Протеомный профиль мочи здорового человека в норме и при действии факторов космического полета

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации

Институт медико-биологических проблем

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

14.03.08 - Авиационная, космическая и морская медицина

Диссертация

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Протеомный профиль мочи здорового человека в норме и при действии факторов космического полета

Консультанты:

Ларина Ирина Михайловна,

доктор медицинских наук, профессор, ГНЦ РФ - ИМБП РАН

Николаев Евгений Николаевич,

доктор физико-математических наук, профессор, ИБХФ РАН

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

иммерсия физиологический возрастной моча

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В настоящее время одним из интенсивно развивающихся направлений системной биологии является протеомика, изучающая белковый состав клеток, тканей, биологических жидкостей, организмов с использованием высокопроизводительных методов масс-спектрометрии [Ларина И.М., Иванисенко В.А., Николаев Е.Н., Григорьев А.И., 2014; Mischak H., Thongboonkerd V., Schanstra J.P., Vlahou A., 2011; Metzger J. et al., 2013]. Протеомика появилась в результате постепенного развития и усложнения классических методов исследования белков, начиная с гравиметрических и фотометрических до диск-электрофореза, градиентного и двумерного электрофореза. В настоящее время достаточно уверенно поддаются идентификации до 15,5 тысяч белков человека [Court M. et al., 2011; Marimuthu A. et al., 2011; Bensimon A., Heck A.J.R., Aebersold R., 2012]. Известно, что все функции в организме осуществляют белки, что справедливо и для адаптации, которая осуществляется путем изменения спектра и количества работающих белков, которые формируют мультибелковые комплексы, с одной стороны, и сложные функциональные и динамичные сети, с другой [Терентьев А.А., Молдогазиева Н.Т., Шайтан К.В., 2009; Naylor S., Chen J.Y., 2010; Bose B., 2013]. Организация в функциональные модули отражает сложность и разнообразие протеома на субклеточном, клеточном и органном уровне. Белки, синтезируемые в различных типах клеток, имеют значительное представительство в биологических жидкостях организма человека, таких как кровь, моча, слюна, конденсат выдыхаемого воздуха [Hiemstra T.F. et al., 2011; Metzger J. et al., 2013]. Состав этих сред может дать представление о механизмах адаптационных перестроек функций, что имеет громадное фундаментальное значение для физиологии, поскольку вскрывает пути приспособления сложной системы, которой является живой организм, поддерживающий постоянство состава внутренней среды, и осуществляющий активный поиск наиболее оптимального и устойчивого состояния, к необычному и никогда не встречавшемуся в эволюции биосферы Земли фактору - невесомости [Нефедов В.П., Ясайтис А.А., Новосельцев В.Н., 1991; Наточин Ю.В., 2008].

Экстремальные условия представляют собой один из немногих способов, позволяющих вызвать отклонение гомеостаза у здорового человека, для распознавания механизмов поддержания постоянства состава внутренней среды и сохранения резервов здоровья, адаптивного потенциала организма [Балаховский И.С., Наточин Ю.В., 1973; Григорьев А.И., Ларина И.М., Носков В.Б., 2006; Носков В.Б., 2013; Leach Huntoon C.S., Grigoriev A.I., Natochin Yu.V., 1998; Norsk P. et al., 2000; Drummer C. et al., 2000; Kotovskaya A.R., Fomina G.A., 2013]. Список методов (условий), этически дозволенных и доступных для воздействий на здорового человека, приводящих к отклонению его гомеостаза, относительно короткий и включает в себя физические нагрузки, использование фармпрепаратов, манипуляции с питанием [Ларина И.М., Иванисенко В.А., Николаев Е.Н., Григорьев А.И., 2014; Edwards L.M. et al., 2012; Titze J. et al., 2014] или директивные изменения в солепотреблении [Titze J. et al., 2002], функциональные нагрузочные пробы [Носков В.Б., 2013], экологические исследования, включая воздействие экстремальныx температур, гипербарии и гипоксии и, наконец, космический полет [Газенко О.Г., Григорьев А.И., Наточин Ю.В., 1980; Моруков Б.В., Ларина И.М., Григорьев А.И., 1998; Оганов В.Б., 2003; Корнилова Л.Н., Алехина М.И., Темникова В.В. с соавт., 2006; Фомина Г.А., Котовская А.Р., 2008; Kozlovskaya I.B. et al., 1988; Leach-Huntoon C.S., Grigoriev A.I., Natochin Y.V. 1998; Oganov V.S. et al., 2010].

В связи с современными аналитическими возможностями и фундаментальными научными запросами гравитационной физиологии возникает интерес к изучению белкового состава мочи, поскольку моча, как одна из биологических жидкостей организма человека, представляет собой привлекательный материал для использования в клинической диагностике и для теоретических исследований [Ларина И.М, с соавт. 2012; Mischak H., Thongboonkerd V., Schanstra J.P., Vlahou A., 2011; Metzger J. et al., 2012]. Возможность многократного, самостоятельного (без помощи медперсонала) и не обременительного, неинвазивного сбора представительного для протеомики биологического материала, каковым является моча, принципиально важно в космической физиологии. Недостатками мочи, как источника данных о белковом составе внеклеточной жидкости, является низкая концентрация в ней белков, что выдвигает дополнительные требования к чувствительности аналитических методов [Николаев Е.Н., 2007; Nagaraj N. et al., 2012], высокая вариабельность белкового состава [Образцова О.А., 2013], обусловленная функциями почки по поддержанию водно-электролитного гомеостаза, а также предполагаемая трудность интерпретации результатов, полученных при исследовании данного биоматериала от здорового человека.

Протеомика достигла наиболее впечатляющих успехов в плане практического применения ее достижений именно в области исследований протеома мочи [He J.C. et al., 2012]. Проект Human Kidney и Urine Proteome Project (HKUPP) (http://eurokup.org) был инициирован в 2005 году в рамках HUPO для содействия протеомным исследованиям в области нефрологии, понимания функции и патогенеза заболеваний почек, поиска биомаркеров и развития теоретических исследованиях в этой области [Vlahou A. et al., 2009; He J.C. et al. 2012; Zoidakis J. et al., 2012].

Факторы космического полета вызывают адаптивные изменения во всех физиологических системах организма человека [Газенко О.Г., Григорьев А.И., Егоров А.Д., 1990; Баевский Р.М. и др., 2000; Оганов В.Б., 2003; Григорьев А.И., Козловская И.Б., Шенкман Б.С., 2004; Котовская А.Р. 2008; Носков В.Б., 2013]. Это отражается на качественном и количественном составе белков, которые участвуют в адаптивных реакциях. Очевидно, что белки, изменение уровня которых наблюдается в экстремальных условиях, не могут рассматриваться как потенциальные биомаркеры развития заболеваний, поскольку они участвуют в естественном молекулярном ответе организма в процессе адаптации к изменению условий жизнедеятельности [Пахарукова Н.А., 2010; Трифонова О.П., 2011; Киреев К.С., 2013; Образцова О.А., 2013; Mischak H. et al., 2011; Metzger J. et al., 2012].

Анализ белков с использованием различных биохимических методов, выполнявшийся ранее в космической биологии и медицине не давал возможности прямого сравнения результатов в виду различной чувствительности и специфичности методов. Список из исследованных белков в крови конкретного космонавта редко достигал 50 параметров [Попова И.А. с соавт., 1988; Григорьев А.И., Ларина И.М., 1999; Ларина И.М., 2003; Millet C. et al., 2001]. Это является существенным ограничением при изучении механизмов изменения функций, поскольку большинство функций организма человека осуществляются значительно бтльшим числом белков. В свою очередь, это не позволяло получить и проанализировать целостную картину происходящих изменений. Современные протеомные методы дают возможность определять сотни белков за один хромато-масс-спектрометрический анализ с высокой точностью, специфичностью и чувствительностью [Nagaraj N. et al., 2012; Rodrнguez-Suбrez E. et al., 2014], что позволяет получить данные, пригодные для непосредственного сопоставления друг с другом и создать картину изменений композиции белков при воздействии факторов космического полета. Для понимания того, как формируются физиологические реакции на различные воздействия, необходимо перебросить концептуальные и функциональные мостики от генетики к белкам, от белков к клеткам, далее к органам, и системам в организме [Hester R.L., Iliescu R., Summers R., Coleman T.G., 2011].

Таким образом, значение новых методов современной системной биологии имеет теоретический и прикладной аспекты, так как, основываясь на понимании физиологической адаптации здорового человека в экстремальных условиях, дают возможность разработать эффективные меры профилактики и коррекции неблагоприятного воздействия условий космического полета на организм человека.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлась характеристика протеома мочи здорового человека в норме и при действии реальных и моделируемых факторов космического полета для выявления и валидации биомаркеров адаптивных процессов.

В ходе работы решались следующие задачи:

- исследовать протеом мочи здорового человека (мужчин в возрасте от 19 до 54 лет);

- изучить возрастные особенности протеома мочи здоровых добровольцев;

- идентифицировать постоянную и вариабельную части протеома мочи здорового человека в нормальных условиях жизнедеятельности;

- изучить вариабельность белковой композиции мочи в зависимости от уровня солепотребления в диапазоне нормы потребления соли в РФ;

- изучить характер адаптивных перестроек протеома мочи при воздействии различных факторов космического полета;

- исследовать характер адаптивных перестроек протеома мочи в острый период реадаптации после длительных космических полетов;

- адаптировать современные биоинформационные технологии для построения сетей молекулярных взаимодействий, на основании данных по протеому мочи здорового человека.

Научная новизна

С помощью высокотехнологичных протеомных методов на основе хромато-масс-спектрометрии, впервые охарактеризован протеом мочи здоровых добровольцев в возрасте от 19 до 54 лет, отобранных специальной врачебно-экспертной комиссией. Анализ протеома мочи позволил изучить и выявить возрастные особенности здоровых добровольцев.

Впервые показано, что белки, которые являются постоянными в протеоме мочи здорового человека, при его исследовании в течение длительного промежутка времени (530 суток), по своим молекулярным функциям и биологическим процессам, в которых они участвуют, имеют низкую функциональную связанность между собой.

Впервые показано, что протеом мочи может служить индикатором различных физиологических состояний организма здорового человека. В проведенных исследованиях проанализирована индивидуальная и групповая вариабельность белкового состава мочи здорового человека.

Впервые установлено, что состояние многих физиологических систем здоровых молодых мужчин, изменяется в зависимости от уровня солепотребления в диапазоне нормального суточного потребления соли в РФ (4-12г/сут.).

Анализ белковой композиции мочи впервые позволил выявить белки, принимающие участие как в период острой адаптации к антиортостатической гипокинезии, а также в восстановительный период после завершения эксперимента.

Впервые идентифицированы белки, которые демонстрируют ассоциативную связь с функциями выделительной системы и чувствительностью к иммерсионному воздействию, что подтверждается корреляцией встречаемости этих белков в образцах, собранных в различные периоды эксперимента с изменяющимися параметрами водно-солевого обмена.

Биоинформационными методами анализа, а также методом ручной аннотации белков и биологических процессов, впервые удалось связать хорошо известные и документированные ранее факты и физиологические особенности состояния космонавтов на первые сутки после завершения полетов, с выявленными в моче белками, участниками различных процессов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Практическая значимость работы заключается в идентификации белков, определении тканей, процессов, характеризующих протеом мочи здорового человека. Характерные изменения протеома мочи, обусловленные возрастными особенностями метаболизма и его регуляции, следует учитывать в клинически-ориентированных исследованиях протеома мочи, а также при поиске фармакологических мишеней для терапии.

Практическая значимость работы заключается в выявлении белков, которые могут представлять собой независимые маркеры различных состояний и процессов в организме здорового человека при действии факторов космического полета, а также использоваться как стандарты при определении концентрации других белков в моче.

Полученные данные об изменениях протеома мочи в контролируемых условиях существенно расширяют современные представления о возможных механизмах влияния различного уровня приема соли (6-12 г/сутки) на организм человека.

Результаты исследования показателей, характеризующих протеомную композицию мочи при действии факторов космического полета, дают более полное представление о механизмах адаптации физиологических систем организма человека в острый период адаптации к земной гравитации.

Положения диссертации, выносимые на защиту

Протеом мочи здорового человека, при изучении его высокотехнологическими методами на основе хромато-масс-спектрометрии, отличается вариабельностью, связанной как с возрастными особенностями метаболизма, так и с уровнем двигательной активности и характером рациона питания.

Анализ протеома мочи здорового человека в условиях действия на организм различных факторов выявляет сотни белков-участников адаптивных процессов, большинство из которых в этой связи ранее не изучалось.

Биоинформационные методы анализа позволяют верифицировать белковый состав образцов мочи через известные биохимические процессы и физиологические особенности состояния человека, как при наземном моделировании эффектов, так и при исследовании космонавтов после завершения полетов.

Данные протеома мочи, наряду с построением и анализом молекулярных сетей с участием выявляемых белков, предоставляют гипотезы о новых механизмах адаптации организма здорового человека.

Апробация работы

Основные положения работы были представлены и обсуждены на следующих конференциях: Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», 25-27 ноября 2009 г., Москва; French-Russian-Belorussian Conference: Neurovascular impairment induced byen vironmenta lconditions: molecular, cellular and functionalapproach. - French-Russianconference, AngersUniversity, France, 10 - 14 March 2010; 31stAnnual International Gravitation PhysiologyMeeting: Trieste, Italy, 13 - 18 June, 2010; IV Всероссийской конференции-школе «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения», Звенигород, 2010; V Российском симпозиуме «Белки и пептиды», 8 - 12 августа 2011, Петрозаводск; 2-ой Международной научно-практической конференции "Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: Геномика. Протеомика. Биоинформатика", Новосибирск, 2011; 10th HUPO World congress, Geneva, Switzerland, September 4 - 7, 2011; Космическом форуме 2011, посвященном 50-летию полета в космос Ю.А. Гагарина, 18 - 19 октября в Звездном городке; Международном симпозиуме, посвященном итогам выполнения проекта «МАРС-500», Москва, 23-25 апреля 2012; 33th Annual International Society for Gravitational Physiology Meeting, «Life in Space for Life on Earth», Aberdeen - United Kingdom, 18-22 June 2012; Proteomic Forum Berlin, Germany, 17 - 21 March, 201311th Annual World Congress HUPO, Boston, Massachusetts, USA, September 9-13, 2012; в Докладах III международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», в Казани, 22-24 ноября 2012; 8th International Conference on «Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/Systems Biology» BGRS/SB-2012, Novosibirsk, Russia June 25-29, 2012; 12th Annual World Congress HUPO, Yokohama, Japan, September 14-19, 2013; «Human in space symposium» Cologne, Germany, July, 2013; French-Russian Conference «Head out water immersion symposium & Baroreflex and heart rate variability» Angers, France 28-30 April, 2014; The Ninth International Conference on Bioinformatics оf Genjme Regulation and Structure/Systems Biology, Novosibirsk, Russia, June 23-28, 2014; 13th Human Proteome Organization World Congress, October 5-8, Madrid, 2014.

По теме диссертации опубликовано 34 печатных работ, в том числе, 22 статьи в журналах из перечня Высшей Аттестационной Комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации.

Диссертация апробирована на заседании секции «Космическая физиология и биология» Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН «Космическая физиология и биология» 23.12. 2014 г.

Связь работы с научными программами

Работа выполнена при поддержке программ ФФМ и Президиума РАН и Роскосмоса, а также грантов президента РФ «Поддержка ведущих научных школ» и РФФИ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 303 страницах и состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, 6 глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 325 отечественных и 686 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 43 таблицами и 20 рисунками, 3 графиками, 1 схемой.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Строение, биосинтез и функции белков в организме человека

Понимание биохимических процессов, которые составляют жизнь, требует не только знания генетической «инструкции», закодированной в геноме, но и белков, метаболических субстратов, участвующих в этих процессах [Angel Т.Е. et al., 2012]. В последние годы выявлено множество новых аспектов функционирования белков, как регуляторов биологических процессов - не только обмена веществ, роста и развития, но и как участников системы коммуникаций, которые объединяют биологические молекулы, органеллы, клетки, ткани, органы в единую управляемую систему [Степанов В.М., 2002; Hester R.L., Iliescu R., Summers R., Coleman T.G., 2011].

Изучение первичной структуры белка, полученной из генома, явно недостаточно, чтобы объяснить различие их биологических функций. Считается, что человеческий геном, включает в себя 27 000 генов, общее количество белков в организме человека оценивается более, чем в миллион, что связано с альтернативным сплайсингом матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК). Изоформы могут иметь различные биологические функции [Stastna M., Van Eyk J.E., 2012]. Видовая и индивидуальная специфичность набора белков в конкретном организме определяет особенности его строения и функционирования [Северин Е.С., 2013]. За счет внутримолекулярных взаимодействий белки образуют определенную пространственную структуру, или «конформацию белков» [Calamini B., Morimoto R.I., 2012]. Различают 4 уровня структурной организации белков [Zhou X., Wang E., 2013]. Двадцать L-аминокислот-мономеров в ходе трансляции встраиваются в полипептидную цепь, и играют ключевую роль в регуляции синтеза белка [Chan T.M. et al., 2012; Wang W. et al., 2013]. Линейную последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи называют первичной структурой белка [Paris G., Ramseyer C., Enescu M., 2014]. В результате реакции посттрансляционной модификации некоторые из них превращаются в другие аминокислотные остатки, обеспечивая важную роль в широком диапазоне биологических процессов [Mann M., Jensen O.N., 2003; Kakizawa S., 2013]. Большинство из индивидуальных белков организма человека имеет важное общебиологическое и медицинское значение [Jain A.P., Pundir S., Sharma A., 2013; Slutzki M. et al., 2013]. Многие генетические болезни являются результатом нарушения аминокислотной последовательности белков [Barrowman J. et al., 2012]. Вторичная структура белка - пространственная, образуется в результате взаимодействий между функциональными группами, входящими в состав пептидного остова [Lee C.K., Yeo K.J., Hwang E., Cheong H.K., 2013]. Пептидные цепи могут приобретать регулярные структуры двух типов: L - спираль и В-структуру. L-спиральная структура - это наиболее устойчивая конформация пептидного остова, имеющая минимум свободной энергии [Boersma M.D. et al., 2012]. B-структура формируется за счет образования множества водородных связей между атомами пептидных групп линейных областей одной полипептидной цепи [Yamamoto A. et al., 2000]. Как L - спираль и В-структура встречаются в глобулярных и фибриллярных белках [Tu X., Palczewski K., 2012]. Третичная структура белка - трехмерная пространственная структура, образуется за счет взаимодействий между радикалами аминокислот, расположенными на значительном расстоянии друг от друга в полипептидной цепи [Ohue M. et al., 2013]. Третичную структуру некоторых белков стабилизируют дисульфидные связи [Wei W. et al., 2012]. Гидрофобные радикалы аминокислот стремятся к объединению внутри глобулярной структуры растворимых в воде белков, между ними возникают гидрофобные взаимодействия, а также силы Ванн дер Ваальса между близко прилегающими друг к другу связями, формируя гидрофобное ядро [Priyakumar U.D., 2012; Vugmeyster L., Do T., Ostrovsky D., Fu R., 2014]. Все гидрофильные группы радикалов аминокислот, оказавшиеся внутри гидрофобного ядра, взаимодействуют друг с другом с помощью ионных и водородных связей [Seddon A.M., Curnow P., Booth P.J., 2004]. Белки мембран имеют обратное устройство: гидрофильные радикалы аминокислот расположены внутри белка, а гидрофобные аминокислоты локализованы на поверхности молекулы и контактируют с неполярным окружением [Smith S.M., 2011]. Радикалы аминокислот в каждом случае занимают наиболее выгодное биоэнергетическое положение. Конформация белка может меняться при изменении химической и физической среды, а также при взаимодействии белка с другими молекулами [Tan C., Li W., Wang W., 2013]. Потеря нативной конформации сопровождается утратой специфической функции белков, денатурацией. Плотная пространственная структура нативного белка при денатурации резко увеличивается в размерах и становится легко доступной для расщепления пептидных связей протеолитическими ферментами [Bhuyan A.K., 2010]. Существуют белки, состоящие из двух и более полипептидных цепей, после формирования трехмерной структуры каждой. Они объединяются с помощью взаимодействий, которые участвовали в образовании третичной структуры. Количество и взаиморасположение полипептидных цепей в пространстве называют четвертичной структурой белков [Veenhoff L.M., Heuberger E.H., Poolman B., 2002]. Процесс сворачивания полипептидной цепи в правильную пространственную структуру получил название «фолдинг белков», это самопроизвольный процесс, при котором белок стремится принять в данных условиях конформацию с наименьшей свободной энергией [Sekhar A., Lam H.N., Cavagnero S., 2012]. Изменение условий окружающей среды или изменений первичной структуры могут привести к изменению его конформации и функции [Fan J., Pavletich N.P., 2012]. Для многих белков, имеющих высокую молекулярную массу и сложную пространственную структуру, фолдинг (процесс спонтанного сворачивания полипептидной цепи в уникальную нативную пространственную структуру) протекает при участии специальной группы белков, шаперонов [Zagouri F. et al., 2012]. Фолдинг протекает в цистернах эндоплазматического ретикулума, некоторые растворимые в воде белки могут агрегировать, образуя в клетках фибриллярные отложения, амилоид, при этом нарушается структура и функции клеток, наблюдаются дегенеративные изменения [Kшнћ Z., Klusбk J., Kriљtofнkovб Z., Koиa J., 2013].

До настоящего времени не существует единой и стройной классификации, учитывающей различные параметры белков, в основе, как правило, лежит один признак. Белки можно квалифицировать: по форме молекул (глобулярные или фибриллярные); по химическому строению (наличие или отсутствие небелковой части); по молекулярной массе (низкомолекулярные, высокомолекулярные); по выполняемым функциям (транспортные, защитные, структурные и т.д.); по локализации в клетке (ядерные, цитоплазменные, лизосомальные); по локазизации в организме (белки крови, печени, сердца); белки синтезирующие с постоянной скоростью, белки, синтез которых может усиливаться при воздействии факторов среды; по продолжительности функционирования в клетке; по схожим участкам первичной структуры и родственным функциям. Многие белки, кроме полипептидных цепей, содержат в составе небелковую часть, присоединенную к белку слабыми или ковалентными связями. Как правило, небелковая часть представлена ионами металлов, органическими молекулами с низкой или высокой молекулярной массой, такие белки принято называют сложными [Weston L.A., Bauer K.M., Hummon A.B., 2013]. Простетической группой могут быть веществами различной природы. Белки, соединенные с гемом - гемопротеины [Venanzi M., Cianfanelli S., Palleschi A., 2013], соединенные с остатками фосфорной кислоты - фосфопротеины [Dalton L.E. et al., 2012], с углеводными остатками - гликопротеины [Krainer F.W. et al., 2013], функционирующие в комплексе с липидами - липопротеинами, с металлами - металлопротеинами [King J.D. et al., 2013]. По признаку сходства выполняемых белками функций их можно разделить на большие группы. Ферменты - специализированные белки, ускоряющие течение химических реакций, играют важнейшую роль во всех процессах жизнедеятельности, направляя и регулируя обмен веществ организма [Кришталик Л.И., 2012; Ernst A. et al., 2013]. Благодаря ферментам в клетке скорости химических реакций возрастают в миллионы раз. К 2013 году было описано более 5 000 разных ферментов. Различным физико-химическим аспектам ферментативных процессов посвящены многие обзоры [Chapple S.J., Cheng X., Mann G.E., 2013; Ergin V., Erdogan M., Karasu C., Menevse A., 2013; Kakizawa S., 2013]. Так, трипсин разрушает в белках пептидные связи, образованные карбоксильной группой основных аминокислот - аргинина или лизина [Buczek O., Krowarsch D., Otlewski J., 2002]. К регуляторным белкам относят большую группу белковых гормонов, участвующих в поддержании постоянства внутренней среды организма, которые воздействуют на специфические клетки-мишени. Сигнальные молекулы (гормоны, медиаторы) действуют на внутриклеточные процессы через взаимодействие со специфическими белками - рецепторами [Rosenbaum D.M. et al., 2011]. Рецепторный белок - это тот незаменимый винтик, без которого не могут работать сложнейшие сигнальные системы нашего организма. Например, если в палочках сетчатки содержится недостаточно родопсина, светочувствительность глаза снижается: ухудшается зрение [Sammons J.D., Gross A.K., 2013]. Многие белки крови участвуют в переносе лигандов из одного органа к другому, так, альбумин переносит жирные кислоты и билирубин [Ha C.E., Bhagavan N.V., 2013], а гемоглобин эритроцитов участвует в переносе кислородаот легких к тканям [Tripette J. et al., 2009]. Транспортные белки участвуют также в переносе гидрофильных веществ через гидрофобные мембраны [Hicke L., Dunn R., 2003]. Один из наиболее изученных белков, осуществляющих активный транспорт - Na+/K+-аденозинтрифосфатаза [Edwards I.J., еt al., 2013]. Некоторые белки, расположенные определенным образом в тканях придают им форму, создают опору, определяют механические свойства данной ткани. Например, главным компонентом хрящей и сухожилий является фибриллярный белок коллаген, имеющий высокую прочность [Chen P., Cescon M., Megighian A., BonaldoP., 2014]. Структурный белок эластин обеспечивает определенным тканям свойство растягиваться во всех направлениях [Uitto J., 2008]. Некоторые белки (иммуноглобулины) обладают способностью узнавать и связывать чужеродные молекулы, вирусные частицы и бактерии, в результате чего происходит их нейтрализация [Schroeder H.W.Jr., Cavacini L., 2010]. Защитными свойствами обладают белки свертывающей системы крови, к примеру, фибриноген и тромбин [van Ryn J. et al., 2010]. Некоторые белки наделяют клетку способностью либо сокращаться, либо передвигаться. К таким белкам относятся актин и миозин - фибрилярные белки, участвующие в сокращении скелетных мышц, тубулин, из которого построены микротрубочки [Schappi J.M., Krbanjevic A., Rasenick M.M., 2013].

Белки, имеющие гомологичные участки полипептидной цепи, сходную конформацию и родственные функции, выделяют в семейство родственных белков. К семейству родственных белков относят сериновые протеазы, мишенью которых являются специфические пептидные связи в белках; для них характерно наличие в активном центре остатков Сер 195, Гис57, Асп 102 [Доброгорская Я.И., Немухин А.В., 2003], а так же высокая гомология их пространственных структур. Так, пищеварительные сериновые протеазы участвуют в переваривании денатурированных пищевых белков, к ним относят трипсин, химотрипсин [Замолодчикова Т.С., 2013]. Сериновые протеазы участвуют в активации каскада белков свертывания крови, белков системы комплемента, образования белковых гормонов [Diaz J. et al., 2012; Perry A.J. et al., 2013]. В работе иммунной системы огромную роль играют белки, относящиеся к суперсимейству иммуноглобулинов, которое включает в себя: семейство иммуноглобулинов, семейство Т-клеточных антигенраспознающих рецепторов и белки главного комплекса гистосовместимости 1 и 2 классов, а также семейство адгезивных белков. Основным критерием включения белков считается доменная организация, достоверная гомология аминокислотных последовательностей и пространственных структур отдельных доменов [Yap E.H, Yu X.M. et al., 2013; Rosche T., Almo S., Fiser A., 2014]. Изофункциональные белки - это семейство белков, выполняющих почти одинаковую или близкую функцию, но небольшие особенности строения и функционирования некоторых членов этого семейства могут иметь важное физиологическое значение, к примеру, изоформы гемоглобина [Damsgaard C., Storz J.F., Hoffmann F.G., Fago A., 2013]. К изобелкам относят множество изоформ структурного белка коллагена [Cutrona M.B. et al., 2013].

Фонд свободных аминокислот организма - только 35 г., большая часть аминокислот входит в состав белков, доля которых в массе всех тканей организма человека нормального телосложения составляет примерно 15 кг. Специальной формы депонирования аминокислот нет, их резервом служат все функциональные и структурные белки тканей, преимущественно белки мышц, поскольку мышечная ткань является самой крупной тканью организма [Preiss L. et al., 2013]. Основным источником аминокислот организма служат белки пищи. В сутки, при белковом голодании, в организме расходуется 25 г собственных белков тканей, минимальное количество белка в пище, необходимое для поддержания азотистого равновесия - 30-50 г/сутки. При средней физической нагрузке взрослый человек должен получать 100-120 грамм белков в сутки. Безбелковое питание (продолжительное) вызывает серьезные нарушения обмена и неизбежно заканчивается гибелью организма. Поскольку, человек в ходе эволюции утратил способность синтезировать de novo почти половину из 20 аминокислот, входящих в состав его собственных белков, те аминокислоты, синтез которых сложен и неэкономичен для организма, выгоднее получать с пищей, называются незаменимые аминокислоты. К ним относятся фенилаланин, метионин, треонин, триптофан, валин, лизин, лейцин, изолейцин [Churchward-Venne T.A. et al., 2012]. Аргинин и гистидин у взрослого человека образуются в достаточных количествах [Зилва Дж.Ф., Пэннелл П.Р., Березов Т.Т., 1988], их называют частично заменимыми. Тирозин и цистеин - условно заменимые, так как для их синтеза необходимы незаменимые аминокислоты; так, тирозин синтезируется из фенилаланина [Daubner S.C., Le T., Wang S., 2011], а для образования цистеина необходим атом серы метионина [Fu J. et al., 2014]. Остальные аминокислоты легко синтезируются в клетках и называются заменимыми. К ним относят глицин, аспарагиновую кислоту, аспарагин, глутаминовую кислоту, глутамин, серин, пролин, аланин [Churchward-Venne T.A., Burd N.A., Phillips S.M., 2012].

1.2. Обмен белков в организме здорового человека

1.2.1. Поступление извне

При средней физической нагрузке взрослый человека должен потреблять 100-120 г белков в сутки [Millward D.J., 2012]. Для поддержания азотистого равновесия достаточно употреблять 30-50 г белков в сутки [Wolfe R.R., Miller S.L., Miller K.B., 2008], однако такое количество не обеспечивает сохранение работоспособности и здоровья человека. В организме распад белков протекает непрерывно и зависит от характера питания. Отрицательный азотистый баланс отмечается при белковом голодании, а также когда в организм не поступают отдельные необходимые для синтеза белков аминокислоты [Duggleby S.L., Waterlow J.C., 2005]. Минимальные затраты белка в условиях белкового голодания наблюдаются при питании углеводами; при этом выделение азота может быть в 3--3,5 раза меньше, чем при полном голодании [Ten Have G.A., Engelen M.P., Luiking Y.C., Deutz N.E., 2007]. Белки при значительном поступлении с пищей не депонируются, часть их расходуется на пластические цели, но большая часть - на энергетические [Phillips S.M., 2013]. Переваривание поступивших с пищей белков начинается в ротовой полости с помощью слюны, в которой содержится ряд протеолитических ферментов, расщепляющих белки - гидролаз, оксиредуктаз, трансфераз, протеиназ, пептидаз, кислой и щелочной фосфатазы [Kennedy S. et al., 1998]. При переваривании белка в желудке стимулируется выделение гистаминов [Chu S., Schubert M.L., 2013] и гастрина [Kovac S., Anderson G.J., Baldwin G.S., 2011], вызывающих секрецию соляной кислоты и профермента пепсиногена, являющегося неактивной формой пепсина [Luo H.N., Kim H.S., Agarwal M., Teraoka I., 2013]. Пепсин в первую очередь гидролизует пептидные связи в белках, образованные ароматическими аминокислотами, и несколько медленнее - дикарбоновыми. В двенадцатиперстной кишке, низкое значение рH вызывает выделение секретина, стимулирующего выделение из поджелудочной железы в тонкий кишечник панкреатического сока, нейтрализующего соляную кислоту [Ng S.S., Yung W.H., Chow B.K., 2002]. Поступление пептидов в тонкий кишечник вызывает секрецию холецистокинина, который также стимулирует выделение панкреатических ферментов [Little T.J., Horowitz M., Feinle-Bisset C., 2005]. Это - проферменты ряда протеаз: трипсиногена, химотрипсиногена, проэластаз, прокарбоксипептидазы А и В. В кишечнике они превращаются в активные ферменты: трипсин [Sah R.P., Dawra R.K., Saluja A.K., 2013], химотрипсин [Szabу A., Sahin-Tуth M., 2012], эластазу и карбоксипептидазы А и В [Andersson B., Pendse M.L., Andersson R., 2010]. В результате последовательного действия всех пищеварительных протеаз большинство пищевых белков расщепляется до свободных аминокислот, и они подвергаются быстрому всасыванию в кишечнике через клетки полярного эпителия щеточной каемки. Максимальная концентрация аминокислот в крови достигается через 30-50 минут после приема белковой пищи. Всасывание L-аминокислот - это активный процесс, требующий затрат энергии [Громова Л.В., Груздков А.А. 1993]. Перенос аминокислот через эпителий щеточной каемки осуществляется с различной скоростью целым рядом переносчиков, многие из которых действуют при участии Na+-зависимых механизмов [Garcнa-Gimйnez E., Alcaraz A., Aguilella V.M. et al., 2012]. Одна из специфических транспортных систем для некоторых нейтральных аминокислот функционирует в кишечнике, почках, и, возможно, в мозге, это система - г глутамильного цикла [Campesi I. et al., 2013].

1.2.2. Распад белков в организме

В основе существования организма как сложной системы лежит непрерывный обмен со средой пластическими и энергетическими ресурсами, а также - информацией. Отражением первых двух видов обмена на уровне биохимии служит взаимосвязь двух динамических процессов: катаболизма и анаболизма веществ. В организме постоянно происходит распад и синтез белковых молекул - расщепление белков до аминокислот (катаболизм) и построение новых белковых молекул (анаболизм). На аминокислоты в сутки распадается около 400 грамм белков, примерно такое же количество синтезируется. Катаболизм большинства аминокислот начинается с отщепления L-аминогруппы в результате двух типов реакций: трансаминирования и дезаминирования [Felux A.K. et al., 2013]. Путем трансаминирования - реакции переноса L-аминогруппы с аминокислоты на L-кетокислоту - образуется новая кетокислота и новая аминокислота [Zhou Y. et al., 2010]. В клетках человека выявлено более 10 аминотрансфераз, локализующихся как в цитоплазме, так и в митохондриях, которые отличаются по субстратной специфичности [Han Q. et al., 2009]. В трансаминирование вступают почти все аминокислоты, за исключением лизина, треонина и пролина, эти реакции обратимы и играют большую роль в обмене аминокислот [Crugeiras J., Rios A., Riveiros E., Richard J.P., 2011]. Трасаминирование является и первой стадией дезаминирования большинства аминокислот, т.е. служит начальным этапом их катаболизма. В результате реакции дезаминирования выделяется L -кетокислота и молекула аммиака [Cortellino S. et al., 2011], часть которого образуется в результате бактериального разложения пищевых белков [Kim E., Coelho D., Blachier F., 2013].

Наиболее активными продуцентами аммиака в кровь являются органы с высоким обменом аминокислот и биогенных аминов - нервная ткань, печень, кишечник, мышцы [Holecek M. et al., 2011]. Основной реакцией связывания аммиака, протекающей во всех тканях организма, является синтез глутамина под действием глутаминсинтетазы, локализованной в митохондриях [Hu W.W. et al., 2012]. Глутамин - основной донор азота в организме, он используется для синтеза пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов и других соединений; его тканями - поставщиками являются мышцы, мозг и печень. С током крови глутамин транспортируется в кишечник и почки. В кишечнике происходит гидролиз глутамата, затем трансаминирование с пируватом. L-аминогруппа глутаминовой кислоты переносится в составе аланина, поступающего из кишечника в кровь воротной вены и поглощается печенью [van de Poll M.C. et al., 2007]. Около 5% аммиака удаляется в составе фекалий, небольшая часть через воротную вену попадает в печень, остальные 90% выводятся почками, в которых также происходит гидролиз глутамина, который является одним из механизмов регуляции кислотно-щелочного равновесия организме и сохранения важнейших катионов для поддержания осмотического давления [Dass P.D., Martin D., 1990]. Глутаминаза почек значительно индуцируется при ацидозе [Weiner I.D., Verlander J.W., 2011]. В почках образуется и ими выводится около 0,5 грамм солей аммония в сутки. Из мышц и кишечника избыток аммиака выводится в виде аланина в печень, где подвергается непрямому дезаминированию, аммиак при этом обезвреживается, а пируват включается в глюконеогенез [Moriwaki H. et al., 2004]. Таким образом, в печени аккумулируется большое количество аммиака [Holecek M., Kovarik M., 2013], что поддерживает низкое содержание его в крови [Barsotti R.J., 2001]. В орнитиновом цикле [Tamai M. et al., 2013] в печени синтезируется мочевина, которая является основным конечным продуктом азотистого обмена. Экскреция мочевины в норме составляет 25 г/сутки, увеличение скорости синтеза происходит при длительной физической работе, голодании или патологических состояниях.

1.2.3 Выведение продуктов белкового обмена

Аминокислоты, поступающие в ток крови в результате гидролиза белков в пищеварительном тракте, а также аминокислоты, образованные в процессе расщепления клеточных белков, образуют так называемый аминокислотный пул, который может использоваться всеми клеточными структурами для белкового синтеза [Veronesi M. et al., 2013]. Наибольшее количество свободных аминокислот поступает из мышц, мозга и кишечника, причем до 50% - это аланин и глутамин [Stobart J.L., Anderson C.M., 2013]. Почки - основной источник серина и частично аланина, которые попадают в нее из плазмы печенью [Longenecker K.L. et al., 2006]. В головном мозге окисляется большое количество аминокислот с разветвленной боковой цепью [Butt S.A. et al., 2012]. В постабсорбтивном периоде (перед следующим приемом пищи) основными источниками свободных аминокислот служат мышцы. Из них в кровоток поступают в основном аланин и глутамин. Аланин поглощается печенью [Jorgensen J.T. et al., 2012], глутамин - кишечником и почками. В кишечнике азот глутамина переносится в аланин или серин и в их составе транспортируется в печень, где активируется процесс глюконеогенеза [Larsen M., Kristensen N.B., 2013]. Аминокислоты с разветвленной боковой цепью (валин, лейцин, изолейцин) освобождающиеся из мышц, направляются в мозг, являясь источником энергии. Катаболизм всех аминокислот сводится к образованию шести веществ, вступающих в общий путь катаболизма: пируват, ацетил-КоА, L-кетоглутарат, сукцинил-КоА, фумарат, оксалоацетат.

В живой природе, в организме человека в частности, не существует изолированного обмена белков, жиров, углеводов и нуклеиновых кислот. Все превращения объединены в целостный процесс метаболизма, подчиняющийся определенным закономерностям, взаимозависимости и взаимообусловленности, допускающий также взаимопревращения между отдельными классами органических веществ. Подобные взаимопревращения диктуются физиологическими потребностями организма, а также целесообразностью замены одних классов органических веществ другими. Так, гликогенные аминокислоты используются в процессе глюконеогенеза [Pasiakos S.M. et al., 2011], а кетогенные - в синтезе кетоновых тел [Deng-Bryant Y., Prins M.L., Hovda D.A., Harris N.G., 2011], часть аминокислот (гликокетогенных) используется в обоих классах превращений. В организме человека возможен синтез восьми заменимых аминокислот: Ала, Асп, Асн, Сер, Гли, Глу, Глн, Про; углеводный скелет данных аминокислот образуется из глюкозы, а универсальным донором L-аминогруппы служит глутамат. Серин и глицин необходимы не только для синтеза белков и глюкозы (при ее недостатке в клетках), но и нуклеотидов, коферментов, сложных липидов, креатинина и других соединений. Метионин и цистеин, содержащие серу, используются в синтезе белков, участвуют в инициации процесса трансляции, фолдинге, в образовании мембран клеток и липопротеинов, в составе которых осуществляется транспорт липидов, а также в синтезе таурина. Тирозин используется не только в синтезе белков, но выступает предшественником таких гормонально-активных соединений как катехоламины, тироксин, меланины. Большую роль в организме человека играют непептидные азотосодержащие соединения - производные аминокислот: гормоны надпочечников, щитовидной железы, а также медиаторы ЦНС, медиатор воспаления (гистамин) и другие [Северин Е.С., 2013].

1.2.4 Синтез белка де ново и переаминирование

«Центральной догмой биологии» называют поток информации от дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) через рибонуклеиновую кислоту (РНК) на белок, который характерен для всех живых организмов, за исключением некоторых вирусов [Crick F., 1970]. Результаты работ по исследованию генетического кода являются одним из самых значительных достижений XX века в понимании процессов жизни [Novozhilov A.S., Koonin E.V., 2009]. Биосинтез белков, называемый трансляцией, включает в себя преобразование информации, заложенной в полинуклеотидной последовательности мРНК в аминокислотную последовательность белка согласно генетическому коду [Ingolia N.T. et al., 2012]. Каждая молекула ДНК представляет собой две правозакрученные, антипараллельные полинуклеотидные цепи, упакованные в хромосому, расположены в ядре, в диплоидных клетках человека их сорок шесть - т.е. 23 пары [Maffeo C., Luan B., Aksimentiev A., 2012]. У эукариот с ДНК связаны гистоновые и негистоновые белки. В ядре существует 5 видов гистонов, общая масса которых примерно равна содержанию ДНК [Bartke T. et al., 2010]. К негистоновым белкам относят семейство сайт-специфических белков типа «цинковые пальцы», годимеры, негистоновые белки с высокой электрофоретической подвижностью, ферменты репликации, транскрипции и репарации [Petruk S. et al., 2013]. Генетическая информация, считывающаяся с ДНК, «переносится» на молекулу РНК (long RNA), которая строится как одна полинуклеотидная цепь, отдельные участки которой образуют спирализованные петли-«шпильки» за счет водородных связей [Seetin M.G., Mathews D.H., 2012]. В цитоплазме клеток присутствуют несколько типов РНК - транспортные, матричные, рибосомальные и маленькие молекулы РНК (small RNA) отличающиеся по массе, структуре, конформации, функции [Okada H., Hayashizaki Y., 2013]. Первичные транскрипты мРНК подвергаются ряду ковалентных модификаций, которые необходимы для функционирования мРНК в качестве матрицы. Модификация РНК (сплайсинг) происходит в ядре, в цитоплазму поступает уже «зрелая» мРНК [Meyer K.D. et al., 2012]. Варианты сплайсинга могут приводить к образованию различных изоформ одного и того же белка. Кодирование структуры белков осуществляется, по современным представлениям, в линейной последовательности нуклеотидов мРНК, однако в ходе трансляции не наблюдается соответствия между числом мономеров в матрице мРНК и синтезируемом белке; отсутствует также и структурное сходство между мономерами РНК и белка. Причины несоответствия транскриптома и протеома клетки обсуждаются сообществом биологов постгеномного периода с неослабевающим интересом. Кроме самоочевидной причины - различного времени полужизни тРНК и белка, синтезируемого с данной молекулы РНК, приводятся последние данные, указывающие на участии, длинных РНК в регуляции активности транскрипции [Takayama K.,et al., 2013]. Таким образом, не все длинные РНК непосредственно участвуют в последующих этапах, ведущих к синтезу белка. Код позволяет шифровать аминокислоты, входящие в состав белков, с помощью соответствия им определенной последовательности нуклеотидов в ДНК. Генетический код представляет собой не случайный конгломерат соответствий между кодонами мРНК и аминокислотами белков, а высокоорганизованную систему, проявляющую общие свойства и закономерности [Ратнер В.А., 2000]. Для него характерны триплетность, специфичность, вырожденность (включение в белок одной и той же аминокислоты определяют несколько кодонов), линейность записи информации, универсальность (кроме митохондриальной мРНК, содержащей 4 триплета), колинеарность (аминокислотная последовательность белка колинеарна последовательности экзонов в гене или зрелой мРНК после посттранскрипционного удаления интронов) [Amikura K., Sakai Y., Asami S., Kiga D., 2014]. Таким образом, основными компонентами белоксинтезирующей системы являются: аминокислоты в достаточном количестве, мРНК (содержат информацию о структуре синтезируемого белка и используются в качестве матрицы), тРНК (обеспечивают включение аминокислот в белок), рибосомы, на которых идет сборка аминокислот в белки, белковые факторы, а также аденозинтрифосфат (АТФ) и гуанозинтрифосфат (ГТФ) как источники энергии. Каждая эукариотическая мРНК кодирует строение только одной полипептидной цепи, т.е. она моноцистронна. Рибосома способна катализировать образование около 100 пептидных связей в минуту [Beznoskovб P. et al. 2013]. Полипептидные цепи могут подвергаться структурным модификациям, посттрансляционным изменениям, затем происходит фолдинг полипептидных цепей и формирование уникальной третичной или четвертичной структуры белков [Кузнецова И.М., Форже В., Туроверов К.К., 2005; Shen X., Chen S., Li G., 2013].

Способность регулировать синтез белков необходима для успешного выживания любого организма. В зависимости от возраста и фазы развития, типа ткани или условий окружающей среды изменяется количество и набор (спектр) синтезируемых белков. Эта регуляция осуществляется на уровне различных внутриклеточных процессов: репликации, транскрипции, посттранскрипционных воздействий на мРНК, а также при трансляции и через воздействие на уже синтезированные белки (посттрансляционно) [Стручкова И.В., Брилкина А.А., Веселов А.П., 2010]. Общую теорию регуляции синтеза белка разработали Ф. Жакоб и Ж. Моно [Jacob F., Monod J., 1961], которая сводится к «выключению» или «включению» генов как функционирующих единиц, к возможности или невозможности проявления их способности передавать закодированную в структурных генах ДНК генетическую информацию для синтеза специфических белков. Доказанная в опытах на бактериях, эта теория получила широкое признание, хотя в эукариотических клетках механизм регуляции синтеза белка более сложен [Rajewsky N., 2011]. У эукариот дополнительно существует стратегия наработки мРНК не по потребности данного момента, а заранее, впрок. Такие метаболически стабильные мРНК хранятся в неактивной форме и не участвуют в трансляции. Когда определенный белок становится необходим - мРНК активируется, когда необходимость в продукте трансляции исчезает - мРНК может быть инактивирована [Стручкова И.В., Брилкина А.А., Веселов А.П., 2010]. У эукариот только небольшое число генов (обычно менее 1%) доступно для транскрипции. Стойкая репрессия генов гетерохроматина обеспечивается пространственной укладкой ДНК [Xu X., Guardiani C., Yan C., Ivanov I., 2013]; метилированием дезоксицитидина ДНК-метилазами [Mengxi D. et al., 2013], что препятствует активной транскрипции; связыванием с гистонами и образованием нуклеосом, что также снижает транскрипционную активность ДНК. В целом в геноме человека содержится не более 1,5% белок-кодирующих нуклеодидных последовательностей [Lander E.S. et al., 2001].