Протеомный профиль мочи здорового человека в норме и при действии факторов космического полета

В ходе эксперимента, согласно Программе, директивно изменялось количество потребления соли (NaCl) обследуемыми: с 1 по 35 сутки изоляции каждый из них потреблял в среднем 11,55 г поваренной соли в день, с 36 по 70 сутки - 8,73 г, с 71 по 75 сутки - 11,85 г, 75 по 104 сутки - 7,38 г. Эти уровни среднего потребления несколько отличались от предписанного (табл. 3).

Таблица 3. Предписанный добровольцам режим потребления соли (г/сутки).

Период эксперимента	сутки	1 - 35	36 - 70	71 - 75	76 - 98
	неделя	1-5	6-9	10	11-14
Уровень потребления соли, г/сутки	12	9	12	6

Примечание: в РФ норма потребления соли для человека находится в пределах 4 - 12 г/сутки.

Также в ходе изоляции менялся характер используемых профилактических физических тренировок. Так, в течение эксперимента все испытатели тренировались по полчаса в день на велоэргометре. Кроме того, проводились дополнительные тренировки с использованием низкочастотной электромиостимуляции (3 часа в день), высокочастотной электромиостимуляции (40 минут в день) и силового тренажера «MDS» (40 минут в день). Вид дополнительных тренировок у обследуемых изменялся каждые 30 суток эксперимента.

2.3.4 21-суточная антиортостатическая гипокинезия

Обследуемые добровольно находились 21 суток в антиортостатическом положении, с углом наклона продольной оси тела относительно горизонтального положения - 6°, в контролируемых условиях на базе исследовательского центра MEDES во Франции, в Тулузе. Исследование проводилось в рамках совместной российско-французской лаборатории. Участники эксперимента не подвергались никаким дополнительным воздействиям, направленным на предупреждение развивающихся адаптивных сдвигов в физиологических системах, получали стандартный рацион питания, с контролируемым содержанием основных нутриентов, учитывали водопотребление. Пищевой состав рационов отвечал рекомендациям ВОЗ.

5-суточная «сухая» иммерсия

Для имитации физиологических эффектов микрогравитации испытуемые погружались в воду в положении лежа до уровня верхней трети плеча (t воды = 33-34°C), но не соприкасались с ней, будучи отделенными, от воды водонепроницаемой свободно закрепленной к бортам тканью. Определенные процедуры (гигиенического характера, а также измерение массы тела) и эксперименты научной программы требовали изъятия испытуемого из ванны; в этом случае испытуемый оставался лежать на спине, на мобильной платформе. Общее время, проведенное вне ванны при 120 часовой иммерсии, составляло 4.11±0.15 часа (M±m). Ежедневное потребление калорий составило ~2880±60 ккал/сутки. Потребление натрия нормировалось на массу тела на уровне 2.8 ммоль/кг/день, кальция ~1100 мг/день, белков - 1.15 г/кг/день. Обследованные участники эксперимента не подвергались никаким дополнительным воздействиям, направленным на предупреждение развивающихся адаптивных сдвигов в физиологических системах [Козловская И.Б., 2008; Томиловская Е.С. 2011; Coupй M. et al., 2013].

2.3.6 Длительные космические полеты

Образцы мочи космонавтов и дублеров собирали в рамках программы «Исследование протеома крови и мочи у основных и дублирующих членов экипажей до и после космических полётов на МКС («Протеом»)», программа исследования которого была одобрена комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ - ИМБП РАН.

Объектом исследования служили образцы мочи, полученные от пятнадцати российских космонавтов мужчин в возрасте от 35 до 51 года, совершивших космические полеты длительностью от 169 до 199 суток на борту Российского сегмента МКС. В качестве контрольной группы использовались образцы мочи дублеров космонавтов. Эти лица проходили аналогичную подготовку, имели тот же рацион питания и водопотребления находились перед полетом в тех же условиях, что и члены основного экипажа.

Циклограмма сбора проб мочи

Сбор биологических образцов мочи здоровых добровольцев осуществлялся однократно.

В эксперименте с 520-суточной изоляцией сбор образцов биологического материала осуществлялся в фоновом периоде за 7 дней до начала эксперимента на 50-е, 93-е, 124-е, 153-е, 180-е, 251-е, 274-е, 303-е, 330-е, 371-е, 400-е, 427-е сутки изоляции, а также на 7-е сутки по окончании эксперимента.

Сбор биологических образцов в эксперименте с 105-суточной изоляцией осуществлялся ежедневно в фоновом периоде за 6 дней до начала эксперимента, еженедельно в изоляции, а также на 1-е, 6-е, 8-е сутки по окончании эксперимента.

В эксперименте с 21-суточной антиортостатической гипокинезией (-6°) сбор образцов биологического материала осуществлялся в фоновом периоде за 7 дней до начала эксперимента, на 5-е, 16-е, 21-е сутки изоляции, а также на 1-е, 3-е и 6-е сутки по окончании эксперимента.

В эксперименте с 5-суточной «сухой» иммерсией сбор образцов биологического материала выполнялся в фоновом периоде за 8 и 3 дня до начала эксперимента, на 2-е, 3-е, 4-е, 5-е сутки иммерсии, а также на 1-е, 3-е и 5-е сутки по окончании эксперимента.

Сбор образцов мочи космонавтов экспедиций на Российском сегменте МКС осуществлялся за 30-45 дней до старта, а так же на 1-е и 7-е сутки после приземления.

Образцы биологического материала дублёров были получены дважды в интервалы времени, соответствующие пред - и первому послеполетному сбору биоматериала у основных членов экипажей (табл. 4).

Таблица 4. Циклограмма сбора мочи.

Эксперимент	Сроки сбора мочи
Здоровые добровольцы	однократно, утром
520-суточная изоляция в гермообъекте	в фоновом периоде; 50, 93, 124, 153, 180, 251, 274, 303, 330, 371, 400, 427 сутки эксперимента; 7 сутки по окончании эксперимента
105-суточная изоляция в гермообъекте	в фоновом периоде; еженедельно в течение 105 суток 1, 7 сутки по окончании эксперимента
21-суточная антиортостатическая гипокинезия (-6°)	в фоновом периоде; 5, 16, 21 сутки эксперимента; 1, 3, 6 сутки по окончании эксперимента
5 - суточная «сухая» иммерсия	в фоновом периоде; 2, 3, 4, 5 сутки эксперимента; 1, 3, 5 сутки по окончании эксперимента
Длительные космические полеты	30-45 дней до старта; 1 и 7 сутки после приземления
Члены дублирующих экипажей	соответствует пред- и послеполётному сбору проб у основного экипажа

2.5 Методы исследования

Поскольку на протеомный состав мочи человека влияет множество факторов (диета, которой придерживается обследуемый, уровень двигательной активности, состояние водного и электролитного обмена организма и другие), то в соответствии с требованиями EuroKUP и HKUPP использовался стандартизированный протокол сбора мочи для анализа протеома. В соответствии с этим протоколом для протеомного анализа мочи использовалась средняя порция второй утренней фракции (предпочтительно) или любая утренняя фракция, которая является наименее вариабельной по белковой композиции вследствие этого - наиболее пригодной для исследований [Валеева О.А. с соавт., 2011; Fiedler G.M. et al., 2007]. Сбор осуществлялся в стерильную пластиковую ёмкость для сбора мочи [Zьrbig P. et al., 2011].

Кроме протеомных методов исследования, в эксперименте с иммерсией, применялись общепринятые методики изучения биохимического состава крови и мочи при исследовании образцов. Анализ проводили на автоматическом анализаторе мочи AUTION Max (АХ-4280). На приборе Hydra ECF/ICF 4200 (Xitron Technologies, San Diego, USA) получали параметры распределения жидкости по компартментам.

2.5.1 Подготовка образцов мочи к хромато-масс-спектрометрическому анализу

Несмотря на малое содержание протеаз в моче, способных изменить белковую композицию образцов при их хранении, для изучения белкового состава требуется начать предварительную пробоподготовку не позднее, чем через 20 минут после отделения фракции мочи. Каждый образец мочи центрифугировали 10 минут при 4°С, 2000 g для удаления загрязнений в виде крупных мертвых клеток, их фрагментов, отбирали надосадочную фракцию, которую замораживали при температуре -80°С для длительного хранения. В дальнейшем замороженные образцы размораживали при комнатной температуре и центрифугировали повторно 10 минут при 4°С, 2000 g.

Основные этапы подготовки образцов для протеомного анализа состояли из следующих этапов [Fliser D., Wittke S., Mischak H., 2005; Mischak H. et al., 2007; Валеева О.А. с соавт., 2011]:

1) концентрирование образцов (надосадочную жидкость) центрифугированием с использованием пробирок с фильтрами AmiconUltra Ultracel-15 3k при 2000 g, 50 минут, +4°C, до 20-ти кратного уменьшения объёма;

2) высушивание образцов в вакуумном концентраторе при +30°C;

3) восстановление (перерастворение осадка в буфере для восстановления - 0,2 М Tris основной (рН 8,5), 2,5 мМ EDTA, 6М Guanidine-HCL, добавление ДТТ - 15 минут при 70°C) и алкилирование (добавление йодацетата натрия - 30 минут при комнатной температуре в темноте) выделенной белковой фракции для денатурации белков, разрыва S-S мостиков и предотвращения обратного образования дисульфидных связей;

4) осаждение белков ацетоном с 0,1% ТФУ при -20оС 8-19 часов и получение сухого белкового осадка (при последовательной промывке три раза этанолом с перерастворением осадка, полученного центрифугированием при 2000 g, 10 минут, +4°C);

5) трипсинолиз - протеолиз с помощью трипсина, для чего образец растворяли в ABB ((NH4)2HCO3) буфере (pH 8,0) до конечной концентрации 1 мг/мл белка, определенной методом по Бредфорду (Bio-Rad) и добавляли трипсин 1:60 по массовым частям к белку и инкубировали при 37°C 8-12 часов.

2.5.2 Прямое профилирование образцов

Для получения показателей вариабельности масс-спектров образцов мочи выполняли прямое профилирование образцов после их концентрирования до 20-ти кратного уменьшения объема. Очистка и концентрация белков из проб мочи осуществлялась с помощью набора магнитных частиц MB-HIC («Bruker Daltonics»), разработанного для специфического захвата протеинов и пептидов в биологических образцах. Метод основан на гидрофобном взаимодействии перед проведением MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа [Fiedler G.M. et al., 2007]. Все шаги пипетирования растворов, отделения магнитных частиц и нанесения на MALDI-мишень выполнялись роботом ClinProtrobot («Bruker Daltonics») с помощью программы ClinProtrobot 1.3. Каждый образец префракционировали в двух повторах, и с каждого повтора в дальнейшем было получено по 4 спектра. Использовали растворители высокой степени очистки (HPLC-grade), фирмы «Merck», Германия. Масс-спектры были получены на масс-спектрометре MALDI MS Autoflex III TOF/TOF («Bruker Daltonics»), работающем в положительном линейном режиме в диапазоне масс от 1000 до 17000 Да. Ионизация достигалась облучением твердотельным лазером. Калибровка масс-спектрометра осуществлялась с помощью белковых стандартов (Peptide Calibration Standard и Protein Calibration Standard II, «Bruker Daltonics»). Сухой стандарт растворяли в 125 мкл 1% ТФУ. Далее стандарт смешивали с матрицей в соотношении 1:10 и наносили на мишень. Спектры получали в автоматическом режиме с помощью редактора «Auto Xecute». Далее по каждому спектру был получен масс-лист с указанием отношения массы к заряду (m/z) каждого пика, его площади и интенсивности (ClinProTools 2.1 software («Bruker Daltonics»)). Эти данные экспортировали в таблицы MS Excel и значения площадей в повторных измерениях усредняли. Кроме того, проводился контроль качества всех полученных спектров с помощью программ FlexAnalysis 3.0 и Statistica 6.0. Статистический анализ проводили с использованием непараметрического критерия Уилкоксона (программа Statistica 6.0 для Windows) [Пахарукова Н.А. с соавт., 2009; Tiss A. et al., 2007].

2.5.3 Хромато-масс-спектрометрический анализ

Анализ образцов проводили на системе, состоящей из хроматографа Agilent 1100 (Agilent Technologies Inc., Санта-Клара, США) и гибридного масс-спектрометра LTQ-FT Ultra (Thermo, Бремен, Германия) - масс-спектрометр ионного циклотронного резонанса, совмещенный с линейной квадрупольной ионной ловушкой, использующейся для накопления ионов и измерения спектров столкновительно индуцированной фрагментации (МС/МС) ионов. Для хроматографии использовали колонку с обращенной фазой ReproSil-Pur C18 (диаметр частиц 3 мкм, диаметр пор 100 А, Dr. Maisch GmbH, Аммербух-Энтринген, Германия), изготовленную с использованием капилляра-эммитера (Pico-tip, New Objective Inc., США) способом, описанным Ишихама [Ishihama Y. et al., 2002].

Масс-спектрометрический анализ фракций пептидов осуществлялся при помощи программы Xcalibur (Thermo Electron, Бремен, Германия) в 2-х стадийном режиме автоматического измерения спектров. В качестве подвижной фазы использовались - растворитель А: H2O-HCOOH (1000:1, по объему), растворитель В: CH3CN-HCOOH (1000:1, по объему). Выполнялась градиентная хроматография с линейным увеличением относительного содержания растворителя B в потоке от 5% до 50% за 90 минут, после каждого эксперимента система промывалась 95% ацетонитрилом в течение 15 минут, а затем 100% растворителем А еще 5 минут. Измерение масс-спектров продуктов хроматографического разделения производилось в диапазоне от 300 до 1600 m/z.

2.5.4 Биоинформационные методы

Список из точных масс пептидов и масс их фрагментов использовали для поиска и идентификации белков по базе данных IPI-human (международные индексы белков, International protein indices) (version 3.65; 86379 sequences; 34740770 residues) при помощи программы Mascot (Matrix Science, Лондон, Великобритания; version 2.0.04) [Perkins D.N., Pappin D.J., Creasy D.M., Cottrell J.S.,1999]. Идентификация в поисковой машине Mascot основана на алгоритме MOWSE. Первым этапом поиска является сравнение измеренных масс продуктов МС-МС пептидов для всех записей последовательностей в базе данных с теоретическими масс-спектрами фрагментации. В итоге по степени совпадения определяется MascotScore, являющийся индексом достоверности того, что детектируемым пептидам соответствует определенный белок из конкретной базы данных. Score всех обнаруженных пептидов (конкретного белка) суммируется, откуда вычисляется суммарный Score для белка. Основные параметры для Mascot поиска были следующие:

1) enzyme - trypsin;

2) peptidtolerance ±5 ppm;

3) MS/MS (fragments) toltrance ±0,5 Дa.

В списке белков, полученном в результате Mascot-поиска, достоверными считались только те белки, для которых были идентифицированы 2 и более триптических пептида с рейтингом (Score) более 24. Для автоматического отбора и сравнительного анализа белков, результаты Mascot-поиска обрабатывали с помощью специальной программы, разработанной в лаборатории профессора Е.Н. Николаева [Агрон И.А. с соавт., 2010].

Для определения места образования, функции выявленных белков, а также для анализа биологических процессов, в которых в организме участвуют обнаруженные в моче белки, использовались биоинформационные ресурсы. Соответствие идентификаторов IPI и Swiss Prot определялось по базе данных UniProtKB [Magrane M., Consortium U., 2011]. Для анализа тканеспецифичности экспрессии и преимущественной тканевой локализации белков, выявленных в моче, использовались базы данных TiGER [Liu X. et al., 2008], The Human Protein Atlas [Uhlen M. et al., 2010], PaxDB [Wang M. et al., 2012], UniProtKB [Magrane M., Consortium U., 2011], DAVID [Huang D.W., Sherman B.T., Lempicki R.A., 2009]. Для определения молекулярных функций (MF) и биологических процессов (BP) Gene Ontology использовалась база данных UniProt-GOA (file: gene_association.goa_human, Submission Date: 5/13/2013) [Dimmer E.C. et al., 2012]. Оценка представленности тканей проводилась с помощью программы DAVID [Huang D.W., Sherman B.T., Lempicki R.A., 2009], в которой использовались метод EASEscore с поправкой Benjamini на множественное сравнение и база UPtissue. Для оценки сверхпредставленности MF и BP, связанных с выявленными белками, использовался Hypergeometrictest (Fisher'sexacttest) с поправкой на множественное сравнение Benjamini-Hochberg. Расчеты проводились с помощью программы BiNGO [Maere S., Heymans K., Kuiper M., 2005]. Построение ассоциативных генных сетей между белками осуществлялось с помощью ANDSystem [Demenkov P.S., Ivanisenko T.V., Kolchanov N.A., Ivanisenko V.A., 2011].

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Исследование протеома мочи здоровых добровольцев. Возрастные изменения

Объектом исследования послужили образцы мочи, полученные от пятидесяти двух здоровых мужчин в возрасте от 19 до 54 лет. Во время обследования рацион питания и водопотребления не контролировались, как и физические нагрузки, которые оставались на привычном уровне. В результате хромато-масс-спектрометрического анализа всех образцов мочи было идентифицировано 259 различных белков (по номенклатуре UniProtKB). Так как белки экспрессируются в различных тканях, из которых они попадают в кровь, и затем - в мочу, необходимо было определить тканевую принадлежность этого набора белков. Из базы данных TiGER были извлечены данные о соответствии между регистрируемыми белками и тканями, на основании содержащейся в данной базе информации о тканеспецифической экспрессии генов для различных тканей человека. Анализ данных показал, что из общего числа идентифицированных белков в настоящее время тканевая принадлежность известна для 141 (табл. 5).

Таблица 5.Тканевая представленность белков по базе данных TiGER.

Ткань	Число белков
мочевой пузырь	3
кровь	13
кости	9
костный мозг	8
толстая кишка	4
глаза	4
сердце	8
почки	17
гортань	11
печень	32
легкие	1
мышцы	7
поджелудочная железа	9
периферическая нервная система	1
простата	13
кожа	10
тонкая кишка	1
мягкие ткани	10
селезенка	8
желудок	6
гонады	8
тимус	1
язык	7

Оказалось, что белки, присутствующие в моче, представляют почти все ткани. Наибольшая их часть экспрессируется в печени (32), почках (17), клетками крови (13), простате (13), наименьшее - по 1 белку - в легких, периферической нервной системе, тонкой кишке и тимусе.

Известно, что белки участвуют в биологических процессах, для идентифицированных в данной работе белков, с помощью базы Gene Ontology, были определены 715 процессов, которые были сгруппированы в 15 групп (табл. 6).

Таблица 6. Группы биологических процессов, выявленные с помощью

программы Gene Ontology.

Группы процессов	Число белков
Регуляция на организменном уровне	68
Развитие и рост организма	10
Развитие и рост органов и тканей	51
Иммунная система	96
Внутриклеточные процессы	139
Рост и развитие клеток	18
Регуляция внеклеточного матрикса	6
Клеточная подвижность	28
Клеточная адгезия, взаимодействия	43
Регуляция ферментативной активности	29
Метаболизм и каскады, сигнальные пути молекул	117
Ответ на стимул	56
Передача и регуляция сигнала	26
Гемостаз	19
Участие в воспаление	9
	715

Наибольшее число процессов было отнесено к внутриклеточным (139), затем - к метаболизму и каскадам сигнальных путей (117). На третьем месте оказались процессы, связанные с функциями иммунной системы (96); наименьшее число процессов - 6 - относилось к регуляции внеклеточного матрикса. Таким образом, выявленные белки оказались участниками множества процессов происходящих в различных клетках и тканях организма.

В связи с тем, что группу здоровых лиц составили добровольцы разного возраста, была предпринята попытка выявления возраст-зависимых изменений состава белков в моче. Известно, что анатомо-функциональное старение в самих почках отражается на составе белков, выводимых с мочой [Glassock R.J., Rule A.D., 2012], возрастное снижение веса почек начинается с 40-50 лет [Rao U.V., Wagner H.N.Jr., 1972].

Анализ наших данных свидетельствует о том, что с возрастом число различных белков в моче здорового человека слабо, но достоверно увеличивается (R = 0.566, p-value=1.24E-05) (график 1).

График 1. Зависимость количества белков от возраста испытуемых.

Очевидно, чтобы понять как масса выводимых белков должна меняться в процессе старения почки, была исследована зависимость между этими показателями. Как оказалось, с возрастом достоверно увеличивается средняя молекулярная масса белков (R=0.428558, p-value=0.00079) (график 2).

График 2. Зависимость средней молекулярной массы белков от возраста добровольцев.

По нашим данным, отмечается достоверная корреляция средней массы экскретируемых белков от возраста, т.е. не только число различных выводимых почкой белков зависит от возраста, но и их средняя масса. Чем старше человек (в отсутствии заболеваний почек), тем больше разнообразных белков выводятся почками и тем они в среднем тяжелее. Известно, что стареющая почка характеризуется развитием гиалиноза, уменьшением числа нефронов и интерстициальным фиброзом [Pannarale G. et al., 2010], с возрастом происходит увеличение числа склеротических клубочков. Исследование прижизненных биоптатов донорских почек подтвердило формирование гломерулосклероза на протяжении всей жизни [Rule A.D. et al., 2010]. При старении органа клубочки приобретают ишемический внешний вид, происходит утолщение базальной мембраны, интракапсулярный фиброз, отложение коллагена в боуменовой капсуле [Mancilla E. et al., 2008]. Отмечается тенденция снижения размеров почечных телец и сосудистых клубочков всех генераций нефронов после 60 лет, что связано со значительным снижением числа почечных телец в корковом и мозговом веществе почек [Тризно М.Н., Асфандияров Ф.Р., Кафаров Э.С., 2009]. По мере снижения числа функционирующих почечных клубочков оставшиеся подвергаются нагрузке в виде гиперфильтрации и гиперперфузии, что приводит к повреждению структуры и нарушению функций гломерул. Это отражается на скорости клубочковой фильтрации, которая с возрастом постепенно падает, с 20-25% от 40 до 80 лет [Zьrbig P. et al., 2009]. Увеличение с возрастом, как количества белков, так и их средней молекулярной массы свидетельствует о том, что описанные выше возрастные изменения в почках приводят к нарушению проницаемости гломерулярного фильтра, которые сопровождаются повышением его проницаемости для белков с большей молекулярной массой.

Мы полагали, что в числе выводимых белков возрастная зависимость не распределена равномерно, т.е. возможно, существует подгруппа белков, чье выведение преимущественно зависит от возраста обследуемых. Действительно, среди анализируемых белков были выделены 23 белка, которые достоверно чаще встречаются в моче с увеличением возраста обследуемых (p<0.05). Оказалось, только один белок - регулятор передачи сигналов через рецепторы, сопряженные с G-белком (RGSL1) достоверно исчезает с возрастом. Достоверность связи встречаемости белков и возраста испытуемых оценивалась с помощью t-критерия Стьюдента для коэффициента корреляции Пирсона (R package, функция cor.test) с поправкой Бенджамини-Хокберга на множественное сравнение (R package, функция p.adjust). Коэффициент корреляции рассчитывался по динамики появления/исчезновения белков (табл. 7).

Таблица 7. Белки, достоверно чаще встречающиеся в моче с увеличением возраста добровольцев (p<0.05).

Название белка	Название гена	Молекулярная масса, kDa	R	p-value
1	2	3	4	5
Галектин-3-связывающий белок	LGALS3BP	65,33	0,66	3,28E-05
Ингибитор плазменной протеазы серинового типа	SERPINA5	45,67	0,62	0,01
Фибронектин	FN1	262,62	0,61	0,01
Маннан-связывающая лектин сериновая протеаза 2	MASP2	75,7	0,55	0,01
Дезоксирибонуклеаза-1	DNASE1	31,43	0,54	0,01
АминопептидазаN	ANPEP	109,54	0,54	0,01
Кубилин	CUBN	398,74	0,53	0,01
Коллаген альфа-1(VI) цепь	COL6A1	108,53	0,50	0,01
Рецептор тирозин - киназного белка UFO	AXL	98,34	0,50	0,01
Рецептор липопротеина 2 низкой плотности	LRP2	521,96	0,50	0,01
Полимерный рецептор иммуноглобулина	PIGR	83,28	0,50	0,01
Эндосалин	CD248	80,86	0,49	0,01
ICOS лиганд	ICOSLG	33,35	0,49	0,01
Гелсолин	GSN	85,70	0,47	0,01
Глюстерин	CLU	52,50	0,46	0,01
Лизосомные альфа-глюкозидазы	GAA	105,32	0,45	0,01
Молекулы клеточной адгезии 4	CADM4	42,79	0,45	0,01
Рецептор G-белка семейства C	GPRC5C	48,19	0,44	0,02
Гомолог белка Roundabout 4	ROBO4	107,46	0,43	0,02
CMRF35-подобная молекуле 9	CD300LG	36,06	0,42	0,02
Не - рецепторный белок тирозин- фосфатазы	SIRPA	54,97	0,42	0,02
Поджелудочная альфа-амилаза	AMY2A	57,71	0,40	0,03
Инсулиноподобный фактор роста-связывающий белок 7	IGFBP7	29,13	0,39	0,05

Примечание: R - коэффициент корреляции Пирсона; corr p-value - p-value с поправкой Бенджамини Хокберга (Benjamini Hochberg) на множественность сравнения.

Молекулярная масса этих белков от 29,1 (у инсулиноподобного фактора роста - связывающего белка) до 521,958 (у рецептора липопротеина 2 низкой плотности). Т.е., с возрастом в мочу попадают не только легкие, но и тяжелые белки, что подтверждает наши предыдущие заключения.

Старение характеризуется общим снижением физиологических функций организма [Dinenno F.A., Kirby B.S., 2012; Zhou L.Y. et al., 2012]. Процесс старения органов различен, зависит от многих факторов, включая генетические, образ жизни, влияние окружающей среды, общих функциональных резервов организма [Пахарукова Н.А с соавт., 2009; Sahin E., DePinho R., 2010].

Среди идентифицированных белков, частота появления которых в моче увеличивается с возрастом (23), для 21 тканевая принадлежность известна согласно базе TIGER(табл. 8).

Таблица 8. Тканевая принадлежность значимо коррелирующих с возрастом белков мочи.

Ткани	Число белков
костный мозг	2
печень	2
поджелудочная железа	2
гонады	3
кость	3
мягкие ткани	2
толстая кишка	1
тонкая кишка	1
почки	2
селезенка	2
гортань	1

Целью анализа данных на последующем этапе служила необходимость выяснения того, в каких процессах участвуют достоверно чаще встречающиеся в моче белки с возрастом. Для этого для 23 белков, (Таблица 7), с помощью программы BiNGO было выявлено 30 сверхпредставленных процесса, которые были объединены в 9 групп (табл. 9).

Таблица 9. Значимо коррелирующие с возрастом сверхпредставленные процессы, полученные с помощью программы BINGO.

Группы процессов	Количество процессов
Клеточная адгезия и взаимодействия	4
Метаболизм и каскады, сигнальные пути молекул	4
Регуляция на организменном уровне	7
Гемостаз	5
Внутриклеточные процессы	5
Развитие и рост органов и тканей	1
Иммунная система	2
Развитие и рост организма	1
Ответ на стимул	1
	30

Среди значимо коррелирующих с возрастом сверхпредставленных процессов, полученных с помощью программы BiNGO можно отметить процессы, связанные с адгезией, с работой иммунной системы, метаболизмом углеводов, обменом витамина D, регуляцией апоптоза дендритных клеток, гемостазом и другие.

Таким образом, с помощью высокотехнологичных протеомных методов, на основе хромато-масс-спектрометрии, в образцах мочи, полученных от пятидесяти двух здоровых мужчин, в возрасте от 19 до 54 лет, было выявлено 259 различных белков. Для 141 из них определена тканевая принадлежность и выявлены 715 процессов, в которых они участвуют. Отмечена достоверная положительная корреляция средней степени выраженности числа (R = 0.566, p-value=1.24E-05) и массы белков (R=0.428558, p-value=0.00079) с возрастом. Определены 23 белка, достоверно чаще встречающиеся в моче с увеличением возраста обследуемых (p<0.05) и только один белок - RGSL1- регулятор передачи сигналов через рецепторы, сопряженные с G-белком (МВ 125,69) - реже. Продуцентами значимо связанных с возрастом обследуемых белков мочи, по базе TiGER, оказались 11 тканей организма. Среди значимо коррелирующих с возрастом сверхпредставленных процессов можно отметить процессы, связанные с адгезией, с функциями иммунной системы, метаболизмом углеводов, обменом витамина D, регуляцией апоптоза дендритных клеток, гемостазом и другие.

3.2 Постоянно присутствующие белки в моче здоровых людей

Достоверные источники для оценки вариабельности содержания тех или иных белков в моче у здоровых лиц малочисленны [Sun W. et al., 2009; Liu X. et al., 2012]. Используя преимущество контролируемых условий комплексного эксперимента с длительной изоляцией (520 суток), было проведено исследование протеомного состава мочи 6 здоровых добровольцев. Одним из условий их жизнедеятельности был контролируемый, но периодически изменяющийся режим потребления соли (табл. 2). Проведение балансовых исследований на протяжении первой половины эксперимента требовало от испытателей полного потребления всех продуктов рациона питания, а также учета потребления жидкости. С 252 суток и до конца восстановительного периода режим солепотребления был произвольным. Pационы по содержанию необходимых организму человека пищевых веществ соответствовали принятым физиологическим нормам для контингентов, чья профессиональная деятельность по энерготратам относится к категории средней тяжести. Пищевой состав рационов отвечал рекомендациям ВОЗ, а также был согласован с российско-американскими нормами по пищевому составу рационов питания для экипажей Международной Космической Станции [Агуреев А.Н., Сидоренко Л.А., 2012].

Результаты хромато-масс-спектрометрического анализа всех образцов, полученных в ходе 520 суточной изоляции, были представлены отчётами по идентификации IPI индексов белков в базе данных Mascot [Perkins D.N., Pappin D.J., Creasy D.M., Cottrell J.S., 1999]. В образцах мочи 6 испытателей было достоверно обнаружено 256 различных белков. Белковый состав мочи на протяжении времени наблюдения сильно варьировал. Постоянными белками, в течение 520 суток оставались семь белков: эпидермальный фактор роста, полимерный рецептор иммуноглобулина, ингибитор сериновых протеаз плазмы, белок AMBP, кератин, тип II цитоскелета 1, коллаген альфа-1 (VI) цепи, сывороточный альбумин [Пастушкова Л.Х. с соавт. 2014].

Согласно базам данных TiGER [Liu X. et al., 2008], The Human Protein Atlas [Uhlen M. et al., 2010], PaxDB [Wang M. et al., 2012], Uniprot KB [Magrane M., Consortium U., 2011] постоянные белки распределены по более, чем 20 тканям. Наибольшим количеством белков оказались представлены печень, плазма и моча (все 7 белков). Следующими тканями по представленности являются кожа и тромбоциты (6 белков). Статистический анализ сверхпредставленности тканей с использованием программы DAVID [Huang D.W., Sherman B.T., Lempicki R.A., 2009] показал, что печень является наиболее статистически значимо представленным органом. Согласно этой программе, 5 из 7 постоянных белков могут экспрессироваться в печени, и попадать в мочу из крови (табл. 10).

Таблица 10. Сверхпредставленные ткани базы данных UP tissue (DAVID) в списке постоянных белков.

Ткань	Число постоянных белков в ткани	Корреляция p-value (Benjamini)
Печень	AMBP белок, ингибитор сериновых протеаз плазмы, альбумин, коллаген альфа-1 (VI) цепи, полимерный рецептор иммуноглобулина	0,023
Плазма	AMBP белок, ингибитор сериновых протеаз плазмы, полимерный рецептор иммуноглобулина	0,028

Вторым статистически значимо представленным источником постоянных белков оказалась плазма крови. Плазма была представлена 3-мя белками, которые также распределены и в печени (табл. 10).

Одним из белков, значимо представленных как в печени, так и плазме является AMBP. Это белок-предшественник б1-микроглобулина (А1М) и бикунина, двух гликопротеинов плазмы [Tyagi S., Salier J-P., Lal S.K., 2002]. А1М - это гликопротеин, имеющий массу 26 кДа, белок, обнаруживаемый у млекопитающих, птиц, рыб и амфибий, широко распространен в различных физиологических жидкостях, включая плазму, мочу и спинномозговую жидкость [Zhang J-Y., Chen Z-W., Yao H., 2012]. Часть белков А1М плазмы существует в свободной форме, часть - образует комплексы с иммуноглобулином А, у человека - с протромбином и альбумином [Berggеrd T. et al., 1997]. Белок участвует в регуляции роста клетки, метаболизме и иммунном ответе, в связывании и катаболизме гема [Allhorn M. et al., 2002]. Полагают, что А1М защищает ткани от разрушительного действия гема при внутрисосудистом гемолизе [Allhorn M. et al., 2002]. Показано, A1M имеет иммуносупрессивные свойства, является ингибитором миоксалата кальция [Igci M. et al., 2010].

Постоянным белком мочи, который связан со сверхпредставленностью печени и плазмы крови согласно DAVID, является и ингибитор сериновой протеазы плазмы (PCI), или ингибитор С-белка. Это гликопротеин массой 57 кДа, состоящий из 387 аминокислотных остатков [Suzuki K. et al., 1987], принадлежит суперсемейству серпинов (ингибиторов сериновой протеазы). Наиболее богатым источником белковых ингибиторов сериновых протеаз является плазма крови. мРНК этого белка встречается во многих тканях и клетках: в печени, сперматозоидах, в мужских и женских репродуктивных органах, клетках почечных канальцев, кератиноцитах эпидермиса, тромбоцитах, тучных клетках, макрофагах и мегакариоцитах [Hayashi T., Su T-P., 2004; Prohaska T.A., Wahlmьller F.C., Furtmьller M., Geiger M., 2012]. PCI обладает кровоостанавливающим эффектом, действует как прокоагулянт и провоспалительный фактор, ингибируя активированный С-белок и комплекс тромбин-тромбомодулин. В то же время может действовать как антикоагулянт, инактивируя такие факторы свертывания, как тромбин, фактор Xa, фактор XI, калликрены плазмы и фибринолитические ферменты [Rezaie A.R., Cooper S.T., Church F.C., Esmon C.T., 1995]. Данный белок в моче способствует угнетению активатора плазминогена u-PA и калликренов, обладает антимикробными эффектами [Malmstrцm E. et al., 2009]. PCI участвует в оплодотворении, модулируя активность акрозина, (сериновой протеазы сперматозоида) защищая окружающие ткани от разрушительного действия акрозина [Espaсa F. et al., 2007].

Cывороточный альбумин, связанный с перепредставленностью печени по тканеспецифичной экспрессии постоянных белков мочи, является основным транспортным белком плазмы крови, который выполняет транспортные функции для воды, ионов кальция, натрия, калия, жирных кислот, гормонов, билирубина и участвует в поддержании осмоляльности плазмы крови, является основным депо цинка (связывает до 85% всего количества цинка в плазме) [Lu J. et al., 2008]. Почки человека фильтруют около 3,3 грамм альбумина ежедневно [Tojo A., Kinugasa S., 2012]. Эффективный радиус альбумина около 36 Е, что позволяет ему достаточно свободно проходить через гломерулярную мембрану [Maack T. et al., 1979]. В норме в моче обнаруживается лишь незначительное количество белка (альбумина <5 мг/л). Известно, что альбумин реабсорбируется в проксимальных канальцах путём рецептор-опосредованного эндоцитоза, осуществляется с помощью мегалина, дисфункция которого отражается на реабсорбции альбумина [Tojo A., Kinugasa S., 2012]. Альбумин человека является многофункциональным белком, обладающим защитными свойствами, защищает клетки от апоптоза при хронической лимфоцитарной лейкемии [Chuang Y.C. et al., 1992]. Оказывает защитные эффекты благодаря антиоксидантным и антиапоптотическим механизмам, противодействуя эндогенным и экзогенным источникам окислительного стресса [Erridge C. et al., 2004]. Введение средних и высоких доз альбумина человеку внутривенно ослабляет повреждение тканей головного мозга при ишемическом инсульте, при черепно-мозговой травме [Chatzidaki-Livanis M. et al., 2006]. Отмечена положительная корреляция между синтезом альбумина и объемом плазмы крови и концентрацией фибриногена [Rubenstein D.A., Yin W., 2009]. Альбуминурия является важным маркером риска сердечно-сосудистых и почечных заболеваний [Kuritzky L., Toto R., Van Buren P., 2011], оказывает влияние на тромбоциты и субэндотелиальные ткани, участвует в процессе гемостаза [Rubenstein D.A., Yin W., 2009].

Последним среди идентифицированных в эксперименте постоянных белков мочи, связанных одновременно со сверхпредставленностью печени и плазмы, является полимерный рецептор иммуноглобулина (PIGR). Это один из наиболее известных белков, циркулирующих в крови, который связывает иммуноглобулины классов А и М на базолатеральной поверхности эпителиальных клеток [Ohlmeier S. et al., 2012]. Белок участвует в структурно-функциональном синергизме между В-клеточной системой иммунитета и секреторным эпителием, обеспечивая антиген-независимый транспорт иммуноглобулинов из кровотока [Emmerson C.D. et al., 2011]. мРНК полимерного рецептора иммуноглобулина обнаружена в печени, кишечнике, желудке, легких, а также в клетках эпителия дистальных канальцев почек [Grцnwall C. et al., 2012], является постоянным компонентом протеома мочи здорового человека [Tan Y., Zhang J-J., Liu G. et al., 2009].

Среди белков, обеспечивающих, согласно DAVID, перепредставленность печени также является коллаген альфа-1 (VI). Этот белок является альфа-цепью коллагена VI, внеклеточного компонента, присутствует в соединительной ткани и хряще, где образует множество структурно-уникальных микрофибрилл вблизи базальной мембраны, взаимодействует с рядом молекул внеклеточного матрикса [Ishikawa H. et al., 2002]. Известно, что коллаген синтезируют и секретируют во внеклеточное пространство многие клетки, но в количественном отношении главными продуцентами коллагена являются фибробласты. Исследования показали, что коллаген VI соединяет базальную мембрану с перицеллюлярным матриксом в мышце [Ishikawa H. et al., 2004]. Другие данные говорят о роли коллагена VI в клеточной сигнализации и миграции клеток [Jimenez-Mallebrera C., Brown S.C., Sewry C.A., Muntoni F., 2005]. Три цепи коллагена VI: б1(VI), б2(VI) и 3(VI) образуют тройную цепь длиной 100 нм с глобулярными доменами на N- и С-конце, мутации в любой из них ведут к миопатии Бэтлема или более тяжелой врожденной мышечной дистрофии Ульриха [Lampe A.K., Bushby K.M.D., 2005].

Среди постоянных белков мочи кератин и эпидермальный фактор роста оказались не связанными со сверхпредставленными тканями, выявленными программой DAVID. Кератин, тип II цитоскелета 1 или цитокератин 1 принадлежит к семейству кератинов и является компонентом центрального протеома [Burkard T.R. et al., 2011]. Это основные структурные белки эпидермиса позвоночных, вместе с актиновыми филаментами и микротрубочками они образуют цитоскелет эпителиальных клеток позвоночных [Schweizer J. et al., 2006]. В настоящее время выявлено 20 типов цитокератинов - CK1-CK20. Спектр цитокератинов в эпителиальных клетках зависит от типа дифференцировки, положения клетки в эпителиальном пласте, в клетках однослойного эпителия экспрессируется CK8 и CK18. Присутствие цитокератинов в клетке является признаком, который может быть использован для идентификации эпителия: каждому виду эпителиальных клеток с определенной функцией и локализацией соответствует характерный набор цитокератиновых полипептидов [Бабиченко И.И., Ковязин В.А., 2008]. Окислительный стресс увеличивает экспрессию кератина 1 эндотелия и активирует лектиновый путь активации компемента (LCP) посредством присоединения маннозо-связывающего лектина (МBL) к цитокератину 1 [Lei T., Zhao X., Jin S. et al., 2013]. Lei с соавт., в протеоме мочи здоровых лиц с помощью 2-DE гель-электрофореза, в сочетании с время-пролетной масс-спектрометрией, обнаружили 14 белков, в том числе ALB, белок AMBP, кератин типа II цитоскелета 1 [Lei T. et al., 2013].

Одним из самых часто встречаемых белков в протеоме мочи является эпидермальный фактор роста (EGF) [Nagaraj N., Mann M., 2011], играет важнейшую роль в регуляции жизнедеятельности клетки, регуляции транспорта ионов, восстановительных, обменных процессов в тканях организма [Glogowska A. et al., 2012]. Дистальные канальцы почки, синтезируют препро-EGF, EGF-продуцирующие клетки локализованы в толстой части восходящего колена и дистальных извитых канальцев почки мышей и крыс, и, вероятно, у человека [Nouwen E.J. et al., 1994]. Была предложена экскреция с мочой эпидермального фактора роста и белка Тамма-Хорсфалла в качестве потенциального маркера функции дистального канальца нефрона [Thulesen J. et al., 1997]. Рецепторы этого белка поддерживают баланс между активностью клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза, участвуют в регуляции клеточного роста и миграции клеток [Al Moustafa A-E., Achkhar A., Yasmeen A., 2012], играют важную роль в регуляции почечной гемодинамики и транспорта ионов [Pyl'nik T.O. et al., 2012]. EGF стимулирует реабсорбцию Mg2+ в дистальных извитых канальцах нефрона, посредством EGF-рецептора и активации канала TRPM6 переходного рецепторного потенциал-зависимого канала, подсемейства B, расположенного в дистальных канальцах нефрона, который является основным местом активного трансцеллюлярного транспорта Са2+и Mg2 [Dimke H., Hoenderop J.G.J., Bindels R.J.M., 2011].

Наибольшей статистической значимостью, согласно программе Bingo, среди сверхпредставленных клеточных компонент GO оказались альфа гранулы тромбоцитов и внеклеточный регион и внеклеточное пространство (табл. 11). С процессом - альфа гранулы тромбоцитов оказались связанными три белка (ALB, SERPINA5, EGF). Внеклеточное регион был представлен шестью из семи постоянных белков за исключением KRT1. Четыре белка (AMBP, ALB, SERPINA5, EGF) были связаны с внеклеточным пространством. Из таблицы видно, что одной из характеристик постоянных белков может быть их внеклеточная локализация.

Таблица 11. Сверхпредставленные клеточные компоненты GO (Bingo)

для постоянных белков.

GO	Название генов	p-value	сorrected p-value
альфа гранулы тромбоцитов	ALB, SERPINA5, EGF	1,83E-07	1,66E-05
внеклеточный регион	AMBP, ALB, SERPINA5, OL6A1, PIGR, EGF	3,26E-06	1,05E-04
часть внеклеточного региона	AMBP, ALB, SERPINA5, OL6A1, EGF	3,48E-06	1,05E-04
внеклеточное пространство	AMBP, ALB, SERPINA5, EGF	2,65E-05	6,02E-04

Анализ сверхпредставленности биологических процессов и молекулярных функций GO позволил выявить 48 молекулярных функций (табл. 12).

Таблица 12. Сверхпредставленные молекулярных функций, по GO,

для постоянных белков (BiNGO, GOA).

GO	Название генов	p-valu	corrected p-value
1	2	3	4
связывание монокарбоновой кислоты	ALB, SERPINA5	3,85E-05	3,12E-03
связывание оксалата кальция	AMBP	1,62E-04	6,55E-03
связывание IgA	AMBP	3,24E-04	7,49E-03
активность ингибитора эндопептидазы серинового типа	AMBP, SERPINA5	4,63E-04	7,49E-03
связывание белка	AMBP, ALB, SERPINA5, KRT1, COL6A1, EGF	5,02E-04	7,49E-03
связывание акрозина	SERPINA5	6,47E-04	7,49E-03
активность активатора рецептора трансмембранного белка тирозинкиназы	EGF	6,47E-04	7,49E-03
связывание карбоновой кислоты	ALB, SERPINA5	8,18E-04	7,64E-03
активность эндопептидазного ингибитора	AMBP, SERPINA5	9,77E-04	7,64E-03
регулятор активности эндопептидазы	AMBP, SERPINA5	1,01E-03	7,64E-03
активности ингибитора пептидазы	AMBP, SERPINA5	1,06E-03	7,64E-03
активность ингибитора кальциевого канала	AMBP	1,13E-03	7,64E-03
связывание токсичного вещества	ALB	1,29E-03	7,82E-03
активность регулятора пептидазы	AMBP, SERPINA5	1,35E-03	7,82E-03
связывание фосфатидил холина	SERPINA5	1,46E-03	7,86E-03
активность активатора белка тирозинкиназы	EGF	2,10E-03	1,06E-02
связывание тромбоцитарного фактора роста	COL6A1	2,26E-03	1,08E-02
активность регулятора ферментативной деятельности	AMBP, SERPINA5, EGF	2,68E-03	1,17E-02
связывание ретиноевой кислоты	SERPINA5	2,75E-03	1,17E-02
связывание иммуноглобулина	AMBP	3,07E-03	1,19E-02
активность ингибитора фермента	AMBP, SERPINA5	3,09E-03	1,19E-02
активность ингибитора ионного канала	AMBP	4,20E-03	1,47E-02
активность ингибитора канала	AMBP	4,20E-03	1,47E-02
связывание четвертичной группы аммония	SERPINA5	4,36E-03	1,47E-02
связывание рецептора эпидермального фактора роста	EGF	4,52E-03	1,47E-02
активность активатора рецептора	EGF	5,17E-03	1,61E-02
связывание жирных кислот	ALB	5,49E-03	1,61E-02
связывание ретиноида	SERPINA5	5,97E-03	1,61E-02
активность регулятора кальциевого канала	AMBP	5,97E-03	1,61E-02
связывание изопреноида	SERPINA5	5,97E-03	1,61E-02
активность регулятора рецептора	EGF	7,10E-03	1,86E-02
активность активатора протеинкиназы	EGF	9,51E-03	2,34E-02
связывание клеточной поверхности	ALB	9,67E-03	2,34E-02
связывание шаперона	ALB	9,83E-03	2,34E-02
активность активатора киназы	EGF	1,13E-02	2,61E-02
связывание протеазы	SERPINA5	1,35E-02	3,04E-02
связывание алкоголя	SERPINA5	1,51E-02	3,31E-02
связывание лекарства	ALB	1,61E-02	3,43E-02
связывание ионов меди	ALB	1,85E-02	3,84E-02
активность регулятора канала

Подобные документы

• Адаптация человека в условиях авиакосмических полетов

  Оценка состояния естественных приспособительных и защитных механизмов, составляющих биологическое наследство людей, его значение в процессе экологической адаптации человека. Классификация факторов космического полета и его влияние на организм человека.
  
  реферат [483,0 K], добавлен 19.03.2012
  

• Гигиена питания лиц пожилого возраста

  Рассмотрение возрастных изменений в организме человека. Булимия или патологическое усиление чувства голода. Принципы рационального питания пожилых людей. Оптимальное обеспечение организма нутриентами, стимулирующими активность ферментных систем.
  
  презентация [730,5 K], добавлен 17.10.2014
  

• Физиология старения

  Возрастная периодизация функционирования организма человека. Общая характеристика процесса старения и его влияние на нейроэндокринные механизмы регуляции в гипоталамусе. Рассмотрение типических возрастных изменений клеток: внутриклеточных и адаптивных.
  
  презентация [107,7 K], добавлен 29.08.2013
  

• Периоды детского возраста и их характеристика. Новорожденный и уход за ним, переходные состояния новорожденного

  Изучение особенностей детского организма, классификация периодов жизни ребенка в зависимости от закономерных изменений в его организме. Основные нормы и правила ухода за новорожденным, характеристика физиологических переходных состояний его организма.
  
  реферат [29,1 K], добавлен 23.06.2010
  

• Искусство быть здоровым

  Общая характеристика основных составляющих здорового способа жизни. Сущность и способы преодоления стресса. Особенности профилактики нормального физического состояния человека. Закаливание организма как один из основных факторов физического здоровья.
  
  реферат [18,2 K], добавлен 07.10.2010
  

• Создание прибора для исследования биомеханики дыхания в условиях космического полета

  Методы измерения объемно-скоростных показателей функции легких. Определение параметров механики дыхания методом вынужденных колебаний. Программное обеспечение и обработка сигналов прибора. Режимы измерений и вычисления параметров механики дыхания.
  
  реферат [470,1 K], добавлен 10.12.2009
  

• Погода и самочувствие человека

  Изменения погоды не одинаково сказываются на самочувствии разных людей. У здорового человека при изменении погоды происходит своевременное подстраивание физиологических процессов в организме к изменившимся условиям окружающей среды.
  
  доклад [9,9 K], добавлен 12.10.2004
  

• Климатотерапия в современной реабилитации

  Медицинская климатология: определение и задачи. Классификация климатологических факторов. Характеристика метеорологических космических, радиационных и земных факторов. Физиологические механизмы влияния климато-погодных факторов на организм человека.
  
  реферат [49,6 K], добавлен 06.10.2014
  

• Иммунная система человека

  Состояние иммунной системы человека в норме и при различных патологиях, а также анализ основных факторов, влияющих на нее. Особенности формирования и состояние иммунной системы на примере патологии вирусных гепатитов В, С. Программа и итоги исследований.
  
  курсовая работа [55,7 K], добавлен 20.12.2015
  

• Воздействие физических факторов на организм человека

  Классификация и гигиеническая характеристика физических факторов воздушной среды. Влияние комплекса метеорологических факторов на организм человека. Принципы гигиенического нормирования и оценка микроклимата помещений. Анализ степени ионизации воздуха.
  
  реферат [27,4 K], добавлен 25.12.2010
  

• Патогенез изменений в организме под влиянием галлюциногенов, кокаина и марихуаны

  Общая характеристика галлюциногенов (психоделиков), механизмы их химического действия. Физические симптомы, проявляемые при приеме LSD. Самый популярный способ употребления марихуаны. Результат прямого воздействия тетрагидроканнабинола на мозг человека.
  
  реферат [26,1 K], добавлен 28.10.2015
  

• Методы профилактики и лечения остеохондроза

  Причины и механизмы развития остеохондроза позвоночника. Характеристика изменений, происходящих в позвоночнике и в организме в целом при остеохондрозе. Комплекс мероприятий, направленных на восстановление утраченных возможностей организма при заболевании.
  
  реферат [31,8 K], добавлен 07.12.2013
  

• Половая система человека, ее анатомо-физиологические и возрастные особенности

  Морфофункциональные особенности организации мужской и женской половой системы. Основные гигиенические процедуры по уходу за половой системой человека, особенности ее возрастных изменений. Этапы полового созревания детей и их краткая характеристика.
  
  реферат [31,1 K], добавлен 09.03.2013
  

• Голодание человека

  Общие понятия о голодании. Процессы, происходящие во время голодания в организме человека в полевой форме жизни и в физическом теле человека. Голод и умственные способности человека. Субкалорийное питание. Правила здорового диетического питания.
  
  реферат [34,5 K], добавлен 10.12.2012
  

• Средства курортного лечения, характеристика аэро- и спелеотерапии

  Сущность и виды аэротерапии. Фазы адаптации организма при действии воздушных ванн. Требования к климатолечебным сооружениям. Спелеотерапия, характеристика микроклимата карстовых пещер и соляных шахт, физиологические механизмы влияния на организм.
  
  реферат [35,8 K], добавлен 19.11.2014
  

• Атмосферное давление и здоровье

  Обобщение основных атмосферных факторов, которые влияют на организм человека. Понятие атмосферного давления и особенностей его влияния на здоровье человека. Патологические явления, развивающиеся в организме при попадании в атмосферу пониженного давления.
  
  реферат [658,7 K], добавлен 03.06.2013
  

• Характеристика основных теорий геронтологии

  Теория соматических мутаций в геноме клеток, которые приводят к старению организма. Особенности свободнорадикальной и митохондриальной теория старения. Сущность теломерной теории. Установление роли возрастных изменений, возникающих в гомеостатах.
  
  реферат [30,5 K], добавлен 10.02.2011
  

• Физиологические изменения показателей периферической крови человека, после физической нагрузки

  Проведение исследований физиологических функций организма: дыхания, кровообращения, обмена веществ. Методы индексов оценки физического развития человека. Изучение строения его тела. Характеристика уровня обменных процессов, снабжения организма кислородом.
  
  отчет по практике [31,7 K], добавлен 27.05.2014
  

• Оценка продолжительности воздействия фактора риска на человека

  Оценка риска для здоровья человека. Характеристика вредных эффектов, способных развиться в результате воздействия факторов окружающей среды на группу людей. Передача информации о риске. Анализ продолжительности воздействия факторов риска на человека.
  
  презентация [211,5 K], добавлен 01.10.2014
  

• Общее и специфическое в действии вредных веществ

  Исследование путей проникновения вредных веществ в организм человека. Химические вещества, влияющие на репродуктивную функцию человека. Патологические изменения внутренних органов. Возникновение острых и хронических отравлений токсическими веществами.
  
  контрольная работа [114,2 K], добавлен 23.01.2015
  

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам