Протеомный профиль мочи здорового человека в норме и при действии факторов космического полета

Таким образом, под влиянием условий эксперимента с 5-суточной «сухой» иммерсией с использованием протеомных методов анализа белкового состава мочи и биоинформационных подходов, было выявлено 9 белков, осуществляющих свои функции в ССС, к ним относились сывороточный альбумин (ALB), альфа-2-HS-гликопротеин (АHSG), цистатин-С (CST3), витамин D-связывающий белок (GC), кининоген-1(KNG1), калликреин-1(KLK1), перликан, фетуин А, Е - кадхерин. Частота выявления в образцах характеризовалась различной динамикой в ходе эксперимента. У части белков динамика выявления зависела от модификаций, под действием факторов СИ, функций почек (селективности гломерулярного барьера, процессов реабсорбции натрия и воды, регуляции почечной гемодинамики). У другой части - являлась признаком, свидетельствующем о развитии дисфункции эндотелия сосудов.

3.5.5 Белки тканей почек и мочевыводящей системы

Следующим этапом работы было обнаружение белков тканей почек и мочевыводящей системы в моче и их связь различными параметрами водно-солевого обмена, наблюдаемыми в ходе эксперимента. С помощью системы ANDSystem было выявлено 18 белков, 7 из которых, демонстрируют динамические изменения частоты своего обнаружения в условиях СИ на 4 сутки, по сравнению с фоновыми значениями (табл. 37).

Таблица 37. Изменение числа обнаружений белков тканей почек и мочевыводящей системы в образцах мочи 8 здоровых добровольцев.

Анализ корреляции динамики частоты встречаемости белков с динамикой параметров водно-солевого обмена, для пяти точек эксперимента (фон, 2, 4, 5 и 3 сутки после завершения эксперимента) выявил 6 белков, демонстрирующих корреляцию между динамикой частоты встречаемости белка в образцах и различными параметрами водно-солевого обмена (табл. 38).

Таблица 38. Корреляции частоты выявления отдельных белков

с параметрами водно-солевого обмена.

Для понимания выявленной динамики протеомного состава мочи на фоне 5 суточной иммерсии необходимо рассмотреть функции обнаруженных белков.

Кубулин (МВ 398,736 Дa) и мегалин (МВ 521,958 Дa) - гликопротеиновые рецепторы, мембранные белки, которые совместно осуществляют рецептор-опосредованный эндоцитоз белков через апикальную мембрану клеток проксимальных канальцев почек [Batuman V., еt al., 1998]. Показано, что эти мультилигандные рецепторы связываются с большим числом лигандов [Verroust P.J., Birn H., Nielsen R. et al., 2002]. Эндоцитоз осуществляется после связи комплекса лиганд-кубулин с мегалином, который опосредует внутриклеточное перемещение кубулина [Christensen E.I. et al., 2009]. Кубулин «распознаёт» свои специфические лиганды, но только последующее образование связи с мегалином обеспечивает интернализацию всего комплекса в цитоплазму [Amsellem S. et al., 2010]. Кроме эпителия проксимальных канальцев, кубулин в почке экспрессируется также в подоцитах, которые могут интернализировать белки, профильтровавшиеся из крови [Prabakaran T. et al., 2012]. Мегалин выражено экспрессируется в почках в клетках проксимальных канальцев и во всех компонентах эндоцитозного аппарата [Christensen E.I. et al., 2009]. Комплекс рецептор-мегалин через рецептор-опосредованный эндоцитоз поступает в эндосомы, которые затем подкисляются для облегчения диссоциации лиганд-рецепторного комплекса [Gekle M., Mildenberger S., Freudinger R., Silbernagl S., 1995], затем рецепторы рециркулируют к люминальной мембране. Появление в моче фрагментов мембранных рецепторов, скорее всего, означает, что они вошли в состав экзосом. Однако, не смотря на их совместную работу, и увеличение частоты встречаемости белков в образцах на 4-е сутки эксперимента, по сравнению с фоном, только для кубулина удалось выявить достоверную корреляцию с уровнем экскреции натрия. Известно, что дефицит кубулина приводит к потери альбумина и апоА-I с мочой [Aseem O. et al., 2014] и увеличение экспрессии белка может быть направлено на противодействие потери белка на фоне увеличение диуреза на первые сутки иммерсионного воздействия.

Витамин К-зависимый белок Z аннотирован в главе «Анализ протеома мочи в АНОГ». Помимо увеличения частоты встречаемости белка в образцах на 4-е сутки эксперимента, по сравнению с фоном, наблюдалась достоверная корреляция частоты встречаемости этого белка с динамикой экскрецией жидкости, экскрецией натрия и показателями частичного водного баланса.

Остеопонтин (MB 35,423 Дa) - аннотирован ранее, в главе «Анализ протеома мочи в АНОГ». Хотя, увеличение частоты встречаемости белка в образцах на 4-е сутки эксперимента, по сравнению с фоном не выявлялось, наблюдалась достоверная корреляция динамики частоты обнаружения в образцах данного белка с динамикой частичного водного баланса и экскреции натрия.

Белки калликреин-кининовой системы аннотированы ранее, в главе «Белки тканей почек и мочевыводящей системы». В ходе СИ было отмечено увеличение частоты встречаемости в образцах KNG1 и KLK1 на 4-е сутки эксперимента, по сравнению с фоном. Динамика частоты обнаружения в образцах кининогена коррелировала с водопотреблением, а калликриина с экскрецией жидкости, экскрецией натрия и частичным водным балансом. Столь тесная связь с парамерами водно-солевого обмена может быть обусловлена тем, что калликреин-кининовая система, функционирующая в почках, существенно отличается от плазменной. Синтезируемый канальциевым эпителием кортикальных сегментов нефрона калликреин поступает в канальцевую жидкость, а затем в мочу. В результате взаимодействия калликреина с кининогенами в дистальных канальцах образуется брадикинин, что приводит к усилению почечного кровотока, подавлению реабсорбции натрия и воды из организма [Katori M., Majima M., 2014].

Мальтаза-глюкоамилаза, фермент апикальной клеточной мембраны; он определяется в почках, тонком кишечнике, гранулоцитах. Зарегистрировано увеличение частоты встречаемости в образцах на 4-е сутки, по сравнению с фоном, и достоверная корреляция с динамикой водопотребления.

Аквапорин-2 аннотирован в главе «Выявление значимо представленных биологических процессов по составу протеома мочи космонавтов на первые сутки после длительных космических полетов». В ходе СИ выявлено снижение частоты обнаружения в образцах данного белка к 4-м суткам эксперимента по сравнению с фоновым значением.

Тиазид чувствительный Na,Cl контранспортер (NCC) опосредует реабсорбцию натрия через апикальную мембрану дистальных извитых канальцев нефрона, кодируется геном SLC12A3 и принадлежит к семейству SLC12 электронейтральных котранспортёров ионов хлоридов [Gamba G., 2010]. В почках расположен в дистальных извитых канальцах [Arroyo J.P., 2011], кроме почки экспрессируется в кишечнике и костной ткани [Dvorak M.M. et al., 2007]. Уровень белка находится под контролем сразу нескольких гормонов, в том числе альдостерона, ангиотензина II, глюкокортикоидов, эстрогенов, инсулина, и вазопрессина. То обстоятельство, что NCC регулируют так много различных гормонов предполагает, что реабсорбция натрия посредством NCC является важным гомеостатическим механизмом контроля [Sohara E. et al., 2011; Chбvez-Canales M. et al., 2013]. Альдостерон активирует NCC как при приёме внутрь, так и в ответ на рацион с низким содержанием натрия [Kim G.H. et al., 1998]. Вызывает некоторое удивление, что и ангиотензин II также способен активировать NCC, поскольку мишенью для его воздействия являются, прежде всего, проксимальные канальцы [McDonough A.A., 2010]. Это влияние может быть обусловлено необходимостью активизировать ретенцию натрия при гиповолемии, так как это состояние характеризуется повышенным уровнем в плазме как ангиотензина II, так и альдостерона [van der Lubbe N. et al., 2013]. В эксперименте с СИ выявлено снижение частоты обнаружения в образцах S12A3 к 4-м суткам эксперимента по сравнению с фоновым значением.

Таким образом, были идентифицированы белки, которые демонстрируют ассоциативную связь с функциями выделительной системы, выявляемую в ходе автоматической экстракции данных из базы данных PubMed при анализе с помощью системы ANDCell. Эти протеины также демонстрируют чувствительность к иммерсионному воздействию, что подтверждается корреляцией встречаемости этих белков в образцах, собранных в различные периоды эксперимента с изменяющимися параметрами водно-солевого обмена (на 4-е сутки эксперимента по сравнению с фоновыми значениями). Изучение физиологических функций выявленных белков может, с одной стороны, подтвердить уже устоявшиеся представления о физиологическом ответе на иммерсионное воздействие, а с другой - предоставить новую информацию о ранее неизвестных механизмах адаптивного процесса.

3.6 Выявление значимо представленных биологических процессов по составу протеома мочи космонавтов на первые сутки после длительных космических полетов

Известно, что космический полет воздействует на организм человека комплексом факторов, среди которых микрогравитация является ведущим и не воспроизводимым (с большой продолжительностью) на Земле. Возможность на молекулярном уровне выявить механизмы приспособления человека к земной силе тяжести после длительного пребывания на околоземной орбите дает возможность лучше понять направленность и диапазон происходящих в условиях космического полета физиологических изменений в организме человека.

В образцах мочи пятнадцати российских космонавтов было выявлено 294 различных белков, 211 из них представлено в образцах, собранных в фоновом периоде, 243 - на первые сутки после КП и 207 - в пробах, собранных у группы космонавтов на седьмые сутки восстановительного периода. В образцах мочи двенадцати членов дублирующих (российских) экипажей присутствовало 211 различных белков. Эти лица относились к той же возрастной группе, проходили аналогичную подготовку, имели тот же рацион питания и находились в тех же условиях, что и космонавты. Образцы биологического материала у космонавтов-дублеров были получены дважды, в интервалы времени, соответствующие пред- и послеполетному сбору биоматериала у космонавтов, совпадающие с предполетным обследованием и сбором образцов у космонавтов на 1-ые сутки после полета (т.е. через 180-240 суток после старта космической экспедиции основного экипажа). В образцах мочи обследованных дублеров было выявлено 181 и 169 белков. Все добровольно участвовали в эксперименте «Исследование протеома крови и мочи у основных и дублирующих членов экипажей до и после космических полётов на МКС («Протеом»), в рамках которого осуществлялся сбор биологических образцов до и после полета.

У космонавтов на первые сутки после полета было выделено 34 специфических белка, которые встречались хотя бы один раз в трех повторах хромато-масс-спектрометрического определения. Эти белки не обнаруживались ни в пробах мочи фонового периода, ни в образцах, собранных космонавтами на 7 сутки после КП, ни в моче членов дублирующих экипажей. Тканевая принадлежность этих белков была определена по базе данных TiGER (табл. 39) [Liu, et al., 2008].

Таблица 39. Тканевая принадлежность 34 специфичных для КП белков

по базе данных TiGER.

Очевидно, что протеом мочи могут составлять не только белки почек и мочеполовой системы, но и протеины практически всех других систем организма. Из крови в мочу поступает значительная часть белков, преодолевая гломерулярный фильтр (что возможно как по размеру молекулы, так и по электростатическому заряду). Происхождение белков плазмы, идентифицированных по пептидам в моче, различно, это как белки крови, осуществляющие в ней свою функцию, так и продукты «подтекания» тканей, или внутриклеточные белки, поступающие в кровь в результате клеточной гибели (апоптотической или в результате протеолиза) [Anderson N.L., Anderson N.G., 2002; Jia L. et al., 2009].

Повышение или снижение относительной доли тех или иных белков в моче может свидетельствовать об активации (включении) или угнетении (выключении) определенных процессов в организме. Было проведено сравнение биологических процессов, которые, с одной стороны, сверхпредставлены доля белков данного процесса выше среди белков мочи, чем среди всех белков человека в моче, а с другой стороны, отличаются по числу наблюдаемых белков между состояниями до и после полёта.

Для выявления процессов, которые реагируют на условия космического полёта, находили сверхпредставленные процессы для белков, определённых только на первые сутки после полёта, и сверхпредставленные процессы, для белков присутствующих во всех группах образцов мочи кроме, первых суток (рис. 18).

Согласно приведенной схеме (рис. 18), с помощью программы BiNGO [Maere S., Heymans K., Kuiper M., 2005], для 34 белков, специфичных для проб мочи первых послеполетных суток обследования, было выявлено 63 сверхпредставленных процесса. Среди них, согласно базе данных Uniprot-GOA [Dimmer E.C. et al., 2012], наиболее сверхпредставленным процессом оказался “response to inorganic substance”, который, по существу, представлял собой реакцию регуляции гомеостаза электролитов и минеральных веществ (p-value = 2.2*10-6).

Рисунок 18. Схема поиска биологических процессов «реагирующих» на условия космического полёта.

Примечание: «Белки» - наборы белков для указанного состояния, «СБП» - найденные сверхпредставленные биологические процессы Gene Ontology для указанного состояния, «До полёта» - космонавты до полёта, «Первые» и «Седьмые сутки» - космонавты на первые и седьмые сутки после полёта, соответственно, «Дублёры 1» и «2» - два измерения для дублёров, «специфичные +» - характерные только для первых суток после полёта, «специфичные -» - процессы, найденные для всех групп образцов мочи кроме, первых суток.

Три белка, включенные в этот процесс (утероглобин, в-субъединица гемоглобина, глутатион-пероксидаза 3) - также участвуют в системе антиоксидантной защиты (“response to reactive oxygen species”), активация которой является специфичным для +1 суток сверхпредставленным процессом [Григорьев А.И., Баевский Р.М. 2007; Маркин А.А., Журавлева О.А., 2001; Selvaraj N., Bobby Z., Sridhar M.G., 2008]. Вторым по значимости процессом оказалась регуляция водного баланса организма (“regulation of body fluid levels”), отнесенная к процессам, связанным с функцией почек. Процессы, имеющие p-value<0.01, были связаны с гемостазом. Всего для +1 суток после КП выявлялось 10 сверхпердставленных процессов с p-value<0.01. Последним из них по значимости, являлся фундаментальный процесс «localization», включающий всевозможные механизмы транспорта и депонирования веществ, вовлекающий тысячи белков организма.

Также было выявлено 6 сверхпредставленных процессов для двух белков (кератин I типа цитоскелетный 28 и кератин II типа цитоскелетный 5), присутствовавших во всех группах образцов мочи, за исключением первых суток. Эти процессы связаны с развитием кожных покровов и формированием клеточных контактов.

Далее была осуществлена попытка связать основные, из выявленных 63-х сверхпредставленных процессов, с физиологическими изменениями, происходящими в различных системах организма в ранний восстановительный период. В них вошли 9 процессов, связанных с функцией почек и состоянием водно-электролитного обмена; 3 процесса - с мышечной системой; 3 - с функциями сердечно-сосудистой системы; 9 - с перекисным окислением липидов и системой антиоксидантной защиты; 11 - с иммунной системой; 5 - с системой гемостаза; и 2 - с обменом веществ.

На первые сутки после полета, как правило, отмечалась умеренная гипокалиемия и повышенная активность ионизированного кальция, нередко отмечалась гипернатриемия, повышение концентрации общего белка в крови и высокий гематокрит, что при увеличенном водопотреблении и сниженной экскреции осмотически активных веществ, свидетельствует о сохраняющемся дефиците объема циркулирующей плазмы и гипогидратации организма [Газенко О.Г., Григорьев А.И., Наточин Ю.В., 1980; Газенко О.Г., Григорьев А.И., Егоров А.Д. 1990; Моруков Б.В., Наточин Ю.В., Ларина И.М., Носков В.Б., 2003; Носков В.Б., 2013; Grigoriev A.I., Morukov B.V., Vorobiev D.V., 1994]. Развиваются адаптивные реакции, направленные на восполнение потерь внеклеточной жидкости и минеральных веществ, необходимые для формирования земного типа водно-солевого гомеостаза [Моруков Б.В., Наточин Ю.В., Ларина И.М., Носков В.Б., 2003]. Происходит активация ренин-альдостероновой системы, снижение эффективности действия антидиуретического гормона, дисбаланс простагландинов прессорного/депрессорного класса [Григорьев А.И., Ларина И.М., Носков В.Б., 2006]. В этот период увеличивается содержание волюморегулирующих гормонов в плазме крови, что вызывает снижение почечной экскреции осмотически активных веществ и положительный водный баланс, который способствует увеличению объема плазмы и восполнению дефицита массы тела. Таким образом, после космического полета развиваются адаптивные реакции, направленные на восполнение потерь внеклеточной жидкости.

Как отмечено нами ранее, белки мочи космонавтов, выявленные в образцах, собранных в первые сутки после полета, оказались участниками 9 процессов, которые связаны с функцией почек и состоянием водно-электролитного обмена (табл. 40). Данные процессы определяют как транспорт воды, так и транспорт ионов.

Практически все белки, указанные в табл. 40 являются новыми участниками хорошо известных в космической физиологии процессов. Белки, обнаруженные в моче участников АНОГ, входят также и в список почечных белков космонавтов и дублеров [Пастушкова Л.Х. с соавт., 2013]. В моче добровольцев не обнаруживается аквапорин-2, это, возможно связано с более длительным и значимым воздействием на организм космических полетов.

Таблица 40. Процессы, связанные с функцией почек и состоянием водно-электролитного обмена

AQP2 (MB 28,837 Да) - белок апикальной мембраны эпителия собирательных трубок почек, который формирует молекулярный водный канал (пору) для переноса воды через липидный бислой мембран [Peng J., Jones G.L., Watson K., 2000]. Белки семейства аквапоринов, встраиваясь в мембрану, избирательно пропускают молекулы воды и являются совершенно непроницаемыми для заряженных частиц. Почечная экскреция воды регулируется главным образом через влияние вазопрессина на аквапорин-2 (AQP2), который экспрессируется в дистальном отделе нефрона [Stein T.P., 2002]. Вазопрессин регулирует проницаемость для воды эпителия собирательных трубок нефрона путём воздействия на миграцию аквапорина-2 из внутриклеточных везикул к люминальной мембране. Это ведёт к реабсорбции осмотически свободной воды и концентрированию мочи. Показано, что активация регуляции со стороны вазопрессина усиливает экскрецию аквапорина-2 с мочой, который поступает в мочу в составе экзосом небольшого размера, образующихся без разрушения эпителиальных клеток [Zhang H., Tao L., Jiao X., 2007]. AQP2 может теряться при нарушении внутриклеточной рециркуляции [Frцhlich M., Deen P.M., Klipp E.A., 2010], а также в состоянии усиленной почечной реабсорбции воды [Stein T.P., 2002]. Именно этот процесс является характерным для состояния почки после приземления космонавтов (рис. 19) [Газенко О.Г., Григорьев А.И., Наточин Ю. В., 1980].

Рисунок 19. Связь аквапорина с водной депривацией.

Из 63 биологических процессов, белки которых были выявлены на 1 сутки после полета, 3 были связаны с функциями мышечной системы, такими как сборка саркомеров и механотрансдукция роль в мышечных клетках, развитие мышечного волокна, положительная регуляция синаптического роста в нервно-мышечном соединении. Функциональные возможности мышечной системы в условиях невесомости до сих пор являются одной из основных медицинских проблем в длительных космических полетах [Григорьев А.И., Козловская И.Б., Шенкман Б.С., 2004]. Наиболее очевидным следствием воздействия невесомости является потеря мышечной массы и связанные с ней функциональные нарушения, такие как снижение сократительных свойств мышц, выносливости и работоспособности человека, изменение (перестройка) системы метаборефлекторной регуляции (табл. 41).

Таблица 41. Процессы, связанные с мышечной системой.

Гравитационная разгрузка вызывает мышечную атрофию за счет активации систем протеолиза цитоскелетных белков, таких как десмин, титин [Григорьев А.И., Шенкман Б.С., 2008; Tesch P.A., von Walden F., Gustafsson T., еt al., 2008]. Титин - гигантский эластичный полифункциональный белок поперечно-полосатых и гладких мышц [Григорьев А.И., Шенкман Б.С, 2008; Vikhlyantsev I.M. et al., 2011]. В саркомерах сердечной и скелетных мышц позвоночных он является третьим по представленности (после актина и миозина) белком. Титин участвует в формировании «правильной» структуры саркомера: организации тонких и толстых филаментов в саркомеры, последовательное соединение которых формирует миофибриллу, являющуюся основной структурно-функциональной единицей мышечного волокна. Пучки миофибрилл формируют сократительный аппарат, обеспечивающий сократительные возможности мышечной клетки (рис. 20) [Tskhovrebova L., Trinick J., 2010].

Рисунок 20. Связь титина (прямая и через посредников) с миозином.

Титин принимает участие в запуске и регуляции актин-миозинового взаимодействия как через связывание с белками тонких нитей, так и посредством изменения АТФазной активности и Са2+ чувствительности миозина. Играет важную роль в процессах внутриклеточной сигнализации, участвует в регуляции экспрессии мышечных генов и белкового обмена в саркомере [Tskhovrebova L., Trinick J., 2002]. Снижение в 2 раза N2A-изоформы титина было обнаружено в m.soleus крыс после 14-суточной моделируемой гравитационной разгрузки, и сопровождалось уменьшением пассивного напряжения при растяжении мышцы. Более длительное вывешивание (14- и 30-суток) связано с деструктивными изменениями в титине, вплоть до полного разрушения его NT-изоформы [Shumilina Y.V., Vikhlyantsev I.M., Podlubnay Z.A., Kozlovskaya I.B., 2010; Vikhlyantsev I.M. et al., 2011; Okuneva A.D. et al., 2012].

Среди белков, участников мышечных процессов, выявлен агрин, играющий центральную роль в формировании и поддержании нервно-мышечных контактов, участвуя в дифферентации постсинаптических структур. Агрин экспрессируется мотонейронами, нервными и шванновскими клетками, участвует в запуске сигнальных каскадов, приводящих к формированию необходимых компонентов постсинаптической мембраны [Hilgenberg L.G. et al., 2006; Higuchi O., Yamanashi Y. 2011].

Очевидно, активация систем протеолиза цитоскелетных белков, таких как десмин, титин, лежит в основе мышечной атрофии, которая, в свою очередь, обуславливает снижение сократительных свойств мышц, выносливости и физической работоспособности после космического полета [Григорьев А.И., Шенкман Б.С, 2008; Vikhlyantsev I.M. et al., 2011].

Также, в образцах, собранных на первые сутки после полета были выявлены белки, участники процессов, обеспечивающих адаптацию сердечно-сосудистой системы к земной гравитации после завершения КП: транспорт оксида азота, регуляция объемного кровотока, ответ на тироксиновые стимулы (табл. 42).

Таблица 42. Процессы, связанные с сердечно-сосудистой системой.

Известно, что оксид азота выполняет множество функций в организме: является нейромедиатором, вазодилататором, антиагрегантом, мощным фактором гомеостаза [Андронов Е.В., Киричук В.Ф., Иванов А.Н., Мамонтова Н.В., 2007]. Эндотелиальные клетки являются источником оксида азота, он опосредует сосудорасширяющие эффекты эндотелийзависимых вазодилататоров, тормозит образование фактора эндотелина-1 и высвобождение норадреналина. Принимает участие в регуляции сосудистого тонуса и кровотока, системной гемодинамики и микроциркуляции, ингибирует адгезию форменных элементов крови к эндотелию [Киричук В.Ф. с соавт., 2011]. Белок бета-субъединицы гемоглобина (HBB), (MB~ 16 кДа) участвует не только в транспорте кислорода из легких в различные ткани, но и в транспорте окиси азота, а также потенцирует активность брадикинина, что приводит к снижению кровяного давления [Shumilina Y.V., Vikhlyantsev I.M., Podlubnay Z.A., Kozlovskaya I.B., 2010; Kayashima Y., Smithies O., Kakoki M., 2012]. Специфичным для первых суток послеполетного периода оказался и белок тиоредоксин аннотированный в главе «Анализ протеома мочи в АНОГ». Он выявляется в моче на первые, а также на 16 и 21 сутки АНОГ. Возможно, он появляется так же и во время полета, однако, у нас имелась возможность обследовать космонавтов только на первые и седьмые сутки после космического полета.

В ответ на окислительный стресс тиоредоксины обильно экспрессируются в эндотелии [Landmesser U., Drexler H., 2007]. На первые сутки после посадки после длительных КП уровень в плазме кортизола резко увеличивается [Ларина И.М. с соавт., 2002; Symons T.B., Sheffield-Moore M., Chinkes D.L., 2009].

Ранее было показано, что после длительных полетов у космонавтов обнаруживаются признаки ингибирования процесса перекисного окисления липидов, а также достоверно растет уровень липидного антиоксиданта - токоферола [Маркин А.А., Журавлева О.А., 2001; Selvaraj N.,et al. 2008].

Среди специфичных для +1 суток после КП белков нами были обнаружены те, которые участвуют в 9 процессах, связанных с перекисным окислением липидов, с регуляцией и метаболизмом активных форм кислорода (Таблица 43).

Таблица 43. Процессы, связанные с перекисным окислением липидов и антиоксидантной активностью.

Транскрипция гена гем-оксигеназы регулируется уровнем свободнорадикального окисления [Starklint J. et al., 2006] и индуцируется различными прооксидантными факторами [Clark J.E., Foresti R., Green C.J., Motterlini R., 2000]. Каталаза и глутатионпероксидаза (GSH-Px) - ферменты утилизирующие H2O2 [Semenza G.L., 1999]. Супероксид может повышать время жизни H2O2, так как он инактивирует каталазу и глутатионпероксидазу. Отмечают, что системы иммунитета, гомеостаза и перекисного окисления липидов тесно связаны друг с другом [Бышевский А.Ш., Умутбаева М.К., Алборов Р.Г., 2003]. В данном исследовании на первые сутки после КП было выявлено 11 процессов, связанных с регуляцией функций иммунитета, в которых принимают участие следующие белки: CD63 антиген, утероглобин, фруктоза-1, 6-дифосфатаза-1, в-субъединица гемоглобина, белок S100-A8, тиоредоксин, агрин, аквапорин-2, глутатионпероксидаза 3, проактиватор полипептида, К-зависимый белок С, проактиватор полипептида, титин. С системой гемостаза оказались связаны 5 процессов, с участием следующих белков: CD63 антиген, титин, витамин К-зависимый белок С, проактиватор полипептида. Кроме того, на первые сутки после полета 2 процесса были связаны с обменом веществ, в которых участвовали следующие белки: 6-фосфоглюконолактоназа, фруктозадифосфатальдолаза B, аквапорин-2. Процессов, связанных с внутриклеточными процессами, на 1 сутки после полета выявлено 8. К ним относились следующие белки: фруктоза-1,6-дифосфатаза-1, эукариотический трансляционный фактор инициации 6, в-субъединица гемоглобина, геликаза лимфоид - специфическая, глутатионпероксидаза-3, титин, карбоангидраза-1, карбоангидраза-1, афамин, аквапорин-2, иммуноглобулин лямбда, иммуноглобулин каппа-6.

Таким образом, при изучении белкового состава мочи космонавтов после завершения продолжительных полетов удалось выявить специфические белки- участники физиологических процессов, характерные для процессов реадаптации к земным условиям жизнедеятельности. Эти белки преимущественно синтезировались в различных органах и функциональных системах организма.

Специфичными сверхпредставленными для +1 суток периода восстановления после полета, как правило, были процессы, происходящие во многих клетках и тканях. Биоинформационными методами и с помощью ручной аннотации белков и процессов. использованных в данной работе, удалось связать биологические факты и физиологические особенности состояния космонавтов в первый сутки после завершения полетов, хорошо известные и документированные ранее, с выявленными в моче белками, участниками различных биологических процессов.

Кроме подтверждения на молекулярном уровне механизмов раннего периода реадаптации, были также выявлены процессы, не изученные ранее, но происходящие в организме с участием обнаруженных белков. Построение ассоциативных сетей белок-белковых взаимодействий дало возможность выдвинуть гипотезы о взаимном влиянии и взаимной вовлеченности процессов, происходящих во внеклеточной жидкости при адаптации к КП и моделируемым его эффектам. Исследование протеома мочи человека на первые сутки после окончания КП, в острый период реадаптации организма человека к земной гравитации, позволило выявить многообразие механизмов приспособления организма человека к условиям жизнедеятельности на Земле после длительного пребывания на околоземной орбите.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных исследований показывают, что хромато-мас-спектрометрический анализ мочи является информативной технологической платформой для характеристики протеома мочи, который может служить индикатором различных физиологических состояний организма здорового человека.

Протеомный метод анализа, ввиду его высокой чувствительности, позволил исследовать белок в каждой пробе мочи и полностью оценить его белковую композицию. В соответствии с требованиями EuroKUPи HKUPP использовался стандартизированный протокол сбора мочи для протеомного анализа, в котором использовалась средняя порция второй утренней фракции, которая является наименее вариабельной по белковому составу и вследствие этого - наиболее пригодной для протеомных исследований [Fiedler G.M. et al., 2007]. Сбор мочи осуществлялся в стерильную пластиковую ёмкость [Zьrbig P. et al., 2011], использовалась оптимальная рабочая концентрация белка в пробе в пределах 0,1-1,0 мг/мл, что не является нижним пределом чувствительности метода. Концентрационный диапазон исследуемых белков был 10-7 -12-12 ммоль/л. Пробы мочи испытуемых были проанализированы протеомными методами индивидуально, трижды и для последующего анализа были отобраны пептиды, выявленные в двух или трёх повторах. Список из точных масс пептидов и масс их фрагментов использовался для поиска и идентификации белков по базе данных IPI-human при помощи программы Mascot (MatrixScience, Лондон, Великобритания; version 2.0.04). С использованием параметров: 1) enzyme - trypsin; 2) peptidetolerance ±5 ppm; 3) MS/MS (fragments) toltrance ±0,5 Da. Из списка белков, полученного в результате поиска, отбирались только те, для которых были идентифицированы 2 и более триптических пептида с рейтингом (score) > 24 [Agron I.A., Avtonomov D.M., Kononikhin A.S. et al., 2010]. Указанные выше критерии контроля качества результатов были более строгими, чем в работах, использующих пул образцов, что повышало достоверность получаемых результатов и выводы.

Результаты проведенной работы позволили охарактеризовать протеомную композицию мочи здоровых мужчин в возрасте от 19 до 54 лет, выявить при этом сотни различных белков, принадлежащих большинству тканей организма человека. Была продемонстрирована достоверная положительная, средней степени выраженности, корреляция возраста обследуемого и числа (R=0.566; p-value=1.24E-05), а также массы белков (R=0.429; p-value=0.00079) в образце. При этом, с увеличением возраста достоверно чаще выявлялись 23 белка, продуцентами, которых были 11 тканей и органов тела человека.

Полученные данные могут быть основой для успешного поиска и валидации независимых маркеров различных состояний и процессов в организме здорового человека, а также использоваться как внутренние стандарты при определении концентрации других белков в моче.

Одним из центральных вопросов в исследовании протеома мочи является изменчивость, вариабельность состава присутствующих белков. Достоверные источники для оценки вариабельности содержания тех или иных белков в моче у здоровых лиц в контролируемых условиях малочисленны. Ранее совместно с Образцовой О.А. были выявлены показатели индивидуальной и групповой вариабельности белковых пиков с помощью метода прямого профилирования образцов [Образцова О.А., 2013]. Исследование протеома мочи здорового человека в течение длительного промежутка времени (530 суток) позволило показать, что в образцах постоянно выявлялись 7 белков, имеющих низкую функциональную связанность между собой. На основании этого можно предположить, что идентифицированный набор белков может представлять собой независимые маркеры различных процессов в организме здорового человека.

Помимо анализа протеомного профиля мочи здорового человека в привычных условиях, проводилась оценка изменений белковой композиции в ответ на изменение условий жизнедеятельности. Экстремальные условия представляют собой один из немногих способов, позволяющих вызвать отклонение гомеостаза у здорового человека, чтобы распознать механизмы поддержания постоянства состава внутренней среды и сохранения резервов здоровья, т.е. выявить адаптивный потенциал организма. Для здорового человека список методов (условий), этически дозволенных и доступных для воздействий, приводящих к отклонению его гомеостаза, относительно короток. Для понимания того, как формируются физиологические реакции на различные воздействия необходимо перебросить концептуальные и функциональные мостики от генетики к белкам, от белков к клеткам, далее к органам, и системам в организме. С другой стороны, очевидно, что белки, изменение уровня которых наблюдается в экстремальных условиях, не могут рассматриваться как потенциальные биомаркеры развития заболеваний, поскольку они участвуют как в естественном молекулярном ответе организма в процессе адаптации к изменению условий жизнедеятельности.

Поэтому в ходе данной работе был проведен анализ изменений протеома мочи при воздействии длительных космических полетов и модельных экспериментов, имитирующих отдельные эффекты микрогравитации (антиортостатическая гипокинезия, «сухая» иммерсия), а также условия существования в длительной космической экспедиции (105 - суточной изоляции в гермообъеме).

Анализ данных, полученных в 520-суточной изоляции, показал, что состояние физиологических систем организма здоровых молодых мужчин систематически и последовательно изменяется в зависимости от уровня солепотребления в диапазоне нормального суточного потребления соли в РФ (норма 4-12г/сут.). Кроме того, выявлено, что белковая композиция мочи за неделю восстановительного периода не возвращается к фоновым значениям, что указывает на инертность биологических процессов, в которые вовлечены белки, связанные с регуляцией солевого обмена. Таким образом, эти данные существенно расширяют современные представления о возможных механизмах влияния различного уровня приема соли (6 - 12 г/сутки) на организм здорового человека.

Было показано, что протеом мочи здорового человека во время его пребывания в течение 21 суток в антиортостатической гипокинезии при 21-суточном АНОГе характеризуется определенным дрейфом появляющихся и исчезающих из мочи белков. При этом, определена значимость появления белков, участвующих в деятельности разных органов и систем организма: почек, сердечно-сосудистой и костно-мышечной систем.

В эксперименте с 5-суточной «сухой» иммерсией, после идентификации белков, выполненной по базе данных UniProt КВ и системы ANDSystem, было выявлено 9 белков, осуществляющих свои функции в сердечно-сосудистой системе, к которым относились сывороточный альбумин, альфа-2-HS-гликопротеин, цистатин-С, витамин D-связывающий белок, кининоген-1, калликреин-1, перликан, фетуин А, Е-кадхерин. Их частота выявления в образцах характеризовалась различной динамикой в ходе эксперимента. Так, белки кининоген 1 и калликреин 1 относятся к калликреин - кининовой системе, которая вместе с ренин-ангиотензиновой системой регулируют тонус сосудов и обеспечивают оптимальный уровень оксигенации тканей. Связь между этими системами осуществляется на уровне проренина, который активируется калликреином, а также ангиотензин-превращающего фермента, участвующего в деградации брадикинина и образовании ангиотензина II. В данном исследовании было показано, что через 24 часа после начала иммерсионного воздействия происходит подавление активности ренин-ангиотензиновой системы, в частности, вдвое снижается активность ренина плазмы, повышаются диурез и экскреция натрия. Частота выявления в моче калликреина 1, снизившись в начале СИ, затем нарастала до 100% и не восстанавливалась до фоновых значений в течение недели после окончания иммерсии, что согласуется с результатами, полученными так же в крови. Кроме того, идентифицированы белки, которые демонстрировали ассоциативную связь с функциями выделительной системы и чувствительностью к иммерсионному воздействию, что подтверждается корреляцией встречаемости этих белков в образцах, собранных в различные периоды эксперимента с изменяющимися параметрами водно-солевого обмена.

После завершения продолжительных полетов выявлены специфические белки, они оказались участниками физиологических процессов, характерных для процессов адаптации организма человека к микрогравитации и/или реадаптации к земным условиям жизнедеятельности. Биоинформационный анализ позволил связать хорошо известные и документированные ранее биологические факты и физиологические особенности состояния космонавтов в первые сутки после завершения полетов с выявленными в моче белками, участниками различных биологических процессов, и позволяют более полно представить механизмы адаптации физиологических систем организма человека в острый период адаптации к земной гравитации.

Таким образом, изучение физиологических функций, присущих выявленным белкам может, с одной стороны, подтвердить уже устоявшиеся представления о физиологическом ответе на воздействие, а с другой - предоставить новую информацию о ранее неизвестных механизмах адаптивного процесса.

ВЫВОДЫ

Использование высокотехнологичных протеомных методов на основе хромато-масс-спектрометрии позволяет выявить в моче здоровых лиц сотни различных белков, принадлежащих большинству тканей организма человека. Вариабельность белкового состава мочи здорового человека зависит от возраста обследуемого, характера рациона питания, уровня двигательной активности. Выявлено 23 белка, которые чаще обнаруживаются в моче с увеличением возраста обследуемых (p<0.05). Отмечается корреляция между возрастом добровольцев и числом белков (R=0.566; p-value=1.24E-05), а также их массой (R=0.429; p-value=0.00079).

Во время 520-суточного пребывания добровольцев в контролируемых условиях в моче постоянно выявлялись 7 белков, синтезируемых преимущественно печенью и клетками крови.

Изменения в уровне солепотребления в физиологическом диапазоне значений позволили выявить 21 белок, достоверно коррелирующий с режимом солепотребления в контролируемых условиях жизнедеятельности на протяжении 105 суток. Биоинформационный анализ протеомных данных методом построения самоорганизующихся карт показал, что эффекты, вызванные изменением солепотребления, проявлялись в изменении активности различных биологических процессов, протекающих с участием выявленных белков. При потреблении соли 12 г/сут отмечена максимальная активностью синтеза белка (27%), а при 6-9 г/сут отмечалось снижение на 7% синтеза белка.

По данным протеомных исследований мочи, ранний период пребывания в условиях антиортостатической гипокинезии, активируются процессы свертывания крови, протеолиза, фибринолиза, регуляции клеточной адгезии и подавляется активность пролиферации клеток соединительной ткани. В процессе 3-х недельного воздействия активизируются протеолиз, обмен олигосахаридов, но снижается активность процессов образования АФК, ангиогенеза, тромбоцитарного гомеостаза, регуляции АД.

В условиях АНОГ в моче выявлено 9 белков - «минорных» участников регуляции водного баланса организма и 22 белка, участвующих в регуляции костно-мышечной системы. Большинство из них не исследовались ранее применительно к адаптации организма. Белковая композиция мочи за неделю восстановительного периода не возвращалась к фоновым значениям, что указывает на инертность биологических процессов, в которые были вовлечены данные белки.

Изменения белкового состава мочи здоровых лиц в условиях «сухой» иммерсии свидетельствуют о модификации функций почек, а также развитии дисфункции эндотелия сосудов. В этих условиях выявлено 9 белков, осуществляющих свои функции в ССС системе.

В белковом составе мочи космонавтов после завершения продолжительных полетов выявлены специфические белки, участвующие в процессах реадаптации к земным условиям. Биоинформационный анализ позволил связать известные физиологические особенности состояния космонавтов в первые сутки после завершения полетов с этими белками.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Агаджанян Н.А. Количественная оценка функционального состояния организма. Проблемы адаптации и учение о здоровье: учеб. пособие / Н.А. Агаджанян, Р.М. Баевский, А.П. Берсенева // М.: Изд-во РУДН. - 2006. - С. 145 - 146.

Агрон И.А. База данных по точным массово-временным меткам для хромато-масс-спектрометрического анализ протеома мочи / И.А. Агрон, Д.М. Автономов, А.С. Кононихин и др. // Биохимия. - 2010. - Т.75. - №4. - С. 598 - 605.

Агуреев А.Н. Разработка и апробация системы обеспечения питанием экипажа проекта «МАРС-500» / А.Н. Агуреев, Л.А. Сидоренко // Международный симпозиум по результатам экспериментов, моделирующих пилотируемый полет на Марс. (МАРС-500). Сборник материалов. - 2012. - С. 5 - 6.

Акбашева О.Е. Ингибиторы протеиназ в регуляции плазменного и внутриклеточного протеолиза: автореферат дисс. доктора мед. наук / О.Е. Акбашева.- Томск. 2011. - 42 c.

Аксенова Т.А. Роль дисфункции эндотелия и вкусовой чувствительности к поваренной соли в развитии гипертрофии левого желудочка у больных гипертонической болезнью. / Т.А. Аксенова, В.В. Горбунов // Сибирское медицинское обозрение. - 2013. - № 2. - С. 27 - 30.

Алексеев А.В. Современные биомаркеры острого повреждения почек / А.В. Алексеев, А. Гильманов, А.Ж. Ильманов, Р.С. Гатиятуллина и др. // Вестник Татарстана . - 2014. - Т. 7 (583). С. 22 - 27.

Алексеенко Л.Л. Реакция стволовых клеток человека на тепловой стресс: автореферат дисс. канд. биол. наук / Л.Л. Алексеенко.- Санкт-Петербург. 2014. - 26 c.

Альфонсов В.В. Влияние гиподинамии на свертывание крови, фибринолиз и сосудисто-тромбоцитарный гемостаз / В.В. Альфонсов, Е.В. Альфонсова // Ученые записки Забайкальского государственного университета. Серия: Естественные науки. - 2010. - Вып. № 1. - С. 13 - 19

Аль Касем Амин. Динамика уровня лептина, модулятора роста TGF-B1 и противовоспалительного цитокина IL-1 в системном кровотоке у больных псориазом с избыточной массой тела под влиянием системной терапии ожирения / Аль Касем Амин // Таврический медико-биологический вестник. - 2012. - Т.15. - № 2. - С. 14 - 18.

Андронов Е.В. Роль оксида азота в регуляции микроциркуляторного звена системы гемостаза / Е.В. Андронов, В.Ф. Киричук, А.Н. Иванов, Н.В. Мамонтова // Саратовский научно-медицинский журнал. - 2007. - Т. 3 (17). - С. 39 - 44.

Аронов Д.М. Атеросклероз и коронарная болезнь сердца / Д.М. Аронов, В.П. Лупанов // М. Триада-Х. Изд. 2-е, переработ. -2009. - 248 с.

Артюхов В.Г. Апоптоз и некроз лимфоцитов, индуцированные ультрафиолетовым облучением в присутствии аутологичной плазмы / В.Г. Артюхов, О.В. Земченкова, О.В. Башарина и др. // Цитология. - 2014. - № 1. - С. 77 - 83.

Арутюнян Т.В. Действие гиперсолевой диеты на активность ангиотензинпревращающего фермента и образование активных форм кислорода в аорте крыс / Т.В. Арутюнян, А.Ф. Корыстова, Л.Н. Кублик и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 156. - № 12. - С. 723 - 728.

Афанасьев М.А. Эффекты реальной и моделируемой микрогравитации на некоторые структурно- метаболические параметры скелетных мышц / М.А. Афанасьев, С.Л. Кузнецов // Вестник РАМН. - 2013. - № 1. - С. 47 - 51.

Афонин Б.В. Влияние космических полетов и условий антиортостатической гипокинезии различной продолжительности на концентрацию инсулина в крови. / Б. В. Афонин // Космическая биология и авиакосмическая медицина. - 1989. - Т. 23 - № 3. - С. 77 - 79.

Афонин Б.В. Система пищеварения. Послеполетные клинико-физиологические исследования Орбитальная станция «Мир» / Б.В. Афонин // М.: Аником, - 2001. - Т. 1. - С. 620 - 628.

Афонин Б.В. Изменения толерантности к глюкозе и состояния пищеварительной системы при длительном пребывании в условиях гермообъекта орбитальной станции. Модельный эксперимент с длительной изоляцией: проблемы и достижения / Б.В. Афонин., И.А. Ничипорук, А.М. Зякун и др. // М.: Слово. - 2001. - C. 238 - 251.

Бабиченко И.И. Новые методы иммуногистохимической диагностики опухолевого роста / И.И. Бабиченко, В.А. Ковязин // Учеб. пособие. М. РУДН. - 2008. - 109 с.

Бабкин А.П. Роль поваренной соли в развитии артериальной гипертензии / А.П. Бабкин, В.В. Гладких // Международный медицинский журнал. Клиника. Диагностика. Лечение. -2009. - № 3. - С. 40 - 45.

Баевский Р.М. Вегетативный баланс и адаптация к условиям длительного космического полета по данным 24-часового мониторирования сердечного ритма / Р.М. Баевский, В.В. Богомолов, А.Л. Гольдбергер и др. //Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2000. - №1. - С. 23 - 26.

Баевский Р.М. Концепция физиологической нормы и критерии здоровья / Р.М. Баевский // Российский физиологический журнал. - 2003. - № 4. - С. 473 - 487.

Баевский Р.М. Проблема оценки и прогнозирования функционального состояния организма и ее развитие в космической медицине / Р.М. Баевский // Успехи физиологических наук. - 2006. - № 3. - С. 42 - 57.

Баевский Р.М. Исследования вегетативной регуляции кровообращения в условиях длительного космического полета / Р.М. Баевский, Е.С. Лучицкая, И.И. Фунтова и др. // Физиология человека. - 2013. - № 5. - С. 42 - 52.

Барабой В.А. Биоантиоксиданты / В.А. Барабой // Киев. Книга плюс. - 2006. - 462 с.

Баранов А.А. Протокол ведения пациентов с ювенильным артритом / А.А. Баранов, Е.И. Алексеева, Т.М. Базарова и др. // Вопросы современной педиатрии. - 2013 - Т. 12 (1). - С. 37 - 56.

Баринов Э.Ф. Гастроинтестинальные миофибробласты - роль в регуляции физиологической активности и репарации желудочно-кишечного тракта / Э.Ф. Баринов, О.Н. Сулаева // РЖГГК. - 2010. - Т. 20. - №3. - С. 9 - 18.

Баркаган З.С. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза / З.С Баркаган, А.П. Момот // Издание 3-е.М.: "Ньюдиамед".- 2008. - 292 с.

Батюшин М.М. Поражение почек при эссенциальной артериальной гипертензии / М.М. Батюшин, И.М. Кутырина, С.В. Моисеев с соавт. // Глава в книге «Нефрология. Национальное руководство» под редакцией Н.А. Мухина - М. ГЭОТАР-Медиа. - 2009.- С. 434 - 446.

Белова О.В. Роль цитокинов в иммунологической функции кожи. / Белова О.В., Арион В.Я., В.И. Сергиенко //Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2008. - №1. - С. 41-55.

Бельтюков П.П. Состояние системы комплемента человека после протеолитической обработки in vitro / П.П. Бельтюков, Л.В. Галебская, Н.Б. Симкина // Вестник Московского Университета. Серия 2. Химия. - 2003. - Т. 44. - № 1. - С. 24 - 27.

Биохимия. Учеб. для вузов. Под ред. Е.С. Северина. - 5-е изд., испр. и доп. / Е.С. Северина. - М. ГЭОТАР - Медиа. - 2013. - 768 с.

Бышевский А.Ш. Связь гемостаза с перекисным окислением липидов / А.Ш. Бышевский, М.К. Умутбаева, Р.Г. Алборов / А.Ш. Бышевский.- М. Мед. Книга. - 2003. - 96 с.