Протеомный профиль мочи здорового человека в норме и при действии факторов космического полета

1.9.3. Антиортостатическая гипокинезия (АНОГ)

Гипокинезия является не только одной из моделей невесомости, ее можно считать неизбежным спутником научно-технического прогресса, который сопровождается как значительным снижением доли физического труда, так и характерным стилем жизни. Для определенных категорий людей гиподинамия является профессиональной, а в некоторых случаях - вынужденной (постельный режим) [Коваленко Е. А., Гуровский Н. Н., 1980; Оганов В.С., 1998]. Антиортостатическая гипокинезия - это строгий постельный режим, при котором положение наклона головы находится под различными углами ниже горизонтального положения [Григорьев А.И., Ларина И.М., 2001; Михайлов В.М. 2001; Lathers C.M., Charles J.B., 1994].

C увеличением продолжительности пилотируемых космических полетов, длительность экспериментов по антиортостатическому воздействию на организм человека увеличивалась с одного часа и более [Быстров В.В. с соавт. 1986; Butler G.C., Xing H.C., Hughson R.L., 1990], далее - до суток [Frey M.A. et al. 1993], затем - до 5-7 суток [Шульженко Е.Б. с соавт., 1984]. Затем продолжительность антиортостатического воздействия возрастала до 30 суток [Федоров Б.М., Стрельцова Е.Н., Себекина Т.В., 1985; Стажадзе Л.Л. с сотр., 1988], 120 суток [Лобачик В.И. с сотр., 1989], и, наконец, до 370 суток [Григорьев А.И., Моруков Б.В., 1989]. Угол наклона головного конца кровати обычно не превышал 10°-15°, чтобы избежать неприятных ощущений, вызванных выраженным перераспределением крови и неудобством сохранения этого положения на протяжении длительного периода времени [Шульженко Е.Б. с соавт., 1984].

Сопоставление результатов исследований в наземных модельных экспериментах (гипокинезия, антиортостатическая гипокинезия или иммерсия) и исследований, выполненных в реальных полетах, показали, что можно пользоваться наземной имитацией действия отдельных факторов космического полета для изучения основных закономерностей и характерных сдвигов водного и минерального метаболизма. Основными воздействующими факторами при модельных экспериментах являются гиподинамия и перераспределение жидких сред организма вдоль оси тела [Ларина И.М., Попова И.А, Михайлов В.М., Буравкова Л.Б., 1999; Ларина И.М., 2000; Носков В.Б., 2013], важными следствиями чего являются взаимообусловленные реакции со стороны различных систем организма. Было показано, что 8-часовая АНОГ вызывает увеличение кровенаполнения головы и груди на 6-9% (P<0,05), по сравнению с исходным горизонтальным положением. Дальнейшее пребывание в условиях АНОГ сопровождается развитием компенсаторно-адаптивных реакций, характеризующихся, главным образом, уменьшением общего объема циркулирующей плазмы на 317 мл (P<0,05) на 2-е сутки АНОГ и перемещением объемов крови из брюшной полости и нижних конечностей, которое к 7 суткам АНОГ составило -11% и -23% (P<0,05) соответственно [Lobachik V.I., Abrosimov S.V., Zhidkov V.V., Endeka D.K., 1991]. Через неделю воздействие АНОГ приводит к отрицательному балансу жидкости и электролитов, снижению концентраций общего белка и альбумина [Ларина И.М., Суханов Ю.В, Лакота Н.Г., 1999; Ларина И.М., 2003]. В эксперименте с 20-суточной АНОГ отмечалось снижение концентрации С-реактивного белка, причем в группе с использованием профилактических мероприятий (физических упражнений) его концентрация была ниже, чем в контрольной группе. Снижение уровня б-2-глобулинов наблюдалось во время 370-суточной АНОГ, эта тенденция сохранялась и в период восстановления. Вероятно, эти изменения связаны с нарушением синтеза плазматических белков в печени [Ларина О.Н., 1992]. В ходе экспериментов с длительной гипокинезией (120-суточная АНОГ с участием 25 мужчин, 370-суточная АНОГ с участием 9 мужчин) наблюдалось повышение базальных уровней адренокортикотропного гормона, антидиуретического гормона, активности ренина плазмы и активация синтеза кортикостероидов, более выраженная для минералокортикоидов. Было показано снижение чувствительности почек к антидиуретическому гормону в начале 3-го месяца АНОГ с последующим ее восстановлением к 300-м суткам гипокинезии. Таким образом, в условиях длительной гипокинезии изменения показателей гормонального статуса добровольцев характеризовались повышением активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и ренин-ангиотензин-альдостероновой системы с фазными изменениями чувствительности органов-мишеней к циркулирующим гормонам [Воробьев Д.В., Ларина И.М., Гончарова А.Г., 1998]. В ходе 120-суточной АНОГ в сыворотке крови увеличивалась концентрация предсердного натрийуретического пептида, который подавляет активность различных звеньев ренин-ангиотензин-альдостероновой системы [Maillet A. et al., 2000], однако была понижена в более кратковременных экспериментах - 28 [Maillet A. et al., 1996] и 60 - суточной АНОГ [Custaud M.A. et al., 2005]. Изменение параметров циркадианных ритмов соматотропина было отмечено в ходе 370-суточного эксперимента и снижение его среднесуточной концентрации [Григорьев А.И., Ларина И.М., 1999]. Изменялось содержание гормонов, регулирующих обмен кальция как в ходе 120-суточной, так и 370-суточной АНОГ. На 75-ые сутки экспериментов уровень паратиреоидного гормона был ниже фонового, а концентрация кальцитонина повышалась [Ларина И.М., Моруков Б.В., Григорьев А.И., 1999; Ларина И.М., 2003]. В тоже время, во время 24-часовой АНОГ содержание данных гормонов не изменялось [Uchakin P.N. et al., 1998]. Уровни лактатдегидрогеназы, аспартатаминотрасферазы, аланинаминотрасферазы достоверно не отличались от фоновых значений в 7-суточном и 120-суточном экспериментах у мужчин [Ветрова Е.Г., Дроздова Т.Е., Попова И.А., 1988; Попова И.А. с соавт., 1988], но были повышены в ходе 370-суточной АНОГ [Попова И.А. с соавт., 1989]. В течение периода восстановления все отклонившиеся параметры возвращались к фоновым значениям. Показатели липидного обмена также изменялись в ходе АНОГ (120 суток): было показано увеличение содержания холестерина и снижение уровня б-липопротеинов [Смирнов К.В. с соавт., 1986]. Кроме того, было отмечено увеличение инсулина в крови после АНОГ различной продолжительности, что возможно связано с перестройкой инсулярного аппарата или изменением углеводного обмена при моделировании микрогравитации [Афонин Б.В., 1989].

1.9.4. Длительная изоляция в гермообъеме

Целью модельных исследований в замкнутых гермообъектах являлось развитие и отработка систем и биомедицинских средств, направленных на сохранение здоровья, высокого уровня физической и психической работоспособности, стабильного психофизиологического состояния, эффективной реабилитации с сохранением оптимальных параметров соматического и психического здоровья [Моруков Б.В., Белаковский М.С., Демин Е.П., Суворов А.В., 2012]. Известно, что изоляция экипажа в гермообъекте ограниченного объема не воспроизводит такие факторы орбитального полета, как невесомость и повышенный уровень радиации, но формирующиеся при этом искусственная атмосфера и микроклимат, а также возможные сложности психологического взаимодействия между членами экипажа в процессе совместной деятельности позволяют изучить многие трудности реальной космической экспедиции.

В исследованиях с длительной изоляцией в гермообъектах было показано снижение основного обмена веществ на четверть его величины. При этом наблюдались сдвиги холестеринового обмена: так, наряду с признаками гиперхолестеринемии, отмечалось изменение фракций холестерина в сторону преобладания его атерогенных форм. Отмечались признаки усиления катаболических реакций [Каландаров С.К., Коршунова В.А., Проскурова Г.И., 1986]. Тем не менее, клинически-значимых сдвигов белкового, энергетического, углеводного метаболизма обнаружено не было, что могло свидетельствовать, о компенсации организмом воздействия всего комплекса воздействующих факторов [Маркин А.А., Строгонова Л.Б., Вострикова Л.В., 1997]. Так, исследование электрофоретических фракций белков плазмы крови после 135- суточной изоляции показало значительное уменьшение содержания интер-б-трипсинового ингибитора, б-2-микроглобулина, гаптоглобина и б-2-глобулиновой фракции, что может быть следствием подавления синтеза белков в печени. После окончания эксперимента, на 2-ой и 7-ой дни, наблюдалось проявление слабой острофазной реакции [Ларина О.Н., 1997]. Так же, в динамике 240-суточной изоляции, наблюдалось понижение содержания общего белка в крови, кроме того, отмечалась тенденция к снижению уровня альбумина [Маркин А.А. с соавт., 2001].

В ходе 240 - суточной изоляции были выявлены периодические колебания уровней иммуноглобулинов G, M, и А в крови [Поликарпов Н.А. с соавт., 2001; Рыкова М.П. с соавт., 2004]. После окончания эксперимента было также отмечено снижение содержания в крови данных классов иммуноглобулинов [Константинова И.В. с соавт., 1997]. В динамике длительной изоляции показало изменение толерантности к глюкозе, что сопровождалось активацией секреции С-пептида, инсулина и гастрина [Афонин Б.В. с соавт., 2001].

В полуторагодовой изоляции (Марс-500) повышалась активность трансаминаз, наблюдалась тенденция к снижению уровня мочевой кислоты, железа, и креатинина. По биохимическим данным не отмечалось признаков ослабления метаболизма скелетных мышц, миокарда, поджелудочной железы, желудочно-кишечного тракта [Моруков Б.В. с соавт., 2012]. В ходе эксперимента, при исследовании белкового спектра мочи, методом электрофоретического разделения, было выявлено увеличение доли гломерулярного (> 69 кДа) и тубулярного (< 65 кДа) компонентов белка мочи на начальных этапах эксперимента с последующей тенденцией к снижению содержания этих белков. На 244-272 сутки, во время имитации выхода на поверхность Марса, доля тубулярного компонента снижалась, а гломерулярного, включая высокомолекулярные фракции медленных глобулинов и иммуноглобулинов G, росла, с тенденцией к росту содержания альбумина. По мнению авторов, эти изменения отразили физиологическую реакцию почек на физические нагрузки, сопровождавшие подготовку к имитации выхода и психологический стресс. Относительное содержание трансферрина с 168-х суток изоляции находилось на уровне близком к фоновому. Содержание гликопротеина почечных канальцев (белка Тамма-Хорсваля) не повышалось [Моруков Б.В. с соавт., 2012].

В данном исследовании был проведен анализ протеомной композиции мочи, который позволил выявить сети взаимодействий, состоящие более, чем из 200 белков различного происхождения, динамика изменений которых оказалась тесно связанной с уровнем потребления соли [Ларина И.М. с соавт. 2012; Пастушкова Л.Х. с соавт., 2012].

1.3 Характеристика возрастных изменений физиологических систем организма

Старение является сложным биологическим процессом, обусловленным множеством факторов, каждый из которых вносит свой вклад в изменения большинства клеток и органов [Oeseburg H., de Boer R.A., van Gilst W.H., vander Harst P., 2010]. Если исходить из представлений системной биологии, то ухудшение работы «системы», которое происходит с возрастом, скорее всего, включает нарушение нескольких механизмов. Так, по мнению Soltow с соавт., со старением сопряжено четыре основных процесса:

1) снижение потребления и эффективности использования энергии;

2) снижение структурной и/или метаболической организации;

3) снижение барьерных функций;

4) повышение вероятности нарушений в процессе репликации ДНК в процессе деления клеток).

Очевидно, методы протеомики могут быть использованы для исследования первых трех процессов [Soltow Q.A., Jones D. P., Promislow D. E. L., 2010].

В течение последнего столетия продолжительность жизни человека в промышленно развитых странах увеличилась почти в два раза за счет улучшения неонатальной помощи, профилактики и лечения инфекций, заболеваний сердечно-сосудистой системы, эндокринных и других болезней. Однако старение населения и связанные с ним заболевания приносят обществу значительные социальные и экономические потери [Sahin E., Depinho R.A., 2010], поэтому рождаются такие объединения, как исследовательский консорциум «Когорты для изучения болезней сердца и старения в геномной эпидемиологии» (Cohorts for Heart and Aging Research in Genomic Epidemiology, CHARGE) [Psaty B.M, Sitlani C., 2013]. Возникла необходимость понимания молекулярных путей и биологических процессов, лежащих в основе старения. Полагают, что возможности биомедицинских технологий уже сейчас могут либо увеличить возраст начала развития тяжелых возрастных заболеваний и замедлить их прогрессию, либо дадут возможность замедлить процесс старения как таковой [Olshansky S.Jay., Perls T., 2008]. В настоящее время предложено несколько теорий старения. Отдельные из них, отчасти, противоречат друг другу, отчасти - дополняют. Эволюционная теория «запрограммированного старения», сформулированная немецким биологом XIX века Августом Вейсманом [Weismann А., 1889], постулирует, что побочный продукт реализации генетической программы онтогенеза, биологическим механизмом которой является ограничение числа делений соматических клеток. Гипотеза об изменении с возрастом генетического аппарата клетки, является одной из признанных в современной геронтологии. Одни ученые рассматривают возрастные изменения генома как наследственно запрограммированные, другие считают, что старение - результат накопления случайных мутаций. Как известно, теломеры - это концевые участки хромосом, которые не содержат кодирующих участков, но защищают таковые от повреждений, могущих произойти при делении клетки. Теломеры содержат уплотнённую ДНК и стабилизируют хромосомы. При каждом цикле деления клетки происходит укорачивание теломер, что приводит к «репликативному старению» клетки. Теломеры постулируются в качестве универсальных биологических часов, которые сокращаются вместе со старением клеток. Укорочение теломер связано не только со старением, но и с возрастными сопутствующими заболеваниями, в том числе, с опухолями, ишемической болезнью сердца, и сердечной недостаточностью [Москалев А.А., 2008; Oeseburg H. et al., 2010]. Открытие, удостоенное Нобелевской премии по медицине и физиологии 2009 года, объяснило, как именно теломеры защищают хромосомы. В 1985 году Блэкберн впервые экспериментально идентифицировала теломеразу - фермент, добавляющий особые повторяющиеся последовательности ДНК к 3'-концу цепи ДНК на участках теломер, которые располагаются на концах хромосом в эукариотических клетках. Теломераза перестает работать в дифференцированных соматических клетках взрослого человека, сохраняя свою активность в половых и стволовых клетках, а также в клетках большинства опухолей. Было установлено, что при более низких концентрациях теломеразы и меньшей длине теломер, в лимфоцитах крови человека в несколько раз увеличивается риск сердечно-сосудистых заболеваний, которые, как известно, составляют главную причину старческой смертности [Farzaneh-Far R. et al., 2010]. Под руководством профессора Рудольфа были идентифицированы 4 белка (LL-37/CRAMP, STMN-1, EF-1б, Chi3L3), экспрессия которых повышалась при повреждениях теломер [Begus-Nahrmann Y. et al., 2009]. Ученые установили, что длина теломер связана с физической активностью после поправок на возраст, пол, вес, наличие вредных привычек, социоэкономический статус [Cherkas L.F. et al., 2008]. В то же время, в ходе исследований в лаборатории Зглиницки было показано, что одним из ключевых факторов укорочения теломерных участков является окислительный стресс, который сильнее воздействует на укорочение теломер, чем репликативное старение [Ahmed S. et al., 2008]. Выдвинутая Харманом (1956) и Эмануэлем (1958), свободнорадикальная теория объясняет не только механизм старения, но и широкий круг связанных с ним патологических процессов (сердечно-сосудистых заболеваний, ослабления иммунитета, нарушений функции мозга, развитие катаракты, рака и некоторых других). Согласно этой теории, причиной нарушения функционирования клеток является избыточное образование свободных радикалов - активных форм кислорода, образующихся главным образом в митохондриях [Remmen H.V., Jones D.P., 2009]. Возможно, окислительный стресс при старении может быть результатом дисбаланса прооксидантов и антиоксидантов [Jones D.P., 2006]. В процессе старения митохондрии подвергаются самоликвидации, названной Скулачевым митоптозом. Когда количество погибших митохондрий возрастает, продукты их распада инициируют апоптоз. Один из предложенных митохондриальных антиоксидантов (SkQ1), у мышей и крыс замедляет развитие таких признаков старения, как инволюция тимуса и фолликулярных клеток селезенки, уменьшение соотношения лимфоцитов и нейтрофилов в крови, развитие остеопороза, катаракты, ретинопатии, глаукомы, гипотермии, исчезновение эстральных циклов у самок и полового влечения у самцов [Skulachev V.P., 2009]. Обнаружено, что на молекулярном уровне важную роль в процессе старения играет нарушение координации между ядерным и митохондриальным геномами. Раскоординация начинается с падения уровня никотинамид-аденин-динуклеотида (NAD), который кодируется геном SIRT1; в этих условиях он не может контролировать активность одного из транскрипционных факторов - HIF. Уровень HIF повышается, что нарушает нормальную коммуникацию генов ядра и митохондрий [Hubbard B.P., Sinclair D.A., 2014]. На системном уровне физиологическое старение проявляется нарушением способности адаптироваться к физиологическим стрессам [Lipsitz L.A., Goldberger A.L., 1992]. Существует связь между неконтролируемой провоспалительной активностью и связанными со старением заболеваниями. Снижение ядерного рецептора активаторов пролиферации пероксисом (PPARs) тесно связано с повышением уровня воспалительных медиаторов в процессе старения [Chung J.H. et al., 2008]. По мнению Hjelmborg с соавт., генетическое влияние на продолжительность жизни не линейно - оно минимально до 60 лет, но увеличивается в дальнейшем, что говорит о необходимости поиска генов, влияющих на продолжительность жизни у людей старших возрастных категорий [Hjelmborg J. et al., 2006].

В начале 50-х годов Дильман выдвинул и обосновал идею о существовании единого регуляторного механизма, определяющего закономерности возникновения и развития в организме различных гомеостатических систем в процессе его онтогенеза. Согласно его гипотезе, главная причина старения - это возрастное снижение чувствительности гипоталамуса к регуляторным сигналам, поступающим от нервной системы и желез внутренней секреции [Дильман В.М., 1987]. По мнению Panowski и Dillin, эндокринная сигнализация играет ключевую роль в большинстве процессов, которые изменяются при старении многоклеточных организмов [Panowski S.H., Dillin A., 2009]. Возрастзависимые изменения в сигнальных каскадах различных гормонов, начиная от концентрации гормона в крови и заканчивая функциональным состоянием клеток и тканей, формируют фенотипические признаки старения. Одним из возможных маркеров старения является гормон роста, поскольку хорошо известно, что уровень этого гормона с возрастом снижается. Секреция гормона роста снижается примерно на 14% за 10 лет, начиная с 20-25 лет, а его рецепторы при старении подвергаются десенситизации. Полагают, что подобное снижение уровня гормона роста ответственно и за возрастзависимое накопление жировой ткани, и за снижение мышечной массы, а также за уменьшение содержания минералов в костях. Однако механизм снижения уровня гормона роста при старении может быть опосредован некими пока не идентифицированными процессами. Бартке с соавт. показали, что мыши с нарушенной функцией гипофиза живут дольше контрольных животных, а «сверхпродукция» гормона роста приводит к сокращению продолжительности жизни [Brown-Borg H.M., Rakoczy S.G., Sharma S., Bartke A., 2009]. С возрастом отмечаются определенные нейроэндокринные нарушения, например, изменяется уровень лютеинизирующего гормона (ЛГ), нарушаются связи, такие как АКТГ-кортизол, ЛГ-тестостерон [Veldhuis J.D., 1997]. По мнению Fanelli с соавт., происходят важные изменения в эксперссии пероксисом (органелла эукариотической клетки, содержащая большое количество ферментов, катализирующих окислительно-восстановительные реакции), что коррелирует с развитием глиоза, происходящим в гиппокампе в процессе старения [Fanelli F. et al., 2013]. Исследования долгожителей показали, что в их субпопуляции отмечается низкая заболеваемость раком, болезнями сердца, а также более высокая чувствительность к инсулину, что связано с гомозиготностью по гену FOXO3A GG. В молодости, как правило, долгожители испытывали нехватку калорий и в течение всей жизни имели низкий индекс массы тела [Willcox B.J. et al., 2008]. В эксперименте, проведенном на 70-летних добровольцах, использовали панель из 10 маркеров: индекс талия-бедро, систолическое и диастолическое кровяное давление, содержание в моче кортизола, норадреналина и адреналина, содержание в сыворотке крови дегидроэпиандростерона, гликозилированного гемоглобина, липопротеинов высокой плотности и общего холестерина. Разрегулированная постоянная выработка гормонов-медиаторов стресса (адреналин, норадреналин, дофамин), так называемая аллостатическая нагрузка, исследовалась у добровольцев дважды с интервалом в 2,5 года. Выявлено, что постоянная выработка этих гормонов может происходить в течение долгого времени и причинять большой вред организму. По данным исследования, увеличение каждого из этих 10 биомаркеров повышает риск смертности в ближайшие 4,5 года на 3,3% [Wolkowitz O.M., Burke H., Epel E.S., Reus V.I., 2009].

Понимание этиологии процесса старения затруднено и такими факторами, как различное время начала старения тканей. Органы стареют с разной скоростью, этот процесс зависит от многих факторов, включая генетическое влияние на продолжительность жизни человека, образ жизни, факторы окружающей среды, а также общее снижение функциональных резервов [Hjelmborg V.B. et al., 2006]. Концепция тканевой (органной) «мозаичности» предполагает различную «уязвимость» клеточных систем, определяющих устойчивость организма к предъявляемым требованиям. Основой такой мозаичности служат причины генного порядка, которые влияют, в конечном счете, на функциональный дисбаланс, инверсии клеточных циклов или трансформацию прогениторных (стволовых) клеток и т.п. [Гомазков О.А., 2011]. Отсутствуют адекватные биомаркеры, способные дать представление о количественной мере старения на молекулярном и клеточном уровнях, а также влияние на продолжительность жизни условий жизнедеятельности, такие как, к примеру, калорийность пищи [Kenyon C., 2005]. Считают, что ограничение калорийности рациона связано с увеличением митохондриальной активности, что может принести пользу в замедлении старения и сопутствующих заболеваний [Guarente L., 2008]. Риск смерти от сердечно-сосудистых заболеваний и/или рака неуклонно снижается у людей после 60 лет, а старше 80 - преобладают другие причины смерти [de los Campos G., Klimentidis Y.C., Vazquez A.I., Allison D.B., 2012]. С возрастом происходит общее снижение физиологических резервов, необходимых для того, чтобы справиться с вызовами гомеостаза [Paletta F.X., Cowdry E.V., 1942]. У лиц пожилого возраста эти прогрессивные изменения приводят к повышенной восприимчивости к многочисленным заболеваниям [Martin J.E., Sheaff M.T., 2007]. В Соединенных Штатах почти у 50% людей старше 65 лет развиваются сердечно-сосудистые заболевания, у 35% - артропатии, у 15% - диабет 2 типа, у 10% - заболевания легких [Sahin E., Depinho R.A., 2010]. Физиологические параметры у человека при старении снижаются на 80% к 80 годам от своего функционального максимума. В работе Bulpitt с соавт., отдельные показатели, связанные со старением, были определены в группах 397 мужчин и 130 женщин в возрасте от 37 до 58 лет. Седые волосы, неупругость кожи положительно связаны с хронологическим возрастом, отрицательная связь обнаружена между уровнем сывороточного альбумина, концентрацией креатинина в сыворотке, систолическим давлением, уровнем кальция крови [Bulpitt C.J. et al., 1994].

Морфо-функциональные признаки старения почечной ткани

C возрастом фильтрационная способность почек снижается на 20-25% на протяжении периода с 40 до 80 лет [Zьrbig P., Schiffer E., Mischak H., 2009]. Анатомо-функциональное старение в почках отражается на составе белков, выводимых с мочой [Esposito C., Dal Canton A., 2010; Glassock R.J., Rule A.D., 2012]. Отмечают, что возрастное снижение веса почек начинается с 40-50 лет, к 70-80 годам достигает 10-30% [Rao U.V., Wagner H.N.Jr., 1972]. Морфологически стареющая почка характеризуется развитием гиалиноза, уменьшением числа нефронов и интерстициальным фиброзом [Pannarale G. et al., 2010]. Многочисленные исследования подтвердили увеличение склеротических клубочков с возрастом [Vazquez Martul E., Veiga B.A., 2003; Rule A.D. et al., 2010]. Исследование прижизненных биоптатов донорских почек показало образование гломерулосклероза на протяжении всей жизни: 19% , 38% , 47%, 65% , 76% и 82%, соответственно у ворастных групп от 18 - до 29 лет; от 30 - до 39 лет; 40-49 лет; 50-59 лет; 60-69 и 70-77 лет [Rule A.D. et al., 2010]. В процессе старения организма клубочки приобретают ишемический внешний вид, происходит утолщение базальной мембраны, интракапсулярный фиброз, что свидетельствует о сосудистом происхождении поражения. Со временем происходит отложение коллагена в боуменовой капсуле, медиальная гипертрофия и гиалиноз артериол [Mancilla E. et al., 2008; Rule A.D. et al., 2010]. У 1957 потенциальных доноров почек, которым была сделана компьютерная томография, ангиография и урограмма, были выявлены признаки, развитие которых положительно коррелировало с возрастом: распространенность почечной дисплазии фиброзно-мышечной артерии, атеросклеротическое сужение сосуда, фокусное кортикальное истончение паренхимы, кальцификация [Lorenz E.C. et al., 2011]. Из 447 возраст-зависимых генов - 49 кодируют белковые компоненты внеклеточного матрикса [Rodwell G.E. et al., 2004]. Гломерулосклероз, атеросклероз, трубчатая атрофия и интерстициальный фиброз - составляют нефросклероз, оценка выраженности которого может быть выполнена по числу различных гистологических аномалий [Martin J.E., Sheaff M.T., 2007; Glassock R.J., Rule A.D., 2012]. Частота развития нефросклероза, определенного по двум или более из этих аномалий, возрастает с возрастом постепенно: 2,7% для 18-29 летних; 16% для 30-39 летних; 28% для 40-49 летних; 44% для 50-59 летних; 58% для 60-69 летних; и 73% для 70-77 летних [Martin J.E., Sheaff M.T., 2007; Glassock R.J., Rule A.D., 2012], что подтверждают гистологические исследования [Rodwell G.E. et al., 2004]. Существуют противоречивые данные об изменениях размера клубочков с возрастом. Некоторые авторы сообщают о снижении клубочковой поверхности или объема гломерул с возрастом [Nyengaard J.R., Bendtsen T.F., 1992], другие авторы не находят возрастной зависимости [Hoy W.E. et al., 2003] или отмечают увеличение объема клубочков с возрастом [Fulladosa X. et al., 2003]. Так, в процессе старения, с 40 лет, отмечается нарастание размеров площадей почечных телец и сосудистых клубочков, с последующим снижением этих показателей с 56-60 - летнего возраста. После 60 лет отмечается тенденция снижения размеров почечных телец и сосудистых клубочков всех генераций нефронов, которое сменяется относительным подъемом этих величин после 70 лет, что связано со значительным снижением числа почечных телец в корковом и мозговом веществе почек [Тризно М.Н., Асфандияров Ф.Р., Кафаров Э.С., 2009]. Склероз почечных канальцев приводит к нарушению реабсорбции воды и натрия - важных участников регуляции уровня артериального давления в организме. В результате, по мере прогрессирующей утраты канальцами способности удерживать натрий, может развиться артериальная гипотония. В работе Hoy с соавт. было подсчитано число клубочков при морфологическом исследовании 78 почек, в возрастном диапазоне от новорожденных до пожилых лиц (вплоть до 84 лет). Число клубочков в органе колебалось почти в девять раз (с 210 332 до 1825380), снижаясь на протяжении всей взрослой жизни (г= -0,32 , p=0,009). Средний объем почечного тельца изменялся в 5,6 раза у взрослых и обратно коррелировал с числом клубочков (г = - 0,38, p=0,001) [Hoy W.E. et al., 2003]. Однако слабость коэффициентов корреляции указывала, что кроме собственно возраста, существуют и другие факторы (фактор), влияющие на данные морфологические показатели. Дегенеративные изменения в клубочках ведут к атрофии приводящих и отводящих артериол. По мере снижения числа функционирующих почечных клубочков, оставшиеся подвергаются нагрузке в виде гиперфильтрации и гиперперфузии, что приводит к повреждению структуры и нарушению функций гломерул. Скорость клубочковой фильтрации с возрастом постепенно падает, с 20-25% от 40 до 80 лет [Zьrbig P. et al., 2009]. Способность почек концентрировать мочу так же постепенно снижается с возрастом на 22% у возрастных групп старше 55 лет по сравнению с 40 - летними [Hoang К. et al., 2003]. Происходят так же и сопутствующие изменения в паренхиме, связанные со старением [Martin J.E., Sheaff M.T., 2007; Zьrbig P. et al., 2009]. По данным гистологических исследований, снижение скорости клубочковой фильтрации в стареющем организме сопровождается ростом объема интерстициальной ткани [Hoang K. et al., 2003], то есть расширением внеклеточного матрикса, поддерживающего равновесие синтеза и деградации [Liu Y., 2006]. Учет снижения функции почек с возрастом имеет важные следствия не только для поддержания гомеостаза организма, но и в клинических аспектах, таких как использование лекарственной терапии, трансплантации почки.

Очевидно, важно понимать, какие молекулярные механизмы и клеточные изменения, лежат в основе процессов, связанных со старением, т. к. понимание этих процессов помогает предотвратить опасные для жизни заболевания почек [Esposito C., Dal Canton A., 2010]. Использование протеомных методов для изучения маркеров старения в моче человека начато не так давно. Исследование низкомолекулярного протеома мочи 324 здоровых людей, в широком возрастном диапазоне, от 2 до 73 лет позволило выявить высокое сходство списка маркеров старения с маркерами хронической почечной недостаточности. Из 209 пептидов, уровень которых изменялся с возрастом, только одиннадцать были связаны с полом, тринадцать связаны с полом и возрастом. Из работы следует, что 73% «возраст-зависимых» пептидов были также маркерами хронической почечной недостаточности. Это еще раз подтверждает гипотезу, что возрастные изменения могут иметь патогенез, имеющий общие звенья с таковым при хронических заболеваниях [Zьrbig P. et al., 2009]. Выявленное Zьrbig с соавт., снижение фрагментов коллагена-б1 с возрастом отражает угнетение активности почечных протеолитических ферментов, что сопровождается повышением объема внеклеточного матрикса у пожилых людей [Zьrbig P. et al., 2009]. В моделях старения у животных, модификация экспрессии и активности матричных металлопротеиназ, сопровождались увеличением осаждения компонентов внеклеточного матрикса в паренхиме почке [Gagliano N. et al., 2000].

1.10.2. Характеристика процессов старения отдельных тканей

Организм человека обладает замечательной способностью обновления тканей на протяжении всей жизни. Этот непрерывный потенциал самообновления поддерживается стволовыми клетками [Чернилевский В.Е., 2008; Sharpless N.E., De Pinho R.A., 2007; Rossi D.J., Jamieson C.H., Weissman I.L., 2008]. Тимус млекопитающих отвечает за пролиферацию, созревание и селекцию наивных Т-лимфоцитов. При старении отмечается деградация тимуса и снижение его функциональной активности - инволюция, происходящая, в основном, за счет угнетения дифференцировки Т-клеток в тимусе на различных стадиях. У стареющих мышей увеличивается число DN1 (дважды негативные тимоциты) клеток. Переход от стадии DN1 к стадии DN2 обуславливает цитокин IL-7, уровень которого уменьшается в процессе старения тимуса. Для дифференцировки DN1 клеток в DN2 клетки IL-7 увеличивает экспрессию анти-апоптозного белка bcl-2. Из-за активации bcl-2, при сверхэкспрессии IL-7, возможны гиперпролиферация лимфоидных клеток и развитие лимфом. Чтобы обойти эти проблемы и увеличить тимопоэз при старении, группа под руководством доктора Томана предложила вводить в тимус стареющих мышей клетки стромы, секретирующие IL-7 [Virts E.L., Phillips J.A., Thoman M.L., 2006].

Стволовые клетки стареют в результате таких событий, как повреждение ДНК, укорочение теломер, деятельности транскрипционного фактора, регулирующего клеточный цикл (p53), гена p16, в результате чего происходит снижение репликативной функции отдельных видов стволовых клеток с возрастом, с чем, по мнению Sharpless и De Pinho, связаны некоторые возрастные заболевания человека - атеросклероз и сахарный диабет 2 типа [Sharpless N.E., De Pinho R.A., 2007]. Старение тканеспецифичных стволовых клеток и клеток предшественников, как полагают Rossi с соавт., приводит к старению тканей и функций у пожилых людей [Rossi D.J., Jamieson C.H., Weissman I.L., 2008]. Накапливаются доказательства того, что параллельно с возраст-ассоциированным физиологическим спадом, особенно в пролиферативно-активных органах и тканях, снижаются пролиферативные реакции и направление дифференциации стволовых клеток [Sahin E., Depinho R.A., 2010]. В то же время, эти долгоживущие возобновляемые резервуары могут также негативно повлиять на здоровье пожилых лиц, обеспечивая предпочтительный рост злокачественных клеток [Rossi D.J., Jamieson C.H., Weissman I.L., 2008]. Группой Патэля показано, что пересадка стволовых клеток значительно улучшает функцию сердца у пациентов, перенесших шунтирование [Bruckner B.A. et al., 2009]. В работе Валюшкиной и Буравковой было показало наличие изменений в популяции мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников костного мозга крыс, связанных с возрастом животных. Были выявлены изменения пролиферативного потенциала, доли клеток, содержащих бета-галактозидазу (выполняющих ферментативную функцию в организме), способности к остеогенной и адипогенной дифференцировке, а также снижение способности к участию в процессах репарации с увеличением возраста донора клеток. При этом полученные популяции клеток не имели различий в иммуннофенотипе. Кроме этого, удалось показать, что культивирование клеток старых животных при пониженном содержании кислорода приводит к эффектам, противоположным таковым при старении: увеличении пролиферативной активности и остеогенеза, снижении доли стареющих клеток и индуцированного адипогенного потенциала [Валюшкина М.П., Буравкова Л.Б., 2012]. У новорожденных красный костный мозг в основном эритробластический, т.е. в нем преобладают эритробласты. К периоду полового созревания морфология и функция красного костного мозга соответствуют нормативам взрослого человека. В старческом возрасте красный костный мозг ослизняется. С возрастом печень и почки проявляют пониженную способность к метаболизму, уменьшается сердечно-сосудистой резерв, связанный со снижением максимальных частота сердечных сокращений, сократительной способности сердечной мышцы и емкости легких [Vijg J., Dolle M.E., 2007].

Анатомические и физиологические изменения, связанные с возрастом, проявляются с разной скоростью в различных органах и тканях. Отличительными чертами старения являются потеря мышечной массы, снижение двигательной активности, снижение костной массы (остеопороз), а также истончение слизистых и снижение эластичности кожи. С возрастом в кроветворной системе проявляется нормоцитарная анемия, происходит накопление миелоидных клеток в костном мозге. Другие ткани, такие, как мозг, печень и почки, испытывают более низкую степень клеточной потери относительно общего снижения массы. Эти возрастные клеточно-структурные изменения тканей тесно связаны с функциональным (физиологическим) ослаблением реактивности в ответ на стресс различной природы и повышенным риском развития заболеваний. При использовании трансгенных мышей (несущих ген LacZ) удалось изучить связанный со старением спектр мутаций в различных органах. С возрастом в печени частота мутаций возрастает, в мозге увеличение числа мутаций наблюдалось в возрасте 4-6 месяцев, а затем прекращалось. Полагают, что при старении накапливается и является тканеспецифичным большое число повреждений ДНК [Gravina S., Vijg J., 2010]. С возрастом снижаются функции различных органов, реакции на физиологические потребности организма [Sahin E., Depinho R.A., 2010]. Функциональный спад наиболее заметен с возрастом в костно-мышечной системе, где происходит снижение уровня активности, силы и диапазона движения и развития артропатии. В костях с 30-летнего возраста начинают преобладать признаки остеорезорбции - увеличивается диаметр гаверсовых каналов, уменьшается толщина трабекул большеберцовой кости, кортикального слоя ребер. Признаки, определяющие степень выраженности остеопороза, являются основными при определении биологического возраста у лиц старше 30 лет [Федулова М.В., 2004]. Заболевания костной ткани, в том числе остеопороз, достаточно широко распространены в настоящее время. Одной из главных причин развития остеопороза считают нарушение нормального протекания цепи реакций, блокирующих запуск белком NFkB естественных внутриклеточных защитных механизмов и ведущих к гибели клетки при апоптозе [Pederson L. et al., 2008]. Трансформирующий фактор роста-бета (TGF-в), препятствуя преждевременной гибели клетки и вырождению костной ткани, запускает каскад реакций с вовлечением целого ряда ферментов, что приводит, в конечном итоге, к активации NFkB-сигнального пути и способствует выживанию остеокласта. Полагают, что утрата наиболее часто встречающихся межмолекулярных связей в коллагеновых волокнах - дивалентных сшивок - это одна из причин развития хрупкости костей у лиц пожилого возраста [Brьel A., Ortoft G., Oxlund H., 1998].

Скелетные мышцы испытывают снижение регенеративного потенциала с возрастом, что проявляется снижением числа миогенных волокон и их замены фиброзной тканью [Cerletti M. et al., 2008]. При этом происходит ослабление регенерации после травм, и, как правило, неполное восстановление [Di Iorio A. et al., 2006]. Возрастные изменения приводят к потере мышечной массы - саркопении, при этом скорость метаболизма в ткани замедляется. Для объяснения причин саркопении был предложен ряд теорий. Одна из них связывает саркопению с увеличением количества свободных радикалов, окислительным стрессом и возрастзависимой аккумуляцией митохондриальных аномалий: то есть с накоплением мутаций в мДНК, приводящих к дефектам белков электрон-транспортной цепи. Исследователи под руководством Айкена предположили, что мышцы, которые наиболее ослабляются в результате саркопении, будут нести больше дефектов электрон-транспортной цепи, чем мышцы, меньше старадющие от саркопении. Оказалось, что миоциты, в которых отсутствует цитохромоксидаза и наблюдается повышенная активность сукцинат-дегидрогеназы, несут мутации мтДНК. Накопление делеций мДНК приводит к потере активности цитохромоксидазой и вызывает повышенную активность сукцинат-дегидрогеназы [McKiernan et al., 2009].

Нейрогенезу человека продолжается в течение всей взрослой жизни, при этом новые нейроны происходят от нервных стволовых клеток (НСК), локализующихся в субвентрикулярной зоне и в субгранулярной зоне гиппокампа зубчатой извилины [Gage F.H., 2000]. Однако при старении организма активность нейрогенеза снижается, что может способствовать нейродегенеративным заболеваниям. При сравнении популяций НСК в субвентрикулярной зонах молодых (2-4 месячных) и старых (24-26 месячных) мышей отмечается примерно двукратное сокращение нервных стволовых клеток старых мышей [Molofsky A.V. et al., 2006]. В дополнении к этому, общее снижение числа вновь сформированных нейронов имеет и функциональные последствия, так, в стареющем мозге мыши, снижение нейрогенеза связано с нарушениями обоняния [Enwere E. et al., 2004].

Известно, что селезенка человека выполняет иммунную, фильтрационную и депонирующую функции, участвует в процессах гемолиза, синтеза белков и в кроветворении [Кузнецова Е.П., Линькова Н.С, Дудков А.В., Войцеховская М.А., 2013]. С возрастом наблюдается снижение функциональной активности этого органа, увеличивается число стареющих эритроцитов в кровеносном русле, что является одной из причин неэффективности газообменных процессов в тканях при старении. Возрастные изменения в селезенке характеризуются как морфологической, так и функциональной картиной инволюции. Количество лимфатических узелков и размеры их центров с возрастом уменьшается. Ретикулярные волокна белой и красной пульпы грубеют и становятся более извилистыми, формируются узловатые утолщения волокон. При возрастной атрофии селезенки количество макрофагов и лимфоцитов в пульпе уменьшается, тогда как число зернистых лейкоцитов и тучных клеток возрастает. Как в старческом, так и в детском возрасте в селезенке обнаруживаются гигантские многоядерные клетки - мегакариоциты. Важную роль в процессах старения селезенки играют кейлоны - высокомолекулярные белки, угнетающие пролиферацию иммунных клеток селезенки. Из кейлонов были выделены низкомолекулярные пептиды - супрессоры активности иммунных клеток - тафцин и спленин. Предшественник тафцина синтезируется в лимфоцитах селезенки в виде лейконина, который путем ограниченного протеолиза преобразуется в активную форму. Спленин по функциям и структуре напоминает гормон тимуса тимопоэтин, что свидетельствует о сходстве иммунологических процессов, а возможно, и механизмов старения указанных органов. Так, активные центры спленина и тимопоэтина различаются лишь одним аминокислым остатком [Кузнецова Е.П., Линькова Н.С, Дудков А.В., Войцеховская М.А., 2013].

Печень человека претерпевает ряд структурных изменений, часть которых носит компенсаторно-приспособительный характер и обеспечивает удовлетворительное функционирование органа в процессе старения. После 50 лет отмечено уменьшение массы печени (до 600 г), что коррелирует с изменением относительной доли массы органа к массе тела. В связи с развитием возрастных изменений после 70 лет орган уменьшается на 150--200 грамм [Лазебник Л. Б., Ильченко Л. Ю., 2007]. Выраженная атрофия печени отмечается лишь к 8-му десятилетию; данный показатель значительно варьирует, но не достигает резкой степени выраженности даже у долгожителей. Начиная с 45 - летнего возраста происходит уменьшение общего числа гепатоцитов [Лазебник Л.Б., Ильченко Л.Ю., 2007]. В старческом возрасте выявлено увеличение количества и размера лизосом, а также колебания активности лизосомных ферментов [Serstй T., Bourgeois N., 2006], обнаружено повышенное включение липофусцина в гепатоцитах центральных долек с тенденцией к атрофии этих клеток. Изменяются размеры митохондрий, растет число вторичных лизосом [Лазебник Л.Б., Ильченко Л.Ю., 2007].

Поджелудочная железа является органом пищеварительной и эндокринной системы, ее роль в жизнедеятельности организма трудно переоценить [Дедов И.И., Петеркова В.А., 2006]. Главная составляющая эндокринной функции поджелудочной железы - синтез в островках Лангерганса инсулина и глюкагона, которые служат ключевыми гормональными факторами, регулирующими энергетический метаболизм [Дедов И.И., Петеркова В.А., 2006; Волков В.П., 2014]. С возрастом значительно сокращается популяция эндокриноцитов островкового аппарата поджелудочной железы за счёт в-клеточного компонента [Снигур Г. Л., Смирнов А. В., 2010; Волков В.П. 2014], что приводит к уменьшению толерантности к глюкозе и зачастую к развитию диабета [Meier J.J., Ueberberg S., Korbas S., Schneider S., 2011]. Анализ возрастных изменений цитометрических параметров в-клеток показал, что размер последних плавно уменьшается и после 40 лет статистически достоверно отличается от данного показателя у молодых [Волков В.П., 2014]. С возрастом происходит уменьшение размеров железы и ее частичная атрофия [Sato T. et al., 2012]. Группа японских ученых под руководством Tohno изучила содержание основных химических элементов в протоке поджелудочной железы и в общем желчном протоке у людей различного возраста при помощи плазменно-атомной эмиссионной спектрометрии. Отмечено, что с возрастом в протоке поджелудочной железы наблюдается значительное увеличение содержания магния. Кроме того, при оценке соотношений между элементами удалось установить прямую корреляцию с возрастом соотношения сера/магний, а также фосфор / натрий [Tohno Y. et al., 2004].

В настоящее время большое количество исследований посвящено изучению протеома мочи применительно к клиническим и/или геронтологическим задачам. В них отмечается необходимость исследования "нормального старения", выявления физиологических процессов, которые наиболее выражено страдают от старости [Bakun M. et al., 2014].

Таким образом, изучение протеома мочи здорового человека в нормальных условиях жизнедеятельности, и при действии реальных и моделируемых факторов космического полета имеет большую теоретическую и практическую значимость, так как может позволить на молекулярном уровне выявить возрастные изменения, а так же механизмы приспособления человека к новым условиям существования, определить адаптивные возможности организма, не связанные с развитием заболевания. Результаты исследования помогут лучше понять направленность и диапазон происходящих в условиях космического полета физиологических изменений в организме и разработать эффективные меры профилактики и коррекции неблагоприятного воздействия условий космического полета на организм человека.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы исследования

Приборы:

- Робот для префракционирования образцов биоматериала ClinProt («BrukerDaltonicsGmbH», Германия);

- Времяпролетный масс-спектрометр с ионизацией MALDI Autoflex III TOF/TOF («BrukerDaltonicsGmbH», Германия);

- хроматограф Agilent 1100;

- Гибридный масс-спектрометр ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье LTQFTMS («Thermo»);

- вакуумный концентратор;

- прибор для измерения мультичастотного импедансана Hydra ECF/ICF 4200 (XitronTechnologies, SanDiego, USA);

- AUTION Max (АХ-4280).

Химические реактивы:

- Деионизованная вода (для ВЭЖХ), Merck, Германия;

- Трифторуксусная кислота (для ВЭЖХ), Merck, Германия;

- Ацетон (для ВЭЖХ), Химмед, Россия;

- Этанол (для ВЭЖХ), Merck, Германия;

- ?-циано-4-гидроксикоричная кислота (HCCA) (матрица для MALDI-TOF-масс-спектрометрии), Bruker Daltonics GmbH, Германия;

- 2,5-дигидроксибензойная кислота (матрица для MALDI-TOF-масс-спектрометрии), Bruker Daltonics GmbH, Германия;

- Tris основной;

- EDTA;

- Guanidine-HCL;

- DTT;

- Йодацетамид;

- Соляная кислота;

- Бикарбонат аммония;

- Модифицированный трипсин;

- Муравьиная кислота.

Объекты исследования

В качестве объекта исследований были использованы пробы мочи 52 здоровых добровольцев в привычных условиях жизнедеятельности, испытателей, участвовавших в наземных модельных экспериментах - 105 - и 520 - суточных изоляциях в гермообъеме, 5-суточной «сухой» иммерсии, 21-суточной антиортостатической гипокинезией с углом наклона продольной оси тела относительно горизонта -6°, космонавтов, совершивших длительные орбитальные полеты на МКС.

Все добровольцы были допущены врачебно-экспертной комиссией к проведению испытаний. Процедуры и методики исследований были одобрены Комиссией по биомедицинской этике Института медико-биологических проблем РАН, а от испытателей, принимавших участие в исследовании, получено письменное Информированное согласие (табл. 1).

Таблица 1. Общий объём проведённых исследований.

2.3 Модельные эксперименты

2.3.1 Исследование протеома мочи здоровых добровольцев

Для исследования протеома мочи использовали образцы мочи 52 здоровых добровольцев в возрасте 19-54 лет, не подвергавшихся никаким воздействиям и находившихся в привычных условиях жизнедеятельности.

2.3.2 520-суточная изоляция в гермообъеме

Эксперимент с участием здоровых добровольцев был проведен в Наземном Экспериментальном Комплексе (НЭК) ГНЦ РФ - ИМБП РАН, состоящем из 3 соединенных друг с другом модулей, с использованием автономных систем жизнеобеспечения, в котором были созданы условия полного контроля жизненного ритма, физической нагрузки и диеты [Моруков Б.В., Белаковский М.С., Дёмин Е.П., Суворов А.В., 2012].

Обследуемые добровольно находились 520 суток в НЭКе, получали стандартный рацион питания, с контролируемым содержанием всех нутриентов (использовали CARRAR System), водопотребление учитывалось. Одной из особенностей их рациона питания был контролируемый, но периодически изменяющийся режим потребления соли (табл. 2) на протяжении от первых до двести пятьдесят первых суток.

Таблица 2. Предписанный добровольцам режим потребления соли (г/сутки).

Примечание: в РФ норма потребления соли для человека находится в пределах 4 - 12 г/сутки.

Проведение балансовых исследований на протяжении первой половины эксперимента требовало от испытателей полного потребления всех продуктов рациона питания, а также учета потребления жидкости. После 251 суток и до конца восстановительного периода режим солепотребления был обычным, его уровень не учитывали. Разработанные для использования в данном эксперименте рационы по содержанию необходимых организму человека пищевых веществ соответствовали принятым физиологическим нормам для контингентов, чья профессиональная деятельность по энерготратам относится к категории средней тяжести. Пищевой состав рационов отвечал рекомендациям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), а также был согласован с российско-американскими нормами по пищевому составу рационов питания для экипажей МКС [Агуреев А.Н., Сидоренко Л.А., 2012]. Рацион питания добровольцев в среднем содержал: белков -101,7 г. (14,7%), жиров - 83,2 г. (27,5%), углеводов - 376,8 г. (55,1%) при калорийности 2750 ккал/сутки.

2.3.3. 105-суточная изоляция в гермообъеме

Обследуемые добровольно находились 105 суток в НЭКе, получали стандартный рацион питания, с контролируемым содержанием всех нутриентов (использовали CARRAR System), водопотребление учитывалось [Моруков Б.В., Демин Е.П., Васильева Г.Ю., 2010].