Протеомный профиль мочи здорового человека в норме и при действии факторов космического полета

Результаты хромато-масс-спектрометрического анализа всех образцов были представлены в виде комплекта из ста двадцати одного (121) файла в формате html, являющихся отчётами по идентификации IPI индексов белков в базе данных Mascot. Файлы содержали список из 2 037 различных IPI индексов белков со значением Score от 20 до 1700. Всего, среди более, чем 20 тысяч выявленных пептидов, было обнаружено 690 протеотипических, то есть, содержащих уникальные последовательности аминокислот, присущих только одному белку человека. По ним было идентифицировано около 600 белков, пополнивших базу данных белков мочи здорового человека.

Как известно, влияние режима потребления соли на состояние органов - мишеней, таких как сердце, головной мозг, почки начало изучаться давно. Уровень исследований во многом был обусловлен целями, а также методическими возможностями, имеющимися для изучения конкретных органов и систем [Потешкина Н.Г., 2012].

Известно, что на характер протеома мочи воздействует целый комплекс факторов. Один из основных из них - это питание, в том числе, поступление в организм основных нутриентов, включая соль (NaCl). Задача данного исследования заключалась в том, что бы изучить протеомную композицию мочи здорового человека в контролируемых условиях жизнедеятельности при различном солепотреблении с помощью современных методов протеомики на основе масс-спектрометрии, используя различные возможности биоинформатики. Кроме того, предпринималась попытка связать наблюдаемые изменения в различных процессах и физиологических системах с контролируемым приемом соли.

Для решения этих задач использовалось несколько подходов. Первый - определение списка белков, непосредственно связанных с различным солепотреблением внутри эксперимента, затем - тканей, в которых данные белки преимущественно эксперссируются, а также анализ сверхпредставленных процессов, в которых данные белки участвуют.

Второй подход включал в себя сравнение всей протеомной композиции мочи в фоновом периоде (не на контролируемом приеме соли), в процессе эксперимента (с приемом различного количества соли в различные периоды эксперимента), а также при выходе из изоляции (не на контролируемом солепотреблении).

Исторически, с развитием сельского хозяйства и животноводства, и реализацией потребности иметь существенный резерв пищи, 6000-8000 лет назад в эволюцию человека пришло регулярное добавление соли в пищу. Этому новому риску человечество подверглось слишком поздно для генетической адаптации путем естественного отбора, вследствие чего его патофизиологические последствия почти всегда берут свою «дань» в виде сердечно-сосудистых и других заболеваний, нетрудоспособности и повышения смертности [Драгунов Д.О., 2014; Stamler J., 1997]. Эксперты, собравшиеся на проводимой ежегодно Всемирной Ассамблее по Питанию, (Рио-де-Жанейро, 2012) заявили: «Если мы хотим спасти несколько миллионов людей от ранней, так называемой преждевременной смерти, то нам необходимо отрегулировать количество употребляемой соли». По мнению Г. Макгрегора (Graham Mac Gregor), сотрудника Лондонского университета Королевы Мэри, именно соль, которую добавляют в еду, является главной причиной развития артериальной гипертонии. На период 2010-2020 гг. в США разрабатывается и вводится новая концепция идеального кардиоваскулярного здоровья (ideal cardiovascular health), и регулирование потребления соли включено во все критически важные компоненты этой программы [Потешкина Н.Г., 2012; Appel L.J. et al., 2011].

Известно, что почки фильтруют весь объем циркулирующей плазмы каждые 30 минут и реабсорбируют из этой «первичной мочи» две трети фильтрата в проксимальных канальцах. Точный контроль гомеостаза солей, воды и артериального давления традиционно приписывается регуляции транспорта в дистальной части канальца нефрона и собирательных трубочках. Одно из назначений почки млекопитающих - сохранение натрия для поддержания адекватного объёма крови и внеклеточной жидкости [Наточин Ю.В., 2000]. Транспорт натрия в проксимальных канальцах быстро и хронически регулируется артериальным давлением, внеклеточным объемом жидкости, ренин-ангиотензиновой, симпатической нервной, а также внутрипочечной допаминовой натрийуретической системами. Есть доказательства того, что регуляция транспорта Na+ в проксимальных канальцах является ключевым звеном в системе обратной связи, которая соединяет внеклеточный объем жидкости, артериальное давление и ренин-ангиотензиновую [van Paassen P., de Zeeuw D., Navis G., de Jong P.E., 1996], а так же симпатическую нервную системы [McDonough A.A., 2010].

У здорового человека экскреция Na+ с мочой прямо пропорциональна количеству Na+ в организме, в результате чего, содержание Na+ колеблется незначительно, хотя поступление в организм может колебаться в значительных пределах. Так как Na+ фильтруется в клубочке и реабсорбируется, но не секретируется, в канальцах, то количество экскретируемого Na+ во вторичной моче определяется только клубочковой фильтрацией и канальцевой реабсорбцией [Драгунов Д.О., 2014]. Если увеличить потребление соли, то экскреция натрия прогрессивно увеличивается и примерно за 3-5 дней достигает постоянного уровня, равному поступлению. В течение этого периода наблюдается положительный натриевый баланс, сопровождающийся задержкой воды и соответствующим увеличением массы тела. Затем в ответ на увеличение объема внеклеточной жидкости возрастает экскреция натрия и восстанавливается натриевый баланс. Когда потребление соли резко уменьшается, то наблюдается противоположный эффект [Драгунов Д.О., 2014]. Таким образом, в физиологических условиях в ответ на увеличение объема внеклеточной жидкости развивается натрийурез, а при его снижении - задержка натрия. Guyton с соавторами [Guyton A.C. et al., 1972] в своем исследовании показали, что восстановление баланса натрия после чрезмерного употребления соли зависит от натрийуретического ответа, который стимулирует повышение АД. В основном повышение АД служит физиологической реакцией, направленной на поддержание баланса натрия и объема внеклеточной жидкости в нормальных пределах. Ослабление механизмов, ответственных за соотношение давление-натрийурез, перемещает кривую «вправо», так, чтобы более высокие цифры АД были необходимы для достижения выделения достаточного количества натрия с мочой, требуемого для поддержания гомеостаза, и таким образом, высокие цифры АД сохраняются постоянно [Драгунов Д.О., 2014; Rodriguez-Iturbe B., Vaziri N.D., 2007]. Одной из причин развития этого феномена является изменение функции эпителиальных натриевых каналов (ENaC), локализованных в дистальных канальцах нефрона. Деятельность ENaC находится под контролем альдостерона [Oberleithner H., 2012]. Было выявлено, что у соль-чувствительных лиц, на фоне их обычной диеты с высоким содержанием соли (в среднем 185 ммоль натрия в день), проксимальная реабсорбция натрия значительно больше, по сравнению с группой соль-резистентных. При ограничении потребления натрия в среднем до 70 ммоль/сут, реасорбция натрия в дистальных канальцах статистически значимо не различалась во всех группах [Strazzullo P., Galletti F., Barba G., 2003]. В исследовании, проведенном Visser и соавт., изучалось влияние ангиотензина-II на функцию почек у соль-чувствительных нормотоников. Исследователи пришли к выводу, что для соль-чувствительных характерна гиперактивация почечной ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) [Visser F.W. et al., 2008]. У соль-чувствительных пациентов, на фоне диеты с высоким содержанием соли, реабсорбция натрия в проксимальных канальцах была повышена по сравнению с группой соль-резистентных. На основании этих данных авторы пришли к выводу, что реабсорбция натрия в проксимальных канальцах является важным фактором, определяющим изменение соотношения давление/натрийурез, которое происходит у соль-чувствительных пациентов с артериальной гипертонией независимо от изменений почечной гемодинамики [Strazzullo P., Galletti F., Barba G., 2003]. Ангиотензин-II и альдостерон непорседственно регулируют деятельность ENaC через рецепторы АТII. Однако, эффекты ангиотензина-II и альдостерона имеют разные временные периоды активации ENaC. Синергизм действия ангиотензина-II и альдостерона может играть важную физиологическую роль в увеличении ENaC - опосредованной реабсорбции натрия в дистальном альдостерон-чувствительном отделе нефрона в условиях гиповолемии, чтобы минимизировать потерю натрия с мочой. С другой стороны, независимое от альдостерона регулирование ENaC ангиотензинном-II отрицательно действует на баланс натрия при патологических состояниях, которые вызывают сверхстимуляцию интраренальной РААС, приводя к повреждению почек [Драгунов Д.О., 2014; Kobori H., Nangaku M., Navar L.G., Nishiyama A., 2007].

3.3.1. Определение списка белков, непосредственно связанных с различным солепотреблением внутри эксперимента

Для определения белков, непосредственно связанных с различным солепотреблением во время изоляции, был взят список белков 105-суточного эксперимента (без фона и периода реадаптации по его завершению) и определена их связь с приемом соли (независимо от количества принимаемой соли).

Анализ данных, полученных в 105-суточной изоляции, показал, что частота выявления в образцах не всех белков, но 21 из них достоверно коррелирует с изменением режима солепотребления (табл. 14).

Таблица 14. Список белков, частота выявления которых в моче достоверно коррелирует с солепотреблением.

Примечание: R - коэффициент корреляции Пирсона; corr p-value - p-value с поправкой Бенджамини Хокберга (Benjamini Hochberg) на множественность сравнения; adjust- поправка на множественность сравнения.

С помощью программы ANDvisio была определена ассоциативная сеть взаимодействия данных белков с NaCl, где крупными красными шарами выделены белки, достоверно коррелирующие с солепотреблением (рис. 2).

Рисунок 2. Ассоциативная сеть взаимодействия белков с NaCl, выявленных с помощью программы ANDvisio. Мелкие красные шарики - добавленные при реконструкции молекулярных цепей «новые» белки (т.е. не выявляемые в данном исследовании), чёрные линии с зелёными точками показывают отдельные взаимодействия между парой белков.

Изучение тканевой принадлежности белков, ассоциированных с уровнем потребления NaCl было выполнено для белков, внесенных в Таблицу 14, однако только для 13 из них была определена тканевая принадлежность с помощью базы Tiger (табл. 15).

Таблица 15. Список тканей, являющихся преимущественными источниками белков, связанных с уровнем солепотребления в контролируемых условиях

В некоторых из этих тканей, возможно, происходит не только экспрессия белков, связанных корреляционными связями с уровнем потребления натрия, но и накопление, депонирование натрия. Существует гипотеза, что жизнедеятельность здорового человека в изолированном гермообъеме (со снижением уровня двигательной активности, а также под влиянием метаболических эффектов эксперимента) сопровождается накоплением натрия в организме в осмотически неактивной форме [Титце Й. с соавт., 2003; Titze J., Machnik А., 2010; Titze J. 2013; Titze J. et al., 2014]. Активирующиеся в этих условиях процессы депонирования натрия, по-видимому, локализованы в костной, соединительной ткани или хряще, в которых в норме содержится 55 до 60% общего натрия в организме [Штеренталь И.Ш., 1993; Тернер А.Я., 1994]. Основываясь на данных, полученных в исследованиях на крысах, при установлении локуса депонирования обменноспособного связанного натрия, можно утверждать, что его преимущественная аккумуляция происходит в костях и коже [Иванова Л.Н., Арчибасова В.К, Штаренталь И.Ш., 1978; Titze J. et al., 2002]. В условиях острой нагрузки натрием у крыс накопление происходит в костях [Titze J. et al., 2002], скелетной мускулатуре и печени [Тернер А.Я.,1994], коже [Иванова Л.Н., Арчибасова В.К, Штаренталь И.Ш., 1978]. У крыс линии Sprague-Dawley при высоком потреблении соли содержание натрия в коже растет, в то время как общее содержание натрия в организме, колеблясь в широких пределах от 37,0 до 77,5 ммоль/кг веса тела, зависит от его содержания в пище [Titze J. et al., 2002]. Повышенное потребление соли (8% NaCl с 1% солевым раствором в качестве питьевой раствора) у крыс привело к накоплению Na+ в коже, способствуя увеличению интерстициального тонуса наряду с гиперплазией лимфокапилярной сети [Kanbay M., Chen Y., Solak Y., Sanders P.W., 2011]. В экспериментах на животных показано, что кожа является не только важным осмотически неактивным Na+ хранилищем у крыс. Известно, что кожа является самым большим органом с внеклеточным пространством, насыщена сосудами и состоит, в основном, из компонентов внеклеточного матрикса и гликозаминогликанов. Осмотически неактивное хранение Na+ в коже сопровождается изменениями в протеогликанах, что выражается их полимеризацией и сульфатацией [Tyan S.W. et al., 2012]. Эндотелиальный гликокаликс, анионный биополимер, покрывающий внутреннюю поверхность кровеносных сосудов участвует в механизмах Na гомеостаза, поскольку он способен временно хранить преимущественно ионы натрия [Weinbaum S., Tarbell J.M., Damiano E.R., 2007]. Он, видимо, служит в качестве защиты от быстрого поглощения натрия клетками, через эндотелиальные ENaCs, замедляя, в определенной степени, поток ионов натрия из крови в интерстиций [Oberleithner H., 2012]. Экспериментальные данные указывают, также на то, что Na+ является одним из критических кофакторов развития гипертрофии миокарда, особенно, при избытке минералокортикоидов, оказывает влияние, как при наличии, так и в отсутствии повышенного АД [Frohlich E. D., 1999]. При этом, гипертрофия миокарда, вызванная повышенным потреблением соли, может быть уменьшена большим потреблением солей К+ [Потешкина Н. Г., 2012; Burnier M., Phan O., Wang Q., 2007]. Гипертрофия левого желудочка, как проявление универсальных механизмов ремоделирования миокарда, развивается, также вследствие прямой активации солями Na+ тканевой РААС и симпатической нервной системы как у соль-чувствительных, так и у соль-резистентных пациентов [Потешкина Н. Г., 2012; Frohlich E. D., 1999; Takeda Y. et al., 2000].

При использовании программы BiNGO, были выявлены 90 процессов, в которых участвуют связанные с солепотреблением 21 белка. Известно, что сверхпредставленные процессы - статистически значимо более представленны по сравнению с некоторой референсной (контрольной) группой. В качестве контроля выбирались все белки человека, для которых известны биологические процессы. Более значимые процессы представлены (Таблица 16).

Таблица 16. Список наиболее сверхпредставленных биологических процессов белков, корреляционно связанных с солепотреблением внутри эксперимента.

Приведем краткую характеристику некоторых из них:

Метаболизм (анаболизм и катаболизм) гликозаминогликанов. Гликозаминогликаны (ГАГ) в составе протеогликанов входят в состав внеклеточного матрикса. Один из представителей гликозаминогликанов - гепарин, обладающий противосвёртывающей активностью, содержится в межклеточном веществе ткани печени, лёгких, сердца, стенках артерий. Протеогликаны покрывают поверхность клеток, играют важную роль в ионном обмене, иммунных реакциях, дифференцировке тканей [Зимницкий А.Н., Башкатов С. А., 2004]. Сульфатированные ГАГ (сГАГ) входят в состав межклеточного вещества вместе с волокнами коллагена, эластина и гликопротеинами, а также являются структурными компонентами клетки (секреторных гранул), клеточных мембран и гликокаликса, выполняя различные функции. Так, они регулируют транспорт воды, солей, аминокислот, липидов, метаболитов в бессосудистых брадитрофных тканях; а также обеспечивают правильную укладку тропоколлагена в фибриллах и фибрилл в волокнах коллагена, способствуя специфической структурной организации ткани. За счет полианионной структуры сГАГ могут менять конформацию различных молекул, регулируя продукцию и активность цитокинов, так называемых «матрикинов», созревание лейкоцитов и других клеток воспалительного ряда [Тахчиди Е.Х., Горбунова К.С., 2012]. Высокий отрицательный заряд ГАГ создает во внеклеточном матриксе электрическое поле, которое регулирует потоки интерстициальной жидкости, активность сигнальных веществ (цитокинов, факторов роста), связывая их во внеклеточном матриксе и определяя их взаимодействие с клеткой во времени и пространстве [Русова Т. В., Баитов В.С., 2012].

Организация внеклеточного матрикса. Внеклеточный матрикс (ВКМ), как составной элемент стромы, выполняет не только функцию опоры для клеток, но и играет роль в процессах, влияющих на клеточную пролиферацию, дифференциацию, апоптоз, а также депонирует биологические активные факторы роста. Деградация компонентов ВКМ осуществляется матриксными металлопротеиназами (ММП), обладающими протеолитической активностью. ММП секретируются в межклеточное пространство и функционируют в физиологических условиях. ММП активно участвуют в процессах ремоделирования ВКМ, разрушая такие его компоненты, как коллаген, эластин, фибронектин, гликозаминогликаны, что позволило считать эти ферменты эффекторами ремоделирования [Гасанов А.Г., Бершова Т. В., 2009].

Другие выявленные процессы более подробно освещены в главе 2 части данной главы.

Таким образом, анализ данных, полученных в 105-суточной изоляции, показал, что 21 белок достоверно коррелирует с изменением режима солепотребления внутри эксперимента. Для этих белков определены сверхпредставленные биологические процессы, которыми оказались: метаболизм (анаболизм и катаболизм) гликозаминогликанов, организация внеклеточного матрикса, клеточная адгезия организация внеклеточного матрикса и другие.

3.3.2 Анализ влияния различного уровня солепотребления на белковый состав мочи в 105-суточной изоляции с помошью программы oposSOM

3.3.2.1 Метод кластеризации - самоорганизующиеся карты

Для интерпретации полученных результатов применялась программа oposSOM, использующая метод машинного обучения - самоорганизующиеся карты (SOM), ранее разработанная для кластерного анализа данных экспрессии генов [Wirth H., Loeffler M., von Bergen M., Binder H., 2011; Wirth H., von Bergen M., Binder H., 2012]. Уровень экспрессии белков характеризовался числом испытуемых, у которых эти белки были идентифицированы в заданной временной точке эксперимента. С использованием метода SOM осуществлялось преобразование измеренных значений частоты встречаемости заданных белков в каждой временной точке эксперимента в единый ландшафт, представляющий некий «портрет» соответствующего протеомного фенотипа. Таким образом, ландшафт отображал протеомный фенотип для каждого из 2000 белков, идентифицированных в образцах мочи, на основе данных масс-спектрометрии. Дальнейший анализ такого «портрета» позволял проводить оценку сходства образцов, выбор дифференциальных характеристик, а также сверхпредставленности различных категорий генов. Основной принцип метода самоорганизующихся карт состоял в том, что белки с похожей временной динамикой частоты их идентификации испытуемых группировались вместе, в то время как белки с различной динамикой стремились локализоваться в различных областях карты. Для выделения протеомных фенотипов использовалось цветовое кодирование двумерной мозаики, отражающее на карте кластеры белков, обладающих повышенным (красный цвет) или пониженным (синий цвет) уровнем экспрессии (рис. 3).

Рисунок 3. Галерея ландшафтов экспрессии белков, построенная с помощью самоорганизующейся карты, иллюстрирующая уровень их экспрессии в различных временных точках эксперимента. Цвет характеризует уровень экспрессии белков, представленных в заданной ячейке карты.

В ходе анализа было применено три различных подхода для выделения групп совместно экспрессирующихся (коэкспрессирующихся) белков (модулей экспрессии):

(1) вычисление модулей экспрессии путем усреднения значения каждой из ячеек карты по всем рассматриваемым временным точкам и последующего выбора ячеек с уровнем экспрессии, представленных в них белков, лежащим в пределах 2% от наибольших и наименьших значений. Соседние, выбранные по карте ячейки, группировались в модули экспрессии;

(2) вычисление коррелирующих модулей экспрессии с использованием «зернового алгоритма», включающего следующие шаги. На первом шаге, производился выбор пары ячеек на карте («зерна»), имеющих наибольшее значение коэффициента корреляции Пирсона между временными профилями уровней экспрессии, представленных в них белков. Далее, соседние по карте ячейки добавлялись к «зерну», если коэффициент корреляции с исходной парой ячеек превышал определенный порог (использовалось значение, равное 0.5). Расширение модуля повторялось до тех пор, пока имелась хотя бы одна соседняя ячейка с коэффициентом корреляции, превышающим заданный порог. Формирование нового модуля стартовало с выбора пары «зерновых» ячеек, не включенных ни в один из модулей. Сигналом остановки алгоритма являлось отсутствие новых пар «зерновых» ячеек, имеющих корреляцию выше порога;

(3) использование метода кластеризации k-средних. В качестве меры схожести между ячейками использовалось эвклидово расстояние между временными профилями экспрессии белков. Число кластеров задавалось равным числу модулей с белками, обладающих повышенной экспрессией.

Построенные таким образом модули экспрессии, представляли группы коэкспрессирующихся белков, и могли определять функциональные модули [Quackenbush J., 2003]. Для установления биологических функций таких групп белков использовали анализ перепредставленности биологических процессов Gene Ontology (GO) [Wirth H., von Bergen M., Binder H., 2012]. Значимость перепредставленности оценивалась при помощи точного теста Фишера, а также «z-статистики перепредставленности набора генов» (GSZ), предложенной [Toronen P., Ojala P., Marttinen P., Holm L., 2009]. GSZ-статистика использовалась для дополнительной оценки значимости повышения экспрессии белков заданного модуля [Wirth H., von Bergen M., Binder H., 2012]. Взаимоотношения между модулями описывалось в терминах взвешенного топологического перекрытия (wTO) в сети, построенной с использованием парных корреляций между ячейками [Hopp L., Wirth H., Fasold M., Binder H., 2013].

Галерея ландшафтов экспрессии белков, построенная с помощью самоорганизующейся карты, иллюстрирующая уровень их экспрессии в различных временных точках эксперимента, показана на рис. 4. Из рисунка видно, что уровень экспрессии существенно меняется по ходу эксперимента, что отражает изменения в протеомных фенотипах, вызванные различными факторами эксперимента, включая динамику NaCl.

Рисунок 4. Галерея ландшафтов белков, построенная с помощью самоорганизующихся карт, иллюстрирующая частоту их выявления в различных временных точках эксперимента.

На рис. 4 приведены результаты анализа сходства ландшафтов экспрессии белков, полученные с помощью метода самоорганизующихся карт второго уровня (2nd level SOM). Из рисунка видно, что ландшафты последовательно группируются по четырем временным областям. Первый временной интервал включает ландшафты, построенные с использованием данных по экспрессии белков до начала изоляции испытуемых. Второй временной интервал включает в себя временные точки эксперимента приблизительно до конца 6-й недели изоляции, когда потребление соли было сокращено с 12 г/день до 9 г/день. Третий период заканчивается после 11 недели, то есть, через две недели после того, как потребление соли было снижено до 6 г/день. Наконец, последний временной интервал включает временные точки эксперимента последних трех недель изоляции, а также дополнительно еще три временные точки после изоляции. Стоит отметить, что переход между вторым и третьим временными интервалами служит своего рода переломным моментом, после которого протеомные ландшафты в фазовом пространстве карты второго уровня «начинают движение» в сторону начальной точки. В соответствии с количеством потребляемой соли, образцы, взятые до и после этого момента, относятся, соответственно, к повышенному и пониженному потреблению соли. Таким образом, все экспериментальные точки могут быть разбиты на три периода: «ранний», «промежуточный» и «поздний».

3.3.2.2 Анализ результатов

В результате этих приемов анализа качественных характеристик белков (частоты встречаемости в динамике эксперимента), была получена таблица, объединяющая все результаты данного этапа анализа (табл. 17).

Таблица 17. Суммация эффектов, наблюдаемых при различном уровне солепотребления

Примечание: 1) обогащенный анализ; 2) PSF анализ; 3) представляющие собой «шум» и единичные белки в единичных образцах.

Важно отметить, что уровень от 12 до 6 г/день рассматривается как нормальный диапазон суточного потребления соли для человека в РФ. Поэтому, наблюдаемые эффекты, связанные со снижением потребления соли, не связаны с чрезмерным или не физиологическим потреблением соли, а скорее отражают тонкие ответы на небольшие, но систематические изменения потребления соли в нормальных физиологических пределах.

Анализ результатов начального периода исследования

Начальный период исследования включает в себя период до изоляции и первые шесть недель (1-6) эксперимента. Если в начале эксперимента солепотребление было неконтролируемо, то с первой по шестую неделю оно составляло 12 г/день. С точки зрения ответа организма на высокое солепотребление, этой самый интересный период эксперимента. Несмотря на то, что весь анализ результатов связан с солепотреблением, нельзя исключить влияние психо-эмоцианальных нагрузок при «вхождении» в эксперимент, режима тренировок и т.д. Анализ полученных результатов в начальный период показал высокий уровень экспрессии белка, процент активации белков составил 27%, т.е. максимальный, за весь период обследования. По данным обогащенного анализа активируются следующие биологические процессы: воспаление, клеточная адгезия, свертывание крови, протеолиз, ангиогенез, процессы Са2+ связывания и внеклеточные процессы. Происходит активация сигнальных путей (PSF анализ), связанных с иммунным ответом, нервной регуляцией, нуклеиновым обменом, метаболизмом аминокислот и липидов. Эти процессы преимущественно происходят в печени, почках, поджелудочной железе (частично - коже).

Далее, были сопоставлены результаты, полученные в ходе анализа протеомных данных мочи методом, основанным на программе oposSOM, разработанного для анализа данных экспрессии генов, с результатами, полученными в данном эксперименте и известными литературными источниками.

Воспаление.

Известно, что воспаление является универсальной защитно-приспособительной компенсаторной реакцией, которая развивается в ответ на повреждение [Серебренникова С.Н., Семенов Н.В., Семинский И.Ж., Гузовская Е.В., 2012]. Воспаление относится к филогенетически старейшим типам защитных реакций организма, направлено на локализацию, уничтожение и удаление флогогенного агента, а также на устранение его последствий [Висмонт Ф.И., 2006]. Запускается цепочка иммунных реакций, в результате которой выбрасываются провоспалительные цитокины, хемокины и молекулы адгезии, которые обеспечивают быстрое накопление нейтрофилов в участке повреждения [Рубцов Ю.П. с соавт., 2012; Ioannou A., Dalle Lucca J., Tsokos G.C., 2011]. Продукция цитокинов и хемокинов нейтрофилами приводит к миграции макрофагов и выбросу больших количеств провоспалительных цитокинов, таких, как IFN-г и TNF-б [Maskrey B.H., Megson I.L., Whitfield P.D., Rossi A.G., 2011]. Дальнейшая секреция противовоспалительных цитокинов воспаления рекрутирует Т- и В-клетки, ускоряя их активацию и созревание. Они накапливаются в зоне повреждения, значительно усиливая воспаление за счет секреции новых доз цитокинов и провоспалительных факторов, что нередко приводит к нежелательному повреждению и гибели окружающих клеток ткани [Рубцов Ю.П. с соавт., 2012]. Воспалительный ответ, в свою очередь, запускает молекулярные механизмы, которые сдерживают активацию и деление клеток иммунной системы. Эти механизмы включают увеличение чувствительности активированных клеток к апоптозу, повышение уровня рецепторов к противовоспалительным цитокинам (IL-10 и T GF-в) на поверхности иммунных клеток и продукции этих цитокинов активированными клетками [Konkel J.E, Chen W., 2011]. Все это приводит к завершению острой фазы иммунного ответа, гибели поврежденных и активированных клеток, фагоцитозу клеточных останков фагоцитами [Рубцов Ю.П. с соавт., 2012].

Немаловажную роль, при этом, играют как клетки окружающей ткани, которые, находясь в составе внеклеточного матрикса, поставляют цитокины, а так же и клетки эндотелия сосудов, которые обеспечивают миграцию нужных клеток в очаг повреждения [Umemoto E. et al., 2011]. Так, в работе Zhou с соавт., было продемонстрировано увеличение моноцитов провоспалительной активации в ответ на увеличение уровня соли в пище [Zhou X. et al., 2014]. В исследовании, проведенном на Dahl соль-чувствительных крысах, было показано, что при высоком уровне потребления соли, активируются такие провоспалительные факторы, как NF-kB, TNF-a, что коррелирует с инфильтрацией тибулоинтерстициальной ткани воспалительными клетками [Gu J.W., 2006]. Избыток потребления соли приводит к увеличению фиброгенного цитокина TGF-в1 во внеклеточном матриксе миокарда, что обеспечивает развитие интерстициального и периваскулярного фиброза. Уменьшение концентрации интер-б-трипсинового ингибитора характерно для начальной стадии воспаления [Шевченко О.П., 1996]. Пониженное содержание всех пиков данного белка было отмечено в течение всего данного эксперимента, а также в течение первых двух недель периода реадаптации [Пахарукова Н.А., 2010]. Высокое потребление соли является установленным фактором риска рака желудка. По мнению Имянитова, предполагается, что соль индуцирует экспрессию генов воспалительного ответа в слизистой желудка [Имянитов Е.Н., 2009].

Клеточная адгезия.

Высокое потребление соли значительно повышает адгезию циркулирующих клеток, оказывая прямое влияние на эндотелий [Wild J. et al., 2014]. Натрий уменьшает активность эндотелия, уменьшая производство оксида азота, стимулируя ингибитор синтазы оксида азота (NOS) - асимметричный диметиларгинин и активируя оксидазу NADPH, что приводит к увеличению артериальной жесткости [Zieman S.J., Melenovsky V., Kass D.A., 2005]. При гистологическом исследовании интимы сосудов с повышенной жесткостью выявляются поврежденные и беспорядочно лежащие эндотелиальные клетки, повышенное содержание коллагена, поврежденные молекулы эластина [Жирнова О.А., Берестень Н.Ф., Пестовская О.Р., Богданова Е.Я., 2011].

Процессы свертывания крови.

Известно, что система гемостаза условно подразделяется на три системы: свертывания, противосвертывания и фибринолиза, которые тесно взаимосвязаны. Свертывание крови обеспечивается взаимодействием белков плазмы и клеток крови с поврежденным эндотелием или субэндотелиальными структурами. При повышенном потреблении соли существенно изменяется кровообращение [Потешкина Н. Г., 2012].

В данном эксперименте, 16-ые сутки изоляции, в крови отмечалось достоверное увеличение тромбоцитарного фактора IV (m/z=7765Да) [Пахарукова Н.А., 2010], являющегося важным компонентом коагуляционного каскада, что свидетельствует об увеличении активности системы сосудисто-тромобоцитарного (или первичного) гемостаза в крови [Баркаган З.С., Момот А.П., 2008]. При этом наблюдается достоверное замедление свертывания крови по внешнему пути и уменьшение концентрации центрального профермента фибринолитического звена - плазминогена на 35-е сутки исследования [Моруков Б.В., Маркин А.А., Кузичкин Д.С., 2011]. Результаты масс-спектрометрической идентификации пятен на электрофоретической карте, в начале эксперимента, показали увеличение уровня интенсивности белковых пятен, соответствующих б-цепи фибриногена и плазминогена [Трифонова О.П., 2011]. Известно, что данные белки выполняют важную роль в системе гемостаза: фибриноген участвует в процессе свертывания крови, а плазминоген - в процессе фибринолиза, сопровождающего процесс свертывания. Уровень фибриногена изменяется, в том числе, и при эмоциональном стрессе. Такими стрессогенными периодами могут быть как начальный этап изоляции, так и конечный этап изоляции [Трифонова О.П., 2011].

Протеолиз.

Протеолиз представляет особую форму биологического контроля, включает протеолитические ферменты, их неактивные предшественники, активаторы и ингибиторы. Протеолиз обеспечивает гомеостаз в норме и при развитии адаптационно-защитных реакций организма [Яровая Г.А., 2005; Акбашева О.Е., 2011]. Ограниченный протеолиз считают универсальным механизмом, ответственным за образование, инактивацию и модификацию гормонов, ферментов, физиологически активных пептидов [Мареев В.Ю., 2000]. Реакции ограниченного протеолиза лежат в основе функционирования таких важнейших физиологических систем, как РААС, калликреин-кининовая (ККС), система иммунитета, гемостаза, комплемента, апоптоза [Ефременко Ю.Р., Конторщикова К.Н., 2003]. Система комплемента состоит более, чем из 20 белков, составляющих 10% глобулиновой фракции сыворотки крови. Продукты активации комплемента индуцируют лизис чужеродных клеток, хемотаксис фагоцитов, усиливают поглотительную и бактерицидную активность фагоцитов, повышают проницаемость сосудов, способствуют освобождению из клеток серотонина и гистамина [Levi M., Van Der Poll T., 2013].

При изучении протеома сыворотки крови в данном эксперименте было выявлено достоверное увеличение площади пиков фрагментов комплемента С3 (m/z=1450; 1692; 1779; 1865 Да). Обнаруженные изменения могут указывать на возможную активацию системы комплемента в начальном периоде изоляции [Пахарукова Н.А., 2010]. Обнаружены изменения в интенсивности белковых пятен, относящихся к факторам С1 и С4 системы комплемента и иммуноглобулина М, что, по мнению Трифоновой, связано с активацией иммунной системы организма в период изоляции, так же и адаптацией организма к новым условиям жизнедеятельности, в том числе, к специфической микробной среде гермообъекта [Трифонова О.П., 2011]. Известно, что в период острой адаптации (первые 20 дней) у испытателей происходит нарастание потенциала патогенности аутомикрофлоры [Ильин В.К. с соавт., 2010].

Ангиогенез.

Ангиогенез - сложный физиологический процесс образования новых кровеносных сосудов. Он происходит посредством активации эндотелиальных клеток, экспрессии в них протеаз, разрушения внеклеточного матрикса, пролиферации, миграции и образования эндотелиальными клетками первичных высокопроницаемых сосудистых структур, которые после стабилизации и «взросления» за счет привлечения перицитов и гладкомышечных клеток трансформируются в трехмерную сосудистую сеть [Гарбузенко Д.В., 2013]. В норме, в организме процессы ангиогенеза протекают с умеренной интенсивностью, активизируются только при регенерации повреждённых тканей, канализации тромбов, ликвидации очагов воспаления, образовании рубца и других процессах восстановления. Физиологический ангиогенез представляет собой тканевый ответ либо на гормональную стимуляцию (ангиогенез в репродуктивной системе), либо на изменение окружающей среды [Спринджук М.В., 2010]. Основным индуктором ангиогенеза как в физиологических условиях, так и при различных патологических состояниях, является гипоксия. Клетки реагируют на недостаток кислорода несколькими способами, в том числе, накоплением гипоксии-индуцибельных факторов (HIFs), что стимулирует экспрессию ангиогенных факторов роста. Стимулировать ангиогенез также способны белки-члены семейства фактора роста фибробластов (FGF). Клеточный ответ на FGFs происходит через специфическое связывание с рецепторами FGF (FGFR), обладающими внутренней тирозинкиназной активностью, что является предпосылкой для фосфорилирования и активации сигнальных молекул при участии гепаринсвязывающих белков [Гарбузенко Д.В., 2013]. Рецепторы фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) локализуются преимущественно в эндотелиальных клетках и участвуют в регуляции ангиогенеза, стабилизации вновь образованных сосудов, изменении их проницаемости и дилатации сосудов. VEGFR3 является рецептором, который передает сигналы для стимуляции лимфогенеза. Стимулируя рост лимфатических сосудов, он увеличивает объем лимфатической системы, которая служит буфером при повышении количества натрия и воды в организме, препятствуя резкому повышению АД при гиперсолевой диете [Мангилёва Т.А., 2012]. Рост напряжения сдвига и активизация РААС при артериальной гипертензии (АГ) тоже ассоциируется с увеличением содержание VEGF за счет механического воздействия на клетки эндотелия сосудов и взаимодействия ангиотензина II с ангиотензиновыми рецепторами первого типа, что приводит к росту экспрессии HIF-1б и увеличению синтеза VEGF. Длительное снижение концентрации или блокада VEGF ведет к ухудшению выживаемости эндотелиальных клеток, разрежению микрососудов (уменьшение в тканях терминальных артериол и капилляров) и повышению АД [Herr D. et al., 2008].

Са2+связывание.

Чрезмерное потребление натрия активирует механизмы, способствующие увеличению концентрации внутриклеточного кальция и уровня катехоламинов плазмы [Rozendorff C., 2010]. Избыточное присутствие ионов Na+ в клеточной жидкости приводит к перегрузке и недостаточности Na+/K+ обмена, с последующей гипополяризацией клеточной мембраны, компенсаторному усилению механизма Na+/Сa2+ обмена, что приводит к перегрузке ионами Са2+ цитоплазмы [Потешкина Н.Г., 2013]. Увеличение содержания Са2+ и Na+ в сосудистой стенке повышает ее чувствительность к веществам прессорного действия за счет увеличения чувствительности к ним рецепторов [Бабкин А.П., Гладких В.В., 2009]. Эти данные согласуются с антигипертензивным эффектом антагонистов кальция. Ряд исследователей полагает, что солечувствительность ассоциируется с внеклеточным Са2+ солерезистентность - с концентрацией ренина и внутриклеточным Са2+ [Resnick L.M., 1994]. Добавление 1,5 г карбоната кальция в диету с нормальным содержанием соли снижало АД у солечувствительных и повышало его у солерезистентных гипертоников [Потешкина Н.Г., 2013; Weinberger M.H., Wagner U.L., Fineberg N.S., 1993].

Внеклеточная жидкость.

Вопрос о взаимосвязи солепотребления и гомеостаза внеклеточной жидкости затрагивается при описании взаимоотношений различных физиологических систем и процессов. Известно, что при увеличении потребления соли, экскреция натрия увеличивается и примерно за 3-5 дней достигает постоянного уровня, равному поступлению. В течение этого периода наблюдается положительный натриевый баланс, сопровождающийся задержкой воды и соответствующим увеличением массы тела. В ответ на увеличение объема внеклеточной жидкости возрастает экскреция натрия и восстанавливается натриевый баланс. Когда потребление соли резко уменьшается, то наблюдается противоположный эффект. Таким образом, в физиологических условиях в ответ на увеличение объема внеклеточной жидкости развивается натрийурез, а при его снижении - задержка натрия [Драгунов Д.О., 2014].

Повышение содержания Na+ во внеклеточной жидкости, даже при сохранении ее изоосмолярности, вызывает увеличение жесткости эндотелия [Коноплева Л.Ф., 2011], снижает продукцию природного вазодилатора - оксида азота [Dickinson K.M, Keogh J.B, Clifton P.M., 2009], в том числе, путем увеличения продукции его эндогенного ингибитора диметил L-аргинина [Потешкина Н.Г., 2012].

Условия данной длительной изоляции не вызывают, по мнению Ничипорука с соавт., проводивших исследования биоимпедансометрическими методами, а так же методами иммуноферментного анализа, изменений состава тела, состояния метаболизма и его нейрогуморальной регуляции, значимо и специфически отличных от привычной среды обитания [Ничипорук И.А. с соавт., 2011].

В начальном периоде эксперимента происходит активация сигнальных путей (PSF анализ), которые связаны с адаптивным иммунным ответом, нервной регуляцией, нуклеиновым обменом, метаболизмом аминокислот и липидов.

Клетки иммунной системы и солевой баланс.

Исследование, недавно опубликованное в Nature, показало, что соль может стать одним из главных факторов возникновения таких аутоиммунных заболеваний, как рассеянный склероз, псориаз, ревматоидный артрит и болезнь Бехтерева (воспалительное заболевание позвоночника и суставов), сахарный диабет 1 типа [Kleinewietfeld M. et al., 2013]. Авторы показали, что увеличение потребления соли может индуцировать патогенные клетки Th17. Избыток соли способен запустить механизм аутоиммунных заболеваний у людей, имеющих генетическую предрасположенность к ним. Профессор Йельского университета Дэвид Хафлер, считает, что дело не в "плохих генах" или "плохой окружающей среде", но в плохом взаимодействии "генов и среды". По его словам, соль является одним из факторов риска наравне с курением или дефицитом витамина D. Machnik с соавт. показали, что избыток соли оказывает влияние на реакции врожденного иммунитета [Machnik A. et al., 2009]. Известно, что баланс Na в организме регулируется не только почками, его концентрация в соединительной ткани кожи (где он хранится) может быть выше, чем в крови. Макрофаги способны к распознанию высокого уровня Na+. Было обнаружено, что в коже гипертоников содержится значительное количество соли, иммунные клетки (мононуклеарных система фагоцитов) способны регулировать баланс соли и кровяное давление [Machnik A. et al., 2009]. Wiig с соавт. предположили, что кожа является гипертонической интерстициальной жидкостью [Wiig H. et al., 2013]. По мнению доктора Titz, в настоящее время имеется достаточное количество доказательств того, что Na+ депонируется в коже в неионном виде, т.е. без адекватного объема жидкости. Результаты работ Titze говорят о том, что электролиты в коже нелегко уравновесить с плазмой, но если это достигается, то это позволяет избежать почечного гомеостатического контроля [Titze J., Machnik A., 2010; Titze J., 2014]. Эти данные подтверждают идею о том, что внутрисосудистые и интерстициальные пространства представляют собой два различных внеклеточных отсека электролитов, которые регулируются независимым образом. В серии экспериментов авторы определили, что состав электролитов кожи регулируется макрофагами в ее локальной системе интерстициальных лимфатических капилляров [Machnik A. et al., 2009; Wiig H. et al., 2013]. Макрофаги выступают в качестве датчиков и регуляторов состава электролитов в интерстиции кожи. Макрофаги обладают хемотаксисом в отношении тканей с высокой концентрацией соли. В этих условиях в макрофагах активируется NFAT5, который запускает экспрессию фактора роста эндотелия сосудов C (VEGFc), в результате чего реализуется гиперплазия лимфатических капилляров кожи, что приводит впоследствии к снижению кровяного давления [Титце Й. с соавт., 2003; Titze J., Ritz E., 2009; Heer M. et al., 2009].

Известно, что центральную роль в реализации феноменов адаптивного иммунного ответа играют В- и Т-клетки. Результаты исследований количественных характеристик этих клеток в данном эксперименте показали, что во время пребывания в гермообъекте у обследуемых наблюдалось увеличение абсолютного содержания В-клеток и Т-клеток, связанное с повышением уровня в периферической крови лимфоцитов. Оно служило ответом на антигенную стимуляцию, связанную с изменениями микробного сообщества среды обитания и микробного пейзажа различных биотопов человеческого организма, возникающих в гермообъекте [Моруков Б.В. с соавт., 2010]. У некоторых из обследуемых отмечалось увеличение (на 15% и более от фонового уровня) относительного содержания CD19+-лимфоцитов, что свидетельствует о напряжении В-звена адаптивного иммунитета. Изменение CD4+-лимфоцитов, по мнению Рыковой, вероятно связано со сдвигом равновесия системы в сторону интенсификации образования факторов, стимулирующих иммунные реакции [Рыкова М.П., 2013].

Нервная система.

В научной литературе обсуждается вопрос об основной причине гипертонии, которая может возникать либо в результате чрезмерной активности симпатической нервной системы, либо при чрезмерной реабсорбции соли почками [Kapusta D.R., Pascale C.L., Kuwabara J.T., Wainford R.D., 2013]. Комбинация нескольких факторов - стресса, повышенного потребления соли, чрезмерной активности симпатической нервной системы (СНС) приводит к стимуляции РААС, эфферентной вазодилятации, снижению клубочковой фильтрации и усилению канальцевой реабсорбции натрия, что способствует ретенции Na+ [Бабкин А.П., Гладких В.В., 2009]. С другой стороны, по мнению Koolen с соавт., само избыточное потребление с натрия пищей повышало активность СНС у солечувствительных и солерезистентных гипертоников. Однако, у последних не происходило значимого повышения АД за счет компенсаторного повышения чувствительности барорецепторов, выделенных в группы по уровню экскреции норпенифрина почками [Koolen M.I., Bussemaker-Verduyn den Boer E., van Brummelen P., 1983]. Показано, что диета с высоким содержанием соли увеличивает концентрацию натрия в спинномозговой жидкости, активирует симпатическую нервную систему животных и человека [Stocker S.D., Monahan K.D., Browning K.N., 2013]. По мнению Kapusta с соавт., патогенез гипертонической болезни включает в себя интеграцию реакций, как в центральной нервной системы, так и в почках, и что обе системы непосредственно способствуют развитию гипертензии. Подавление экспрессии белка Gбi2 в мозге у солерезистентных крыс приводит к повышенной активности симпатической нервной системы, к задержке почками натрия и развитию почечной нервно-зависимой сольчувствительной гипертонии [Kapusta D.R., Pascale C.L., Kuwabara J.T., Wainford R.D., 2013].

В начальном периоде эксперимента происходит активация процессов в следующих тканях: печени, почках, в поджелудочной железе, (частично коже), с участием сверхпредставленных белков.

Печень.

У лиц с гиперинсулинемией и инсулинорезистентностью отмечена высокая чувствительность АД к поваренной соли, поэтому большинство исследователей считают гиперинсулинемию, инсулинорезистентность и солечувствительность АД ассоциированными состояниями [Бабкин А.П., Гладких В.В., 2009; Giner V., Coca A., de la Sierra A., 2001]. У солечувствительных пациентов высокосоленая диета индуцирует гиперинсулинемию и ухудшает чувствительность тканей к инсулину [Fujiwara N. et al., 2000]. Действие гиперинсулинемии на развитие гипертонии может быть связано с развитием центральной гиперсимпатикотонии, которая приводит к повышению активности ренина в почках и активации РААС. Внутрипочечный тканевый ангиотензин-II сокращает как приносящие, так и отводящие артериолы, приводя к снижению почечного кровотока, уменьшению фильтрационной нагрузки по натрию [Fujiwara N. et al., 2000]. Ренин регулирует начальный, ограничивающий скорость, этап РААС путём отщепления N-концевого сегмента ангиотензиногена для формирования биологически инертного декапептидаангиотензина 1 или Ang-(1-10). Первичный источник ангиотензиногена - печень. Ангиотензин - II усиливает реабсорбцию натрия за счет одновременного воздействия на ренальные сосуды и почечные канальцы, снижая медуллярный кровоток, повышает пассивную реабсорбцию натрия в петле Генли. Ангиотензин-II повышает натрий - водородный обмен в проксимальных канальцах и активность Na+-K+-АТФ-азы. Конечный итог этих воздействий реализуется в снижении экскреции натрия с мочой и формировании солезависимой гипертонии [Бабкин А.П., Гладких В.В., 2009]. Показано, что повышение концентрации глюкозы в крови увеличивает экспрессию гена ангиотензиногена в почечной ткани и активизирует почечную РААС. Вследствие инсулинорезистентности тканей и гипергликемии отсутствует или снижено подавление экспрессии гена ангиотензиногена, и продукция ангиотензина - II в почечной ткани усилена. Ангиотензин - II через воздействие на АТ-1-рецепторы усиливает выделение норадреналина в синапсах почек и приводит к почечной гиперсимпатикотонии. Стимуляция эфферентных нервов почек увеличивает канальцевую реабсорбцию натрия, приводя к задержке жидкости и повышению АД [Бабкин А.П., Гладких В.В., 2009; Botero-Velez M., Curtis J.J., Warnock D.G., 1994]. Таким образом, гиперинсулинемия и инсулинорезистентность, ассоциируясь с солечувствительностью АД, усугубляют течение друг друга [Бабкин А.П., Гладких В.В., 2009].