Протеомный профиль мочи здорового человека в норме и при действии факторов космического полета

Процессы, которые участвуют в создании белковой композиции крови.

Секреция белков в кровь после их синтеза в тканях

По своему происхождению белки плазмы крови разделяют на: белки, секретируемые тканями и функционирующие в плазме с молекулярным весом (МВ) >45 kDa; антитела, как уникальный класс функционирующих в плазме белков (более 10 млн. разновидностей); дистанционные рецепторные лиганды (классические пептиды и гормоны), имеющие различный МВ и появляющиеся в различные периоды времени для реализации своих функций; локальные рецепторные лиганды (цитокины и другие медиаторы клеточного ответа); временно присутствующие в плазме негормональные белки, «адресованные» определенным структурам (например, лизосомальные белки); белки-продукты повреждения тканей, появляющиеся вследствие гибели или повреждения клеток (например, сердечные тропонины, миоглобин, креатин-киназы); аберрантные белки, высвобождающиеся из опухолевых тканей; инородные белки бактерий или паразитов.

В печени, как наиболее важном органе в белковом обмене, образуется 15-50 г белка в сутки и происходят следующие процессы: дезаминирование аминокислот (дезаминирование осуществляется и в других тканях организма, особенно в почках, но по значимости эти процессы несопоставимы с дезаминированием аминокислот в печени); образование мочевины и извлечение аммиака из жидких сред организма; взаимное превращение различных аминокислот и синтез из аминокислот других соединений; образование белков плазмы крови [Kmieж Z., 2001]. В плазму крови из печени секретируются фибриноген и альбумины крови, большая часть б- и в-глобулинов и липопротеиды [Nakano M., Kubota M., Owada S., Nagai R., 2013]. В кровь из ретикулоэндотелиальной системы костного мозга и лимфатических узлов секретируются в-глобулины и г-глобулины [Laudisi F. et al., 2013], пептидные гормоны в основном секретируют клетки эндокринных желез [Arakelyan K.P. et al., 2007], однако эритропоэтин - клетки почки [Wang P. et al., 2013]. В плазме крови, при суммарной концентрации белка 60-80 г/л, содержится 7% общего количества белков организма [Северин Е.С., 2013], примерно 90% составляют альбумины, иммуноглобулины, липопротеины, фибриноген, трансферрин. По молекулярному весу белки плазмы крови различаются в широких пределах - их МВ колеблется от 44 000 до 1 300 000.

Белки плазмы крови выполняют множество функций: поддерживают коллоидно-осмотическое (онкотическое) давление и, тем самым, постоянный объем крови [Craft E.M., Powell L.L., 2012]; ряд белков, в том числе фибриноген, являются основными компонентами системы гемостаза [Anderson E.L. et al., 2013]; определяют вязкость крови и играют важную роль в поддержании гемодинамики в сердечно-сосудистой системе [Kwaan H.C., 2010]. Белки также принимают участие в поддержании постоянства рН крови, так как составляют одну из ее важнейших буферных систем [Leclercq L., Modena E., Vert M., 2013]. Они выполняют транспортную функцию [Sitar M.E., Aydin S., Cakatay U., 2013]; участвуют в процессах иммунитета [Hyvдrinen S. et al., 2014]. С белками плазмы связано 40-50% кальция, значительная часть железа, магния, меди и других элементов; кроме того, протеины являются резервом аминокислот.

Белковая композиция крови динамически подвижна, отражая изменения в функционировании систем и органов организма, что используется в клинической диагностике и терапевтическом мониторинге заболеваний [Anderson N.L., Anderson N.G., 2002]. Ни один из компонентов белковой композиции крови не является гомеостатической константой, уровень ни одного из белков крови (исключая гормоны пептидной природы) не подвержен жесткому контролю и регуляции, за исключением уровня альбумина, который наряду с другими небелковыми компонентами, является составляющей строгой гомеостатической константы - осмоляльности крови. Белки плазмы крови, печени и мышц могут служить в качестве «резервных», хотя эти резервы по своему существу отличаются от резервов углеводов (отложение гликогена в печени и мышцах) и липидов (отложение триацилглицеролов в жировых депо). Существование в организме механизма срочной мобилизации белковых ресурсов в экстремальных условиях (голодание, тяжелая интоксикация, потеря крови и другие), несомненно, и оно имеет важное физиологическое значение. Помимо «основных» белков, в крови содержится большинство белков человеческого организма - тканевые белки попадают в кровь в результате секреции, «подтекания» или разрушения клеток.

Апоптоз, другие виды разрушения клеток

Во всех многоклеточных организмах поддерживается баланс между пролиферацией и гибелью клеток. Существуют две формы клеточной гибели -- некроз и апоптоз. И если некроз является пассивным процессом массированного разрушения клеток в ответ на повреждающее действие какого-либо агента, то апоптоз - это активный, физиологический процесс, строго контролируемый организмом, являющийся обязательным компонентом жизнедеятельности многоклеточных организмов [Прохоренков В.И., Рукша Т.Г., Петрова Л.Л., Салмина А.Б., 2005]. Апоптоз может регулироваться как внешними факторами, так и автономными механизмами. Формирование механизма апоптотической гибели клеток является одним из самых ранних и фундаментальных достижений эволюции, результатом которой стало возможным появление всё более сложных многоклеточных организмов. Апоптоз, как генетически запрограммированное самоубийство клетки, играет ключевую роль в ряде процессов развития организма, его нормальной жизнедеятельности и регенерации тканей, поскольку позволяет организму использовать высвобождающиеся ресурсы в виде сложно организованных молекул и их комплексов. Для клетки, подвергающейся апоптозу, характерны такие морфологические изменения, как: конденсация хроматина, фрагментация и разрушение ядра; сжатие цитоскелета; набухание клеточной мембраны. В дальнейшем клетки фрагментируются, образуются «апоптозные тела». При этом возрастает внутриклеточная концентрация Са2+; активируются протеазы-каспазы; ДНК режется на фрагменты; клеточная поверхность меняется - теряется сиаловая кислота, связанная с гликопротеинами и гликолипидами, что вызывает быстрый фагоцитоз клетки макрофагами или соседними клетками [Северин Е.С., 2013]. Все цитозольные белки гибнущей клетки попадают во внеклеточную жидкость, пополняя собой, в том числе, и плазменный пул белков. Поэтому в протеоме крови обнаруживаются белки «внутреннего хозяйства» клеток, имеющие внутриклеточную функцию в качестве своего главного назначения.

Реабсорбция белков почками

Протеомика на основе масс-спектрометрии покончила с представлениями о том, что моча - безбелковая жидкость. Белки попадают в первичную мочу из крови. Считают, что протеомы мочи и крови на 70% состоят из одних и тех же протеинов [Nagaraj N., Mann M., 2011], но кроме белков крови в моче выявляются белки почечного происхождения.

На начальном этапе мочеобразования, низкомолекулярные компоненты плазмы крови, такие как электролиты, продукты обмена (креатинин), в2-микроглобулин, б1-микроглобулин и ретинол-связывающий белок (RBP) - фильтруются в клубочках нефрона [Vinge L. et al., 2010]. Фильтрация происходит через гломерулярный барьер, где из жидкой части крови образуется до 180 литров первичной мочи [Adachi J. et al., 2006; Eaton D.C., 2012]. Первичная моча, из-за селективности мембраны, содержит белки с низким молекулярным весом (<60 кДа), такие, как транспортные белки - витамин Д-связывающий белок, RBP. Белки группы альбумина частично фильтруются: коэффициент фильтрации альбумина составляет 0,00062, концентрация альбумина в ультрафильтрате колеблется от 1 до 50 мкг/мл [Amsellem S. et al., 2010]. Однако прохождение гломерулярного фильтра альбумином, имеющего при физиологических значениях рН отрицательный заряд и радиус молекулы 3,6 нм, затруднено главным образом из-за отрицательного заряда молекулы, а не из-за её размера. В норме, альбумин составляет около 25% от всех белков, экскретируемых почками. Это соотношение может меняться, в частности, в случае протеинурии. После прохождения через фильтр, такие высоко представленные белки сыворотки (находящиеся в сыворотке и плазме крови в высокой концентрации), как легкая цепь иммуноглобулина, трансферрин, витамин Д-связывающий белок, миоглобин и до 94% профильтровавшегося альбумина реабсорбируются, главным образом, в проксимальных почечных канальцах [Vinge L. et al., 2010]. В проксимальных сегментах нефрона происходит реабсорбция около 66% от всего объема гломерулярного фильтрата. Механизм реабсорбции в нефроне позволяет предотвратить потери белков орагнизмом. Существует теснейшая структурно-функциональная связь между реабсорбцией натрия, воды, хлоридов, фосфатов, бикарбоната и изменениях в различных звеньях процесса реабсорбции белка [Poupin N. et al., 2012]. За реабсорбцию белков из первичной мочи в проксимальных канальцах нефрона (ПК) ответственен рецептор-опосредованный эндоцитоз. Скорость эндоцитоза увеличивается пропорционально концентрации белка в клубочковом фильтрате до тех пор, пока не достигается максимальная скорость образования эндоцитозных пузырьков. Далее, в процессе реабсрбции образовавшиеся эндоцитозные вакуоли движутся в сторону базальной части клетки и сливаются с лизосомами. В эндолизосомальных пузырьках осуществляется протеолиз белков [Doherty G.J., Mc Mahon H.T., 2009]. При этом в кровь возвращается практически вся глюкоза, аминокислоты, витамины, значительное количество ионов [Haraldsson B., 2010]. Иной механизм обеспечивает реабсорбцию небольших линейных пептидов (таких, как ангиотензин II, брадикинин). Эти пептиды гидролизуются ферментами щёточной каёмки эпителия проксимального канальца, после чего аминокислоты транспортируются в клетку [Carone F.A., Peterson D.R., 1980]. У практически здорового человека, в обычных условиях жизнедеятельности, содержание белка в суточной моче не превышает 150 мг (что составляет уровень физиологической протеинурии). Экскреция белка в концентрации более 150 мг/день считается в клинике протеинурией и является показателем нарушением работы гломерулярного фильтра или процессов реабсорбции [Наточин Ю.В., 1993; Adachi J. et al., 2006].

Исследование белковой композиции биологических жидкостей человека до развития протеомики на основе масспектрометрии

Функциональное состояние гломерулярного барьера, канальцевого аппарата, особенности гемодинамики, концентрация и качественный состав белков плазмы, а также активность системы регуляции их транспорта в ПК определяют концентрацию белка в моче, его качественные характеристики. Нормальная концентрация белка в моче составляет до 150 мг/л, что примерно в 1000 раз меньше, чем в плазме [Наточин Ю.В., 1993]. Это свидетельствует о высокой эффективности гломерулярного фильтра, препятствующего потере белка из русла крови [Шейман Д.А., 2007]. Общий анализ белка в моче является одним из наиболее массовых клинико-диагностических исследований [Пупкова В.И., Прасолова Л.М., 2005]. Отмечают, что поскольку в моче присутствуют множество соединений, способных вмешиваться в ход химических реакций метода определения, а содержание белка в моче здорового человека достаточно низкое, сопоставимое с чувствительностью методов исследования, значения уровня белка в моче широко варьируют [Ларичева Е.С. с соавт. 2009]. Анализ мочи остается одной из тех лабораторных процедур, которые сложнее всего поддаются стандартизации, в виду возможных нарушений протоколов сбора, обработки и хранения образцов мочи [Козлов А.В., Ларичева Е.С., 2012]. Все методы определения белка в моче можно разделить на качественные, полуколичественные, количественные. Как показывают многочисленные исследования, ни один из большого числа известных методов качественного определения белка в моче не позволяет получать надежные и воспроизводимые результаты. О содержании белка в моче судят по интенсивности сине-зеленой окраски, развивающейся после контакта реакционной зоны с мочой. Результат оценивается визуально или с помощью анализаторов мочи. В последнее время приобрели популярность методы сухой химии, благодаря своей простоте, скорости выполнения анализа. Тем не менее, одним из недостатков этих методов, приводящих к искажению диагностической информации, является большая чувствительность индикатора бромфенолового синего к альбумину по сравнению с другими белками. Определение белка с помощью диагностических полосок не является надежным индикатором низких уровней протеинурии (большинство выпускаемых в настоящее время диагностических полосок не обладают способностью детектировать белок в моче в концентрации ниже, чем 0,15 г/л). Отрицательные результаты определения белка на полосках не исключают присутствия в моче глобулинов, гемоглобина, уромукоида, белка Бенс-Джонса. Ложноположительные результаты могут быть связаны с высокой концентрацией мочевины. Для количественного определения белка в моче в клинических лабораториях используют в основном два типа методов: турбидиметрические и колориметрические. Турбидиметрические методы основаны на преципитации белка различными химическими агентами: сульфосалициловой кислотой, трихлоруксусной кислотой, бензетоний хлоридом [Ким Ю.В., Шибанов А.Н., 2005]. Турбидиметрические методы плохо поддаются стандартизации [Dilena B.A., Penberthy L.A., Fraser C.G., 1983], что приводит к получению ложных результатов, однако, в настоящее время эти методы широко используются в лабораториях из-за невысокой стоимости и доступности реактивов [Пупкова В.И., Прасолова Л.М., 2007]. К группе колориметрических методов определения белка относятся методы Лоури, биуретовый и методы, основанные на связывании белка с органическими красителями. Метод Лоури обладает высокой чувствительностью: ~10 мг/л и широкой линейной областью измерения - до 1 г/л. Однако результаты анализа значительно зависят от аминокислотного состава белка - интенсивность окрашивания различных белков может различаться в 300 и более раз [Пупкова В.И., Прасолова Л.М., 2005]. Некоторые лекарственные препараты - салицилаты, хлорпромазин, тетрациклины способны оказывать влияние на результаты исследования, полученные данным методом. Биуретовый метод практически не зависит от аминокислотного состава белков, это реакция на пептидные связи белка: для протекания реакции достаточно наличие двух пептидных связей в молекуле исследуемого вещества, т. е. в реакцию могут вступать низкомолекулярные белки и пептиды, начиная с трипептидов. Этот метод высокоспецифичен, поскольку в реакции не участвуют присутствующие в пробе соединения небелковой природы [Пупкова В.И., Прасолова Л.М., 2005; Marshall T., Williams K.M., 2000]. Область линейной зависимости оптической плотности от содержания белка примерно в 10 раз шире, чем у метода Лоури, однако чувствительность - примерно в 10 раз ниже, что непригодно для определения минимальных количеств белка в моче здорового человека. В связи с этим, она чаще всего используется для количественного определения белка после его осаждения [Ларичева Е.С. с соавт. 2009]. Методы, основанные на связывании белка с органическими красителями, привлекают к себе внимание благодаря простоте, быстроте исполнения и высокой чувствительности [Dilena B.A., Penberthy L.A., Fraser C.G., 1983; Ramakers J.M., 1984]. Однако они также имеют некоторые недостатки, одним из которых является различие в способности белков связывать те или иные красители [Пупкова В.И., Прасолова Л.М., 2005], другим - нарушение линейной зависимости между концентрацией некоторых белков и оптической плотностью комплекса белок-краситель [Шишкин С.С., 1982; Загребельный С.H., Пупкова В.И., 1983]. Наиболее широко используемыми красителями в лабораторной практике определения белка являются кумасси бриллиантовый голубой, бромфеноловый синий и пирогаллоловый красный. Так, краситель кумасси бриллиантовый синий способен связываться с положительно заряженными аминогруппами аминокислот, входящими в состав белковой молекулы, с образованием комплекса с максимумом поглощения при 595 нм. При этом комплекс белок-краситель обладает интенсивным поглощением, что обеспечивает высокую чувствительность методу и требует для исследования небольшого объема образца [Ларичева Е.С. с соавт., 2009; Ramakers J.M., 1984]. Различные белки обладают неодинаковой способностью связывать данный краситель, так, если поглощение комплекса кумасси бриллиантовый синий - альбумин принять за 100%, то для гемоглобина и трансферрина оно оказывается таким же, однако оптическая плотность комплекса с глобулинами, а также свободными к- и л-цепями иммуноглобулинов составляет всего лишь около 60% [Ramakers J.M., 1984]. Частично эти недостатки устраняются с помощью некоторых модификаций метода [Marshall T., Williams K.M., 2000]. Краситель бромфеноловый синий связывается преимущественно с альбумином, а не глобулинами и другими белками, поэтому определение белка в моче, содержащей сложную смесь белков, данным методом не обеспечивает необходимую точность анализа [Пупкова В.И., Прасолова Л.М., 2005; Ларичева с соавт., 2009]. Fujita с соавт., в 1983 году предложили использовать для определения белка в моче органический краситель - пирогаллоловый красный [Fujita Y., Mori I., Kitano S., 1983]. Широкое применение в лабораторной практике данный метод получил после его модификации Watanabe с соавт. [Watanabe N. et al., 1986]. Методика основана на связывании белка с красителем в кислой среде (рН ~2,5); на результаты определения не влияет присутствие в моче многих соединений, в том числе, лекарственных препаратов и их метаболитов, солей, оснований, кислот. Предложенная модификация позволила расширить линейную область измерения до 2 г/л, при этом надежность и воспроизводимость модифицированного метода соответствуют клиническим требованиям. «Тест на открытие» в этом методе при определении альбумина дает показатели 97-102%, глобулина - 69-72%; чувствительность метода составляет 30-40 мг/л. Вещества, присутствующие в моче, дают суммарную ошибку определения менее 2%. Данный метод является лучшим среди других колориметрических методов, он прост и удобен для ручного исполнения в клинических лабораториях и адаптации на автоматических анализаторах [Ларичева Е.С. с соавт., 2009; Marshall T., Williams K.M., 2004]. Результаты количественного определения содержания белка во фракционной моче зависят от ее объема и степени разведения, могут не совпадать с таковыми при исследовании суточной мочи. Полагают, что нормализация результата определения уровня белка на показатель осмолярности мочи (отношение белок/осмолярность), либо пересчет на содержание креатинина (отношение белок/креатинин), позволяет приблизить результаты определения белка в случайной пробе мочи к результатам определения белка в суточном диурезе [Пупкова В.И., Прасолова Л.М., 2005].

Следует отметить, что все вышеперечисленные стандартные лабораторные методы используются для определения суммарного уровня белка в моче, без возможности исследовать белковую композицию образца. Долгое время единственным методом анализа сложных белковых смесей, таких как плазма крови, оставался электрофорез. Использование высокоразрешающего метода двумерного электрофореза (2-DE) позволило впервые составить карту белков плазмы крови [Anderson L., Anderson N.G., 1977], на которой детектировали примерно 300 пятен, из которых исследователи смогли идентифицировать 40 белков. Более полная протеомная карта плазмы крови была получена в 1991 году, на которой было выделено 727 пятен, 376 из которых были идентифицированы как 49 различных белков [Anderson N.L., Anderson N.G., 1991]. Хотя метод 2-DE является одним из самых известных и распространенных методов анализа биологических жидкостей и имеет ряд преимуществ перед другими технологическими платформами, опубликовано не так много работ по его применению в исследовательских целях, такие как поиск биомаркеров заболеваний в плазме (сыворотке) крови [Трифонова О.П., 2011]. По мнению Воронцова с соавт., наиболее точным и чувствительным методом, позволяющим обнаружить скрытые изменения функции различных участков нефрона, является метод уропротеинограммы [Воронцов А.Л., Нестеровская А.Ю., Потапова Л.А., 2005]. Основанный на электрофоретическом определении спектра нативных белков мочи, он дает возможность выявить характер и выраженность изменений функционального состояния нефрона, позволяет отследить динамику процесса, выявить причины микропротенурий, зафиксировать преморбидные состояния и скрытую патологию почек на стадиях, не манифестируемых при стандартном клиническом обследовании [Воронцов А.Л., Нестеровская А.Ю., Потапова Л.А., 2005].

Начало эры протеомики (изобретение МАЛДИ). Методы и возможности (чувствительность, производительность) протеомики на основе масспектрометрии

Огромный скачок в темпе развития исследований белков произошел после открытия возможности использования масс-спектрометрии для идентификации белковых молекул. В конце 80-х были разработаны методы ионизации белков без разрушения их первичной структуры - лазерная десорбция и ионизация при содействии матрицы (MALDI) (Танака, Карас, Бахман, Бар и Хилленкамп) и электроспрей (ESI) (Фенн) [Karas M., Bachmann D., Bahr D., Hillenkamp F., 1987]. За эти, так называемые «мягкие» методы ионизации [Tanaka K. et al., 1988; Costello C.E., 1997], Джон Фенн и Коиши Танака в 2002 году были удостоены Нобелевской премии по химии. В ESI растворы белков и пептидов распыляются электрическим полем в виде заряженных капель в капилляр, соединенный через вакуумный и ионный интерфейсы с масс-детектором. В MALDI ионизация осуществляется лазерным излучением, которое поглощается специально подбираемой матрицей, содержащей молекулы анализируемых соединений, и происходит в вакууме [Николаев Е.Н., 2007; Domon B., Aebersold R., 2006; Palmblad M., Tiss A., Cramer R., 2009]. Чем меньше по массе и чем сильнее заряжен белок, тем быстрее он достигает противоположно заряженного электрода. По времени движения иона до электрода определяют соотношение массы и заряда фрагмента (m/z). При облучении лазером образуются преимущественно однозарядные ионы, для них m/z примерно совпадает с массой [Говорун В.М., Арчаков А.И., 2002]. В то же время каждому из перечисленных методов ионизации присущи свои достоинства и свои недостатки: для электроспрейного источника ионизации характерно образование многозарядных ионов, т. е. ионов, образованных за счет присоединения более одного катиона, что делает совокупность сигналов масс-спектра более сложной для интерпретации; в масс-спектрах MALDI нижний диапазон масс «заселен» сигналами, связанными с наличием матрицы, на фоне которых информативные сигналы пептидов могут быть потеряны [Николаев Е.Н., 2007]. Масс-спектрометрические методы позволяют достаточно быстро анализировать значительное число образцов, они требуют сравнительно небольшого объема биоматериала, обладают высокой чувствительностью и хорошим разрешением [Говорун В.М., Иванов В.Т., 2011].

Протеом представляет собой набор белков, присутствующих в клетке, ткани или жидкости тела конкретного организма в данный момент времени, в данной среде, в данном физиологическом или патологическом состоянии [Romero R. et al., 2006]. Термин «протеом» предложил в 1994 году австралийский генетик Марк Уилкинс [Wilkins M., 2009], в научной среде термин появился в 1995 году [Wasinger V.C. et al., 1995] и с тех пор является общепринятым. Особенностью биологических образцов, таких как жидкости тела человека, с точки зрения состава их белков, является сложность (многокомпонентность) и высокое концентрационное различие входящих в их состав протеинов. Это накладывает повышенные требования к стандартизации протоколов, предварительной подготовки образцов, в которую входят многостадийная очистка и фракционирование смеси белков с помощью одно - и двумерного гель-электрофореза и/или жидкостной хроматографии [Николаев Е.Н., 2007]. Логическим шагом в развитии аналитических методов анализа сложных смесей белков и пептидов явилась комбинация масс-спектрометров с различными методами разделения смесей и разработка хромато-масс-спектрометрических комплексов (ЖХ-МС, LC-MS) [Aebersold R., Mann M., 2003]. Появление тандемной масс-спектрометрии (MS/MS) дало возможность проводить идентификацию белков [Paulo J.A. et al., 2012; Banach T. et al., 2013], устанавливать первичную аминокислотную последовательность, выявлять посттрансляционные модификации [Kang C., Yi G.S., 2011], и, наконец, осуществлять сравнительный количественный анализ белков в биологических образцах. В масс-спектрометрическом анализе белков различают два подхода: "top-down" и "bottom-up". При "top-down" происходит получение информации о целых, неповрежденных белковых молекулах, при "bottom-up" - восстановление информации о белках, при анализе отдельных пептидов этих белков. Причины редкого использования "top-down" связаны с недостаточной селективностью подхода, низкой производительностью, а также с тем, что для каждой массы белка может подойти несколько вариантов белков-кандидатов [Han X., Aslanian A., Yates J.R., 3rd 2008]. В методологии "bottom-up" сложную по составу анализируемую смесь подвергают ферментативному гидролизу (естественными протеазами, чаще всего - трипсином) для получения смеси пептидов [Link A.J. et al., 1999]. Фермент расщепляет белки по связи Lys - X и Arg - X (где X -- любая аминокислота, отличная от Pro и Hyp). В результате трипсинолиза получается набор пептидов (триптических пептидов). Данный метод был одновременно предложен пятью группами, независимо друг от друга: Генцелем и коллегами, группой Джеймса (ETH, Zurich), лабораторией Роепсторфа (EMBL, Heidelberg), Папином и коллегами (ICRF, London), лабораторией Иейтса (University of Washington) [Николаев Е.Н., 2007]. Выделяют два направления в приеме "bottom-up": “sort-then-break” и break-then-sort". “Sort-then-break” предполагает предварительное фракционирование и разделение белков, предшествующих триптическому расщеплению, затем масс-спектрометрический анализ полученной смеси. При "break-then-sort"смесь белков расщепляют без предварительного фракционирования с последующим проведением хромато-масс-спектрометрического анализа [Han X., Aslanian A., Yates J.R., 3rd 2008].

Организация HUPO и современное состояние по выявлению

белков крови и мочи человека

В 2001 году была создана международная научная организация «Протеом человека» (HUPO, Human Proteome Organization), в качестве задач которой были декларированы: инвентаризация всех белков организма человека, построение молекулярных белковых атласов клеток, органов и тканей, выяснение закономерностей регуляции функционирования белков при посттрансляционных модификациях, выявление схем белок-белковых взаимодействий и новых маркеров патологических процессов [Hanash S., 2004]. Крупномасштабное изучение протеома плазмы крови выделено в отдельный проект HUPO Plasma Proteome Project (HPPP) [Omenn G.S. et al., 2005]. В рамках данного проекта был проведен анализ возможностей и ограничений существующих протеомных методов с целью отработки стандартных воспроизводимых протоколов для получения, хранения и предварительной подготовки образцов плазмы крови, разделения белков и их последующей идентификации. Результаты проекта размещены в базе данных PRIDE (Proteomics IDEntifications) (http://www.ebi.ac.uk/pride), а также в базе данных Европейского института биоинформатики, который является одним из самых известных хранилищ данных протеомики на основе масс-спектрометрии. На сентябрь 2012 года, в данной базе содержалось 25853 основанных на MS-детектировании экспериментов протеомики, около 11,1 млн. выявленных белков, 61900000 пептидов и 324 млн. спектров для 89 видов животных, в том числе, и человека [Vizcaнno J.A. et al., 2013]. На сентябрь 2013 года, как сообщает Abersold, в библиотеке SWATH-MS содержалось около 10 000 белков и 85 000 пептидов человека, 5 600 белков клеточных линий [Liu Y. et al., 2013]. Bairoch представил данные о состоянии базы данных neXtProt, содержащей 15 646 белков организма человека, из которых 78% от общего числа, были подтверждены на белковом уровне [Gaudet P. et al., 2013]. В настоящее время инвентаризация белков крови человека не завершена.

Однако наиболее впечатляющих успехов в плане практического использования ее достижений протеомика достигла именно в области исследования протеома мочи [He J.C., Chuang P.Y., Ma'ayan A., Iyengar R., 2012]. Проект HKUPP (http://eurokup.org) был инициирован в 2005 году в рамках HUPO для содействия исследованиям протеомики в области нефрологии, понимания функции и заболеваний почек, поиска биомаркеров и развития теоретических протеомных исследованиях в этой области [Vlahou A., Charonis A., Benigni A., 2008]. Для достижения соответствующих задач было создано несколько под-проектов, наиболее актуальным из которых является проект «Создание стандартных протоколов и руководящих принципов для анализа протеома мочи». Это под-проект был всесторонне обсужден в ходе первого HKUPP симпозиума (во время ежегодного международного конгресса 6-го HUPO - октябрь 2007, Сеул, Корея) и второго семинара (во время 40-й Американского общества нефрологии почечной недели - в ноябре 2007 года в Сан-Франциско, США) [Yamamoto T. et al., 2008; Rodrнguez-Suбrez E., Whetton A.D., 2013].

Ценность мочи как биоматериала для клинических

и физиологических исследований

Моча как биологический объект обладает большим диагностическим и исследовательским потенциалом. Считается, что протеомом мочи содержит подробную информацию об изменениях в физиологическом состоянии человека [Mischak H., Thongboonkerd V., Schanstra J.P., Vlahou A., 2011; Metzger J. et al., 2013]. Моча может быть получена с использованием неинвазивных процедур и без участия специально обученного персонала, а также без ограничений в кратности сбора и объема, что исключительно ценно для неинвазивного мониторинга. Это делает мочу потенциально полезной для быстрого и надежного применения в клинических условиях [Mischak H., Delles C., Klein J., Schanstra J.P., 2010; Rodrнguez-Suбrez E., Siwy J., Zьrbig P., Mischak H., 2014]. Моча содержит белки и пептиды с низкой молекулярной массой, которые могут быть проанализированы с отказом от чрезмерно-сложных манипуляций, когда каждая дополнительная процедура в пробоподготовке приводит к генерации артефактов [Lee B. et al., 2011]. Небольшое количество содержащихся в ней протеаз обеспечивает белковую стабильность мочи [Kentsis A., 2011]. Протеом мочи не изменяется существенно, если образцы хранятся в течение нескольких лет при -20°С [Theodorescu D. et al., 2006], или при трехдневном хранении в 4°С, а также в течение 6 час при комнатной температуре или после повторных циклов замораживания-оттаивания [Schaub S. et al., 2004; Theodorescu D. et al., 2006; Mischak H., Vlahou A., Ioannidis J.P., 2013]. В моче в относительно низкой концентрации, в отличие от плазмы крови, присутствуют мажорные белки (альбумин и глобулины), а динамический диапазон концентраций на 3 порядка меньше, чем в плазме [Adachi J. et al., 2006]. Состав мочи не является постоянной величиной, концентрация белка в моче может варьировать от миллиграммов до граммов на литр в зависимости от времени сбора, диеты, физических упражнений, или стадии заболевания. Диапазон концентраций белков в моче у здоровых людей - 0 - 0,8 г / л [McDonough A.A., 2010]. Концентрация белка в моче у пациентов с хроническими заболеваниями почек может превышать 100 г/л [Наточин Ю.В., 1993; Rodrнguez-Suбrez E., Siwy J., Zьrbig P., Mischak H., 2014]. Конечная моча образуется в результате трёх процессов: фильтрации жидкой части плазмы (с образованием первичной мочи), реабсорбции электролитов, осмотически свободной воды и некоторых метаболитов и секреции в нее электролитов и отдельных метаболитов [Вандер А., 2000; Decramer S. et al., 2008]. Важнейшим компонентом фильтрационного барьера почки является гломерулярный барьер [Jarad G., Miner J.H., 2009], имеющий трехслойную структуру и состоящий из таких компонентов как эндотелиальных клеток капилляров, базальной мембраны и эпителия висцерального листка капсулы, или подоцитов [Miner J. H., 2011]. За сутки клубочки нефронов фильтруют более 1800 литров крови, в них образуется до 180 литров первичной мочи [Adachi J. et al., 2006; Eaton D.C., 2012]. В проксимальных канальцах более двух третей фильтрата реабсорбируется [Jia L. et al., 2009; McDonough A.A., 2010], в кровь возвращается практически вся глюкоза, аминокислоты, витамины, значительное количество ионов [Haraldsson B., 2010]. Высоко представленные белки плазмы также реабсорбируются в проксимальных почечных канальцах [Vinge L. et al., 2010]. В дистальных отделах нефрона обратному всасыванию подвергаются преимущественно электролиты и вода. Этот процесс контролируется антидиуретическим гормоном (АДГ). Следовательно, в зависимости от актуальных потребностей организма в осмотически свободной воде, в дистальных отделах нефрона моча может разбавляться или концентрироваться, что будет влиять на уровни экскретируемых с нею белков.

Анализ мочи протеомными методами.

Исследование протеома мочи дает возможность более глубокого понимания нормальной физиологии, а также патофизиологии заболеваний. Информация, полученная в этих исследованиях, может быть использована для диагностики различных заболеваний [Marimuthu A. et al., 2011]. Протеомика мочи стала одной из наиболее активно развивающихся дисциплин в области биомедицинских исследований [Thongboonkerd V., 2011; Albalat A., Mischak H., Mullen W., 2011]. Начиная с 2001 года, исследователи пытаются определить протеомный состава мочи. Так, Spahr с соавт. [Spahr C.S. et al., 2001] провели исследование протеома мочи, используя LC-MS/MS. Bergquis с соавт. [Bergquist J, Sciubisz A, Kaczor A, Silberring J., 2002] идентифицировали белки в четырех жидкостях организма человека: плазме, цереброспинальной жидкости, слюне и моче, проведя гидролиз белковой смеси собранных образцов с помощью трипсина и диализа перед последующей масс-спектрометрией ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье. В полученных масс-спектрах мочи было обнаружено 1183 пика, которые составили 654 изотопных кластера. В ряде работ по изучению протеома мочи использовался двумерный 2-DE и одномерный (1-DЕ) электрофорез, а также жидкостная хроматография (LC). Первая протеомная карта мочи, основанная на анализе образцов мочи здоровых добровольцев, состояла из 67 белков и их изоформ [Thongboonkerd V., McLeish K.R., Arthur J.M., Klein J.B., 2002]. Объединенные образцы мочи 20 здоровых добровольцев, используя технологии 2-DE-МS), позволили Oh J. с соавт. [Oh J. et al., 2004], идентифицировать 113 белков. Усилия по совершенствованию методов пробоподготовки, повышению воспроизводимости, усовершенствованию приборной базы, развитию нового программного обеспечения, позволили определять сотни и тысячи белковых соединений данного образца [Aebersold R., Mann M., 2003; Nagaraj N., Mann M., 2011]. Используя MALDI-MS и жидкостную хроматографию с ионизацией электроспреем (LC + ESI-MS/MS), Pieper с соавт. определили в моче 150 уникальных белков [Pieper R. et al., 2004]. На основе 1D-LC + ESI-MS/MS и LC/LC-MS/MS, дополнив ее предварительной аффинной очисткой проб мочи с помощью конковалина А, Wang с соавт. идентифицировали 225 уникальных белков [Wang L. et al., 2006], а Sun с соавт. - 226 белков [Sun W. et al., 2005]. Castagna с соавт. [Castagna A. et al., 2005], используя для концентрирования белков микрочастицы, покрытые специфическими лигандами, идентифицировали 383 уникальных пептида с помощью LC- LTQ-FT (MS/MS). В лаборатории M. Манна (Мюнхен, Германия) при использовании метода ионно-циклотронного резонанса c преобразованием Фурье (FT-ICR), дополненного линейной ионной орбитальной ловушкой (LTQ-Orbitrap), что позволило осуществлять тандемную масс-спектрометрию, было идентифицировано более 1543 белков в пуловых образцах мочи. Точность измерений достигала 1 ppm (одной миллионной части), измерения сочетались с выполнением многомерной жидкостной хроматографии (LC/LC + FT-ICR (MS3)) и гель электрофореза (2-DE + MS/MS/MS (MS3)) [AdachiJ. et al., 2006], что позволило значительно повысить достоверность идентификации белка, даже по единственному пептиду [Zerefos P.G., Aivaliotis M., Baumann M., Vlahou A., 2012]. Как сообщили Marimuthu с соавт., им удалось методом 1DLC/MS/MS идентифицировать 1823 белка в протеоме мочи здоровых лиц, при этом информация о 671 белке ранее не сообщалось. По мнению авторов работы, полученный список белков может служить базой для будущих исследований, направленных на выявление мочевых биомаркеров различных заболеваний [Marimuthu A. et al., 2011]. Kentsis и соавт. выявили 2362 белка в регулярно собираемых индивидуальных образцах мочи, используя протеомный подход SDS-PAGE-LC-MS/MS (фракционирование мочи с помощью ультрацентрифугирования, гель-электрофореза, ионно-обменной хроматографии с обращенной фазой), сведя потери материала к минимуму, и используя масс-спектрометр LTQ-Orbitrap и LC-MS/MS [Kentsis A. et al., 2010]. Наконец, в 2012 году группа М.Манна (Германия) объявила о выявлении 5823 различных белков в образцах мочи человека, из которых только около ј определялись более чем в одной публикации с использованием той же техники (LTQ-Orbitrap) [Nagaraj N. et al., 2012].

Большое количество информации может предоставить исследование пептидома мочи. Coon с соавт. опубликовали первый каталог пептидома человека, который включает 5010 пептидов, охарактеризованных с помощью капиллярного электрофореза в сочетании с масс-спектрометрией (CE-MS). Из общего числа 443 могут быть идентифицированы по их аминокислотной последовательности [Coon J.J. et al., 2008]. Возможности MS/MS позволяют секвенировать природные пептиды массой до 10 кДа [Chalmers M.J. et al., 2005]. В работе Siwy с соавторами [Siwy J. et al., 2011] описано более 13000 пептидов, более 900 из них - секвенировано. К настоящему времени база данных по пептидам содержит записи более чем 20000 образцов [Stalmach A., Albalat A., Mullen W., Mischak H., 2013] и более 1500 сиквенсов. Основная цель “Human urinary peptidome database” заключается в том, чтобы служить в качестве универсальной платформы для выявления и валидации биомаркеров множества заболеваний и патофизиологических изменений [Rodrнguez-Suбrez E., Siwy J., Zьrbig P., Mischak H., 2014]. Природные пептиды в моче являются результатом протеолитической активности, изменения в содержании которых, возможно, связаны со многими заболеваниями, в том числе воспалительными, фиброзными и неврологическими расстройствами [Klein J., Papadopoulos T., Mischak H., Mullen W., 2014]. Выделение и анализ протеома экзосом мочи привело к идентификации более 1000 белков [Gonzales P.A., Pisitkun T., Knepper M.A., 2008]. Экзосомы содержат мембранные белки практически всех типов клеток мочеполовой системы, а также заключают в себе ряд цитозольных белков [Zhou H. et al., 2006]. Как известно, основным источником экзосом являются мультивезикулярные тела, которые локализуются в клетках почечного эпителия, подоцитах, клетках почечных канальцев и попадают в мочу в результате слияния мембраны мультивезикулярных тел с апикальной мембраной эпителиальной клетки [Gonzales P., Pisitkun T., Knepper M.A., 2008]. В норме экзосомы содержат примерно 3% от общего количества белка мочи, они могут нести белковые маркеры почечной дисфункцией и структурного повреждения [Gonzales P., Pisitkun T., Knepper M.A., 2008].

Изучение протеома мочи, его применением в клинике

В последние годы протеомика и ее раздел - клиническая протеомика - вовлечены в работу по открытию биомаркеров различных заболеваний. Поскольку пока фундаментальных данных подобного рода недостаточно, то трудно определить, являются ли потенциальные биомаркеры специфическими для определенных заболеваний или просто выявляются из-за динамических изменений в протеоме мочи. В 2005 Nedelkov предложил ввести понятие «Популяционная протеомика» в качестве направления в исследовании протеома, включая меж - и внутрипопуляционные исследования в различных странах, а так же растущую потребность в анализе динамики протеома у отдельных здоровых лиц, как и необходимость оценки внутри - и межиндивидуальных различий [Nedelkov D., 2005]. Базы данных протеома мочи здоровых добровольцев могут играть важную роль на этапе обнаружения биомаркеров различных заболеваний, могут использоваться в качестве контрольной группы при исследованиях [Liu X. et al., 2012]. Методом 2D - PAGE Thongboonkerd с соавт. изучали внутри - и межиндивидуальную изменчивость в 38 образцах мочи. Была отмечена значительная степень межиндивидуальной вариабельности, в большей степени - для альбумина и трансферрина. Было отмечено также, что в мужской моче было большее количество общего белка, но меньшее число белковых пятен, по сравнению, с мочой женщин. По мнению данных авторов, на протеом мочи могут влиять многие факторы: характер питания, прием лекарств, характер жизнедеятельности, уровень физической активности, стресс, фазы менструального цикла у женщин и другие физиологические изменения, а так же факторы окружающей среды, к примеру, температура и влажность [Thongboonkerd V., Chutipongtanate S., Kanlaya R., 2006]. Khan с соавт. проанализировали образцы мочи мужчин, собранных за день (утром, днем и вечером) в течение 6-недельного периода (на первой, второй, третьей и шестой неделе) 2-DЕ гель-электрофореза. Было идентифицировано 339 белка, при этом, отмечалась значительная большая разница в протеоме образцов, собранных в разные дни исследования, по сравнению с мочой, собранной в течение одного дня [Khan A., Packer N.H., 2006].

Одним из важных вопросов в методологии протеомики мочи является вопрос о том, какую фракцию мочи брать для исследования. Несколько групп ученых пытались решить этот вопрос. Так, по мнению Russo с коллегами, первая фракция утренней мочи может иметь потенциальный недостаток в виде бактериального загрязнения из-за длительного времени пребывания в мочевом пузыре [Russo L.M., Bakris G.L., Comper W.D., 2002]. По мнению Thongboonkerd с соавт., первая утренняя фракция имеет наибольшее количество общего белка, но дает наименьшее количество белковых пятен для визуализации [Thongboonkerd V., Chutipongtanate S., Kanlaya R., 2006]. С другой стороны, Zhou с соавт. показали, что разница в результатах между первой и второй утренней фракцией мочи, при исследовании экзосом, была минимальной, что свидетельствовало о минимальном уровне деградации экзосом в мочевыводящих путях/мочевом пузыре. По мнению этих авторов, этому способствуют ингибиторы протеаз, поэтому они рекомендовали условия длительного хранения при -80°С, со встряхиванием после оттаивания [Zhou H. et al., 2006]. EuroKUP и HKUPP рекомендуют предпочтительно использовать для протеомного анализа мочи среднюю порцию второй утренней фракции или любой утренней фракции, являющейся наименее вариабельной по белковому составу и вследствие этого наиболее пригодной для протеомных исследований, при этом моча должна собираться в стерильную пластиковую ёмкость [Fiedler G.M. et al., 2007; Zьrbig P. et al., 2011]. Этот протокол позволяет стандартизировать преаналитические условия и получить высокую воспроизводимость результатов [Zьrbig P. et al., 2011]. Учитывая индивидуальную и групповую вариабельность, а также гендерные различия мочевого протеома, Marimuthu с соавт. предложили использовать репрезентативную группу, состоящую из 10 мужчин и 10 женщин в качестве контроля для качественного анализа протеома мочи [Marimuthu A. et al., 2011]. В работе Sun с соавт. образцы мочи были собраны у шести человек: трех мужчин и трех женщин (средний возраст от 27 до 30 лет), не имеющих острых или хронических заболеваний, не принимающих лекарства. Для оценки суточной вариабельности, пробы мочи последовательно собрались пять раз в течение дня следующим образом: 1 утренняя проба (6 человек), 2 утренняя проба (6 человек), проба до водной нагрузки (6 человек), через 30 минут после водной нагрузки 1 литром воды (6 человек) и 24 часовая фракция (6 человек). Образцы первой фракции были собраны на 0 и 7 день эксперимента. Методом 1-D LC/MS было идентифицировано 97, 86, 112, 99, и 92 белков в объединенных пробах, соответственно. Общими, обнаруженными во всех фракциях, были 42 белка, что соответствовало в среднем 88,7% от каждого образца. Шесть пар первых утренних проб мочи (пул образцов мужчин и женщин) собранных в 0 и 7 было также проанализировано; в них удалось идентифицировать, в общей сложности, 99/97, 118/97, 97/98, 158/184, 111/94 и 174/207 белков соответственно. Общими при этом оказались 68,98% белков, которые появились в обоих парных образцах и 89,15% во всех шести парах образцов. Эти результаты свидетельствуют о том, что при исследовании между днями, число общих белков было стабильным. Для определения межиндивидуальных различий, авторы сравнивали все пары мужских и женских образцов среди шести пар образцов. Сравнительный анализ проб мужчин и женщин показал 58,84%, общей области, что было ниже, чем между днями (внутри-индивидуальная вариабельность). Межиндивидуальных различий в протеоме мочи было больше, чем внутрииндивидуальных, что согласуется с опубликованными ранее результатами исследований [Khan A., Packer N.H., 2006]. Во всех 12 образцах, в общей сложности 26 белков оказались общими. При сравнении 6 пар мужских и 6 пар женских образцов мочи идентифицировалось 228 и 314 белков соответственно, пересечение составило 62%, 168 белков были общими, дифференциальный анализ определил 11 гендерно-специфических белков. Результат сравнения объединенных ииндивидуальных образцов показал, что пул образцов несколько уменьшает численность некоторых белков по сравнению с анализом индивидуального образца. Авторы сделали вывод о том, что существует постоянно присутствующий, стабильный уровень белков в моче на различных временных точках и у разных людей, любые значительные количественные и качественные изменения этих стабильных белков означают, что такие белки могут служить в качестве потенциальных биомаркеров. Так, среди 42 общих белков найденных в 5 объединенных образцах мочи, 12, по подтвержденным данным, связаны с 25 известными заболеваниями. Объединение образцов может устранить меж-индивидуальные различия, увеличивая количество общих белков и уменьшая число отдельных специфических [Sun W. et al., 2009]. В работе Nagaraj и Mann изучалась вторая фракция мочи семи человек в течение трех дней. Добровольцами были пять мужчин и две женщины разных национальностей, здоровые, в возрасте от 25 до 35 лет. Авторами был проведен троекратный анализ каждого из 21образцов мочи, что составило в общей сложности 63 LC-MS/MS экспериментов. Всего было идентифицировано 808 белков, в среднем по 6 пептидам каждый, техническая вариабельность была ниже 8%, внутриндивидуальная - 45% и межиндивидуальная - 47%. Выделено 20 наиболее представленных белков «основного» протеома мочи. Почти все они являлись гликопротеинами [Nagaraj N., Mann M., 2011]. В работе Marimuthu с коллегами, методом 1DLC/MS/MS, в моче здоровых лиц было идентифицировано 1823 белка с менее, чем 1% ложно-положительных результатов, при этом, об идентификации 671 белка ранее не сообщалось [Marimuthu A. et al., 2011]. База данных по белкам мочи здорового человека неуклонно пополняется. В настоящее время считается, что в моче содержатся свыше 3500 [Court M. et al., 2011] и даже - свыше 5 800 белков и их фрагментов, которые могут быть идентифицированы [Nagaraj N. et al., 2012].

Создание баз данных по протеому мочи различных клинических групп находится в фокусе внимания многих научных коллективов во всем мире [He J.C., Chuang P.Y., Ma'ayan A., Iyengar R., 2012]. Состав мочи хорошо коррелирует с этиопатогенезом большого числа заболеваний, являясь полезным диагностическим источником клинической протеомики [Mischak H. et al., 2009]. Образно выражаясь, моча является "золотым рудником " для поиска биомаркеров [Zoidakis J. et al., 2012]. Благодаря разным путям проникновения белка в конечную мочу, существует возможность обнаружения белковых маркеров в моче, характерных как для заболеваний почек и мочевыделительной системы, так и для болезней системного характера.

Существует несколько источников белка в моче и поэтому белки мочи условно подразделяют на три типа:

- преренальные белки - они поступают в мочу в ходе процесса ультрафильтрации из плазмы крови, составляя 30% от всех белков мочи [Hiemstra T.F. et al., 2011];

- почечные или ренальные белки - попадают в мочу по ходу её прохождения по нефрону и собирательным трубкам;

- постренальные - они поступают в мочу из эпителия стенок почечных лоханок, мочеточников и мочевого пузыря, составляя 70% от всех белков мочи [Hiemstra T.F. et al., 2011].

Поскольку часть протеомов крови и мочи является общей [Marimuthu A. et al., 2011], концентрация белка в моче и белковый состав мочи непосредственно отражают не только изменения функций почек и мочеполовой системы, но и практически всех других органов и систем организма [Mischak H. et al., 2009]. Тем не менее, несмотря на технический прогресс в методах хромато-масс-спектрометрии, вклад протеомики в клиническую практику по-прежнему скромный [Albalat A., Mischak H., Mulle W., 2011].

Протеомные исследования биомаркеров условно состоят из 4-х основных этапов:

1) подготовки проб (например, экстракция белка);

2) полуколичественного анализа;

3) анализа данных;

4) валидации находок.

Проверка специфичности и «чувствительности» выявления биомаркеров является одним из шагов необходимых для успешной реализации в клинической практике [Ling X.B. et al., 2010]. Как правило, для этого используетсяиммуноферментный анализ (ELISA), или вестерн-блот [Rodrнguez-Suбrez E., Siwy J., Zьrbig P., Mischak H., 2013].

Масс-спектрометрия является центральным аналитическим методом для исследования протеома мочи [Domon B., Aebersold R., 2006]. В связи со сложностью состава мочи, фракционирование часто используется до MS-анализа. Общие подходы, используемые в протеомике, на этапе разделения сложных белковых смесей включают: двумерный электрофорез, жидкостную хроматографию и капиллярный электрофорез - в сочетании с масспектрометрией [Rodriguez-Suarez E., Whetton A.D., 2013]. Первые исследования с использованием 2-DE для определения состава белка в нормальной моче были выполнены в 1979 году [Anderson N.G., Anderson N.L., Tollaksen S.L., 1979]. Использование 2-DE сократилось в настоящее время в связи с низкой пропускной способностью, широким динамическим диапазоном сложных образцов, с присутствием гидрофобных белков [Alban A. et al., 2003]. Последнее поколение масс-спектрометров, соединенных с высокоэффективными LC системами, принесло лучшее разрешение, чувствительность и воспроизводимость при более коротких сроках исследования. Тем не менее, для оценки молекулярных масс любого белка, 2-DE еще используется. Для изучения протеома мочи методом прямого профилирования в последние годы используется MALDI-MS [Fiedler G.M. et al., 2007; Molin L. et al., 2012].