано с определенными методическими трудностями из-за недоступности экспериментального материала. Обычно мейоз изучают, культивируя in vitro яичники эмбриона женского пола старше трех месяцев из материала аборта. Кроме того, используют материал биопсии семенников и яичников, полученный при хирургическом вмешательстве по медицинским показаниям, а также трупный материал.

Мейоз состоит из двух делений, следующих друг за другом, между которыми, что важно, не происходит удвоение ДНК, а, следовательно, и хромосом. Перед мейозом обязательно проходит интерфаза, в S-периоде которой ДНК реплицируется. Следовательно, в профазе I мейотического деления нитевидные хромосомы состоят из двух хроматид. Каждое из двух делений мейоза состоит из про-, мета-, ана- и телофазы с индексами I или II. Первое мейотическое деление протекает значительно дольше, чем второе.

Самой длительной фазой первого мейотического деления является профаза, так как именно в ней происходят такие сложные процессы как образование бивалентов из гомологичных хромосом и кроссинговер. У женщин профаза мейоза I активно протекает в течение нескольких месяцев в период внутриутробного развития, а полностью завершается к моменту овуляции в половозрелом возрасте. Длительность этого периода у женщин объясняется также одновременным протеканием процесса дифференцировки и созревания цитоплазмы будущей яйцеклетки. У мужчин длительность профазы мейоза I составляет 20 -- 25 суток.

Профаза мейоза I подразделяется на 5 подфаз: лептотена, зиготена, пахитена, диплотена и диакинез.

Лептотена -- стадия тонких нитей. Ядра клеток, вступающих в мейоз, значительно крупнее других. В этих ядрах вместо хроматина выявляются столь тонкие и длинные нитевидные хромосомы, что их трудно проследить по всей длине. Для лептотены характерно также появление на тонких хромосомах особых структур, напоминающих бусины. Это хромомеры -- участки более сильно конденсированного хроматина. Число, размер и расположение хромомер специфичны для каждой хромосомы. Появление хромомерных структур отражает постепенный процесс конденсации хромосом из хроматина. Каждая хромосома состоит из двух сестринских хроматид, но их далеко не всегда удается различить под световым микроскопом, настолько близко они прилегают друг к другу.

Зиготена -- стадия сливающихся нитей. На этой стадии гомологичные хромосомы находят друг друга и сливаются (конъюгируют) с образованием бивалента. 46 хромосом человека конъюгируют в 23 пары гомологичных хромосом, следовательно, количество бивалентов равно 23 и соответствует гаплоидному хромосомному набору.

Бивалент -- это стабильная структура из двух гомологичных хромосом и, соответственно, из 4 хроматид. Объединение гомологов чаще всего начинается на концах хромосом -- в теломерах, а также в центромерных районах. Позднее внутри бивалента по длине соединяющихся хромосом формируются сближающие их белковые тяжи синаптонемного комплекса.

В настоящее время выявлена специфичность хромомерного строения индивидуальных бивалентов человека в мужском и женском мейозе, т.е. по рисунку хромомер можно определить, какая пара хромосом образует тот или иной бивалент, даже если по размеру и общей морфологии биваленты одинаковы. Конъюгация гомологичных хромосом с образованием бивалентов обязательна для всех хромосом человека, включая короткие и половые хромосомы. Известно, что конъюгация происходит не только между половыми хромосомами X и X, но также между X и Y хромосомами, несмотря на значительное превосходство в размерах Х-хромосомы.

В процессе сперматогенеза образование полового бивалента из X и Y хромосом начинается раньше других. При этом конъюгируют между собой часть короткого плеча Х- и короткое плечо Y-хромосом. Эксперименты по гибридизации ДНК показали, что эти районы гомологичны между собой. Негомологичные участки X и Y хромосом остаются свободными. Зиготена заканчивается образованием 23 бивалентов.

Пахитена -- стадия прохождения кроссинговера. В пахитене хромосомы выявляются в виде толстых нитей, поскольку они представлены бивалентами. Именно в бивалентах и происходит кроссинговер: взаимный обмен идентичными участками по длине гомологичных хромосом. Генетическим следствием кроссинговера является рекомбинация сцепленных генов, что обеспечивает широкую генетическую изменчивость гамет. Морфологически этот процесс в пахитене уловить нельзя. Процесс обмена участками между ДНК несестренских хроматид в бивалентах можно представить следующим образом. По длине хромосомы разбросаны зоны повторяющихся последовательностей ДНК. С помощью ферментов-рестриктаз целостность их может легко нарушаться, при этом однонитевые участки молекул ДНК соседних несестринских хроматид могут образовывать короткие двунитевые гибриды. Другие, репарирующие ферменты способны восстанавливать целостность поврежденных участков. Таким образом, кроссинговер -- это процесс, происходящий со сложными пространственными изменениями суперспирализованных участков молекул ДНК несестренских хроматид с использованием целого комплекса ферментов, объединенных в специализированную структуру.

Позже, в следующей стадии, когда гомологичные хромосомы в бивалентах начинают расходиться, выявляются места, где происходил процесс кроссинговера. В них гомологичные хромосомы во время разрушения бивалентов соединены дольше всего. Поскольку морфологически они напоминают греческую букву "X", их называют хиазмами. В зоне хиазм видно, что в перекрест вовлекаются только хроматиды из четырех: по одной от каждого гомолога.

Диплотена -- стадия двойных нитей. На этой стадии синаптонемный комплекс разрушается, и гомологи отталкиваются друг от друга, оставаясь соединенными только в районе хиазм, где по-прежнему сохраняется структура синаптонемного комплекса. Поскольку каждая хиазма соответствует одному событию кроссинговера, в котором участвуют две несестренские хроматиды, то по количеству хиазм можно судить об интенсивности процесса кроссинговера. По данным равных авторов, общее число хиазм на хромосомный набор человека колеблется от 35 до 66. Некоторые биваленты могут содержать несколько (до 5-6) хиазм. В среднем на бивалент их приходится около двух. Анализ генетического сцепления показал, что кроссинговер у женщин происходит чаще, чем у мужчин, следовательно, и хиазм у женщин должно быть больше.

Диакинез -- стадия, завершающая профазу мейоза I. Она является переходной к метафазе. Число хиазм в ней уменьшается, биваленты укорачиваются, разрушается ядро, начинает формироваться веретено деления.

В метафазе I биваленты располагаются в экваториальной плоскости, в цитоплазме. Центромеры хромосом лежат на экваторе, к ним прикреплены нити веретена деления. Число выстроившихся бивалентов соответствует гаплоидному набору хромосом и у человека равно 23.

В анафазе I происходит расхождение гомологичных хромосом к противоположным полюсам клетки. Каждая хромосома состоит из двух сестринских хроматид.

Телофаза I. В этой фазе происходит образование двух дочерних ядер, каждое из которых содержит гаплоидное число хромосом, равное 23. Каждая хромосома состоит из двух сестринских хроматид.

Второе мейотическое деление начинается почти сразу. Оно идет по схеме митоза: 23 хромосомы, состоящие из парных сестринских хроматид, связанных в центромерных участках, в каждом из двух образованных ядер проходят профазу и метафазу. В анафазе они разъединяются и расходятся к противоположным полюсам, в результате чего образуется четыре гаплоидных ядра, различающихся по качеству генетической информации.

Рекомбинация генетического материала в мейозе осуществляется не только за счет кроссинговера. В анафазе первого мейотического деления происходит случайное по отношению к полюсам клетки распределение гомологичных хромосом из каждого бивалента, что приводит к возникновению большого числа комбинаций отцовских и материнских хромосом в гаметах. Рассмотрим этот процесс подробнее, проанализировав распределение первой и второй пары гомологичных хромосом в анафазе I. Известно, что в каждой паре гомологичных хромосом зиготы одна хромосома приходит из гаметы отца, другая -- из гаметы матери. Обозначим заглавными буквами хромосомы отца, а прописными -- хромосомы матери. А и а -- первая пара хромосом, В и b -- вторая пара. В профазе I образуются биваленты. В метафазе I они выстраиваются в экваториальной плоскости. В анафазе I гомологичные хромосомы расходятся к противоположным полюсам: к одному полюсу пойдут хромосомы А и В, то есть отцовские, а к другому а и b, то есть материнские. Но у этого события может быть и другой исход, когда расположение хромосом в метафазе на экваторе будет другим. Тогда к одному полюсу пойдут хромосомы А и b, а к другому -- а и В, то есть сочетание хромосом на полюсах будет: одна отцовская, одна материнская. Наличие двух пар гомологичных хромосом обеспечивает, как мы видим, образование четырех типов гамет, качественно отличающихся друг от друга сочетанием отцовских и материнских хромосом. У человека 23 пары хромосом, и разнообразие гамет оценивается как 223, что примерно равно 10 миллионам вариантов сочетаний отцовских и материнских хромосом. При оплодотворении практически равновероятна встреча любого из сперматозоидов с яйцеклеткой. Это увеличивает число возможных генотипов детей до 223 х 223. Частота генетической рекомбинации в результате независимого распределения разных пар гомологов выше, чем частота рекомбинации в результате кроссинговера.

Табл. 1. Различия между митозом и мейозом

Сходства между митозом и мейозом.

Главные черты сходства между митозом и мейозом касаются механизмов, с помощью которых хромосомы и другие клеточные органеллы реплицируются и перемещаются в клетке перед ее делением и во время самого деления. Механизмы цитокинеза при митозе и мейозе тоже сходны.

5. Виды и механизмы мутаций генотипа человека

Стабильность генетического аппарата и обусловливаемый этим аппаратом консерватизм наследственности -- лишь одна сторона биологических закономерностей. Другая ее сторона, столь же неотъемлемая от живого, как и первая, -- изменчивость. Наследственность и изменчивость в совокупности обеспечили и сохранение жизни на Земле, и непрекращающуюся биологическую эволюцию. Наследственная изменчивость организма обеспечивает его приспособляемость к условиям существования как в пределах жизни одного индивида, так и в рамках существования биологического вида в целом.

Изменчивость наследственных признаков

Наследственное многообразие человека -- результат длительной эволюции живой материи. Эволюция человека как биологического и социального существа имеет свои особенности. У человека как социального существа естественный отбор со временем принимал все более специфические формы, что, безусловно, расширяло наследственное разнообразие популяций. Сохранялось то, что могло «отметаться» у животных, или, наоборот, терялось то, что животным нужно. Например, более полноценное обеспечение пищей и возможность удовлетворять потребность в витамине С привели к тому, что человек в процессе эволюции утерял ген L-гулонолактоноксидазы, катализирующей у животных синтез аскорбиновой кислоты. Этот ген у животных предохраняет их от цинги, а человек из-за такой «всеобщей врожденной ошибки метаболизма» подвержен авитаминозу С. В процессе эволюции человек приобретал и нежелательные признаки, имеющие прямое отношение к патологии. Большинство видов животных невосприимчивы к дифтерийному токсину и вирусу полиомиелита, потому что у животных отсутствуют компоненты мембраны клеток, обеспечивающие восприятие того или другого патогенного фактора. У человека эти компоненты есть. Гены, их детерминирующие, уже идентифицированы. Например, ген для восприятия дифтерийного токсина локализован в хромосоме 5, для вируса полиомиелита -- в хромосоме 19.

Большинство мутаций увеличивают полиморфизм человеческих популяций (группа крови, цвет волос, рост, разрез глаз и др.), но иногда мутации затрагивают жизненно важные функции, а это приводит к болезни. Таким образом, наследственная патология -- это часть наследственной изменчивости, накопившейся за время эволюции человека. Человек, став биологическим видом Homo sapiens, как бы заплатил за «сапиентацию» своего вида накоплением патологических мутаций. На основе этих положений формулируется одна из главных концепций генетики об эволюционном накоплении патологических мутаций в человеческих популяциях. Подтверждением этой концепции служат патологические мутации у животных, сходные по проявлениям с наследственными болезнями у человека (ахондроплазии, гемофилии, мышечные дистрофии и др.), а также наследственные болезни у людей, живших несколько тысячелетий назад (об этом можно судить по находкам скелетов с признаками патологических процессов в раскопках и по произведениям искусства).

Основным источником многообразия наследственных признаков и их непрекращающейся эволюции служит мутационная изменчивость. Способность ДНК мутировать сложилась в эволюции и закрепилась отбором, по-видимому, так же, как и способность противостоять мутационным изменениям, т.е. репарировать их. В организации ДНК заложена возможность ошибок ее репликации наряду с возможностью изменения первичной структуры. Вероятность сбоя в точности репликации молекулы ДНК невелика и составляет 1:10-5--1:10-7. Однако, принимая во внимание исключительно большое число нуклеотидов в геноме (3,2-109 на гаплоидный набор), следует признать, что в сумме на геном клетки на одно ее поколение приходится несколько мутаций в структурных генах. По мнению разных авторов, каждый индивид наследует 2--3 новые вредные мутации, которые могут давать летальный эффект или подхватываться отбором, увеличивая генетическое разнообразие человеческих популяций.