Протеомный профиль мочи здорового человека в норме и при действии факторов космического полета

Среди 9 сверхпредставленных тканей (плазма, печень, желчь, моча, слюна, поджелудочная железа, лимфоциты, мочевой пузырь) встречающихся в эксперименте, специфическими являются на 5 сутках эксперимента семенные пузырьки, на 21, +1 и +6 сутках восстановительного периода - почки.

Определены 18 белков, участвующие в процессе «regulation of body fluid level», выделены 7 постоянных: альфа-1-антитрипсин, кининоген-1, эпидермальный фактор роста, альбумин, ингибитор протеаз плазмы C1, лизосом-ассоциированный мембранный гликопротеин- 2, CD44 антиген не изменяется в течение эксперимента, а так же динамика и функции вариабельных протеинов: витамин К-зависимый белок, мультимерин-1, витамин К-зависимый белок Z, кластерин, тромбоцитарный гликопротеин VI, эндотелиальный рецептор протеина С, просапозин, альфа цепь фибриногена, антитромбин 3, серотрансферин, фибронектин. К 6 суткам восстановительного периода белковая композиция процесса «regulation of body fluid level» возвращается к фоновым значениям.

Выявлено 9 белков, принимающих участие в работе почек. При сравнении белковой композиции мочи 21 суточной АНОГ с таковой после длительных космических полетов было показано, что, в моче добровольцев не обнаруживаются аквапорин-2 и афамин, что, возможно, связано с более длительными и значимыми воздействиями на организм космических полетов. От количества аквапорина-2 зависит повторное всасывание воды почками и, как следствие, количество выделяемой мочи, а так же, вероятно, выделяемого с мочой кальция, а афамин играет важную роль в защите от окислительного стресса, являясь антиоксидантом и антиапоптотическим белком.

Была определена динамика 13 белков, принимающих участие в работе сердечно-сосудистой системы. Тиоредоксин, как белок сердечно-сосудистой системы, так и стресс-индуцируемый белок, защищает клетки от различных видов повреждений, появляется в моче добровольцев на 16 сутки эксперимента и исчезает к 3 суткам восстановительного периода. В моче космонавтов этот белок появляется только на +1сутки восстановительного периода. Возможно, он появляется в моче космонавтов ранее, однако, нет возможности исследовать белковую композицию мочи во время космического полета.

Была определена динамика 22 белков, принимающих участие в работе костно-мышечной системы. Постоянными из них являются простат - специфический антиген, витронектин, кадгерин, тетранектин, миелоидный клеточно-специфический богатый лейцином гликопротеин, CD44 антиген, остеопонтин, макрофагальный колониестимулирующий фактор 1, несекреторная рибонуклеаза, муцин-1, эпидермальный фактор роста, фруктозо-1,6-бисфосфатаза. Белок S100-A8 известный также как кальгранулин А, появляется только на первые и шестые сутки после эксперимента, является специфическим белком первых суток восстановительного периода.

3.5 Изучение взаимосвязи между состоянием сердечно-сосудистой системы, водно-солевого обмена и протеомом крови и мочи в эксперименте

с 5-суточной «сухой» иммерсией

Более срочная реакция перераспределения жидкостных сред тела человека, чем в АНОГ, наблюдается в «сухой» иммерсии [Буравкова Л.Б., Ларина И.М., Попова И.А., 2003; Ларина И.М. с соавт., 2008]. Считают, что иммерсия является моделью, воспроизводящей этот эффект с высокой степенью соответствия данных изменений таковым в космическом полете. Условия иммерсии индуцируют заметное ухудшение функций сердечно-сосудистой системы, вызывая тахикардию покоя и уменьшение ударного объема, а также другие изменения [Иванов Г.Г. с соавт., 2011; Bart V. et al., 2007].

Обследование 14 здоровых добровольцев, принявших участие в эксперименте по воздействию условий «сухой» иммерсии, выполнялось с целью изучения адаптационных механизмов сохранения гомеостаза и для оценки функционального состояния сердечно-сосудистой системы, водно-электролитного обмена при изучении протеомной композиции крови и мочи. Работы проводились совместно с лабораторией вегетативной регуляции кардио-респираторной системы, возглавляемой профессором Баевским Р.М. и лабораторией нейрососудистой биологии, Университета города Анже, Франция, под руководством Марка-Антуана Кусто.

Для имитации физиологических эффектов микрогравитации испытуемые погружались в воду, в положении лежа, до уровня верхней трети плеча (t воды = 33-34°C), но не соприкасались с ней, будучи отделенными, от воды водонепроницаемой свободно плавающей тканью. Образцы крови и мочи от участников испытаний были получены согласно протоколам экспериментов.

Ранее был проведен 7-суточный эксперимент, моделирующий условия безопорности, с участием 5 здоровых мужчин-добровольцев (в возрасте 22,9±0,5 года, М±m), которые не подвергались никаким дополнительным воздействиям. Была выявлена быстрая потеря жидкости и натрия, а также потеря веса тела, которая была обусловлена снижением уровня гидратированности организма. Наиболее выраженные изменения наблюдались в первый день воздействия иммерсии, в последующие дни устанавливался новый уровень водно-электролитного обмена. Уменьшение осмоляльности мочи отражало повышенную экскрецию воды, но не электролитов [Navasiolava N.M. et al., 2011]. Некоторое увеличение креатинина в плазме, скорее всего, было связано с изменениями белкового обмена мышечной ткани при гиподинамии и снижении мышечного тонуса. Выраженная тахикардия при ортостазе, а также обнаруженные изменения электрофизиологических характеристик миокарда и гиповолемия во время СИ, поддержали гипотезу увеличения нагрузки на сердце в период восстановления на фоне детренированности [Ларина И.М. с соавт., 2011; Navasiolava N.M. et al., 2011]. Методом двумерного электрофореза обедненной фракции плазмы крови, собранной в этом эксперименте, с последующей масс-спектрометрией анализа пептидных фрагментов было выявлено достоверное увеличение уровня аполипопротеинов А-I, A-IV и E в период реадаптации по сравнению с фоном и 7-м днем пребывания в иммерсии. В то же время, происходило снижение уровня б-, в-фибриногена, фактора С4В комплемента и сывороточного амилоида Р [Трифонова О.П. с соавт., 2010]. Кроме того, при изучении протеомного профиля сыворотки крови отмечалось достоверное снижение площади пика ангиотензина II на 7-ые сутки эксперимента (m/z=1051 Да). Данные изменения указывают на сдвиги в работе ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, направленные на снижение объема циркулирующей в организме жидкости [Pakharukova N. et al., 2011; Villanueva J. et al., 2006]. Ранее было установлено, что «сухая» иммерсия вызывает ускоренное выведение жидкости, электролитов (натрия) и снижение объема циркулирующей плазмы [Ларина И.М. с соавт., 2008; 2011].

Прямое протеомное профилирование сыворотки крови показало, что на 7-ые сутки «сухой» иммерсии площади пиков фрагмента высокомолекулярного кининогена (m/z=2133 Да) и фрагмента комплемента С3 (m/z=1350; 1449 Да) достоверно уменьшились по сравнению с фоном. Площади пиков аполипопротеина СIII (m/z=9133; 9419 Да) и фрагмента комплемента C4a (m/z=3206 Да) были повышены на 7-ые сутки иммерсии. К 7-ым суткам периода реадаптации площади всех изменившихся пиков не возвращались к фоновым значениям, что свидетельствует о неполном восстановлении белковой композиции крови [Pakharukova N. et al., 2011]. Глубина всех изменений имела значительные индивидуальные различия. Таким образом, обнаруженные изменения протеомного профиля сыворотки крови указывают на перестройку гормональной и иммунной систем, а также метаболизма липидов.

Исследования в 5-суточной СИ преследовали цель подтверждения результатов, полученных в ходе 7-суточной «сухой» иммерсии, а так же получение дополнительной информации об адаптационных механизмах сохранения гомеостаза с помощью протеомных методов, как в крови, так и в моче, на уровне белков, выполняющих функции в ССС, тканей почек и мочевыводящей системы.

В эксперименте с 5-ти суточной «сухой» иммерсией принимало участие 14 здоровых некурящих мужчин (возраст 25 ± 1 год, рост 174 ± 1 см, вес 67.9 ± 1.5 кг; M ± m). Испытуемые проходили пассивный ортостатический тест до СИ и в периоде восстановления после ее завершения. Все участники были разделены на 2 группы по 7 человек. У первой группы ортостатический тест был в день подъема из иммерсионной ванны, у второй - на следующий день. Давление крови и частота сердечных сокращений (ЧСС) (с использованием сфигмоманометра) определялись ежедневно в 8 утра. Начало и конец иммерсии приходилось10 утра, поэтому утренние измерения в первый день проводились до иммерсии, во время иммерсии, после окончания воздействия.

3.5.1 Исследования водно-электролитного обмена в 5-суточной СИ

За первые 24 часа иммерсии объем плазмы уменьшился на 17-18% и сохранялся на низком уровне до конца иммерсии. Расчет объем циркулирующей плазмы (ОЦП) по концентрации общего белка плазмы также обнаружил снижение объема плазмы во время иммерсии, но менее выраженное, примерно на 7-8%. На второй день восстановления объем плазмы, подсчитанный тремя методами, не отличался от фоновых значений (рис. 5).

Рисунок 5. Изменения объема плазмы в процентах от объема плазмы фона, вычисленные через гемоглобин и гематокрит (Hb и Hct), только через гематокрит (Hct) и белки плазмы. Ф - фон; ИМ - «сухая иммерсия»;

В - восстановление. Представлены средние значения ± стандартная ошибка;

* p<0.05 по сравнению с фоном.

Потребление воды варьировало в течение эксперимента незначительно. Диурез увеличился примерно на 90% на 1 день, и оставался на этом уровне в течение иммерсии. Частичный водный баланс на 1 день становился отрицательным, и оставался таковым в течение всей иммерсии. На первый день восстановления наблюдалось компенсаторное уменьшение диуреза и увеличение водного баланса (табл. 31).

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Таблица 31. Потребление воды, диурез, частичный водный баланс и биохимия мочи до, во время и после 5 суточной СИ.

Примечание: Ф- фон; ИМ - «сухая иммерсия»; В - период восстановления после СИ. Представлены средние значения ± стандартная ошибка; * p<0.05 против В-1.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Потеря натрия с мочой возросла в начале СИ (с двукратным увеличением на 1 сутки), затем уменьшилась в период восстановления (с 3-кратным уменьшением на первый день окончания), динамика экскреции хлора мочи была сходной. Экскреция калия с мочой имела незначительные изменения, соотношение Na+/K+ в моче увеличилось значительно только на 1 сутки. Окончание иммерсии сопровождалось уменьшением соотношения Na+/K+. Осмоляльность мочи уменьшилась во время иммерсии со значительным падением показателя на 3-и сутки, тенденция от p=0.07 до 0.09 на 1, 2 и 4 день, с незначительным различием в сравнении с восстановлением, мочевина и креатинин мочи изменялись незначительно. Клиренс креатинина во время эксперимента не изменялся. Клиренс осмотически свободной воды изменялся незначительно в течение эксперимента, осмотически активных веществ во время иммерсии уменьшился.

Методом измерения мультичастотного импедансана получали параметры распределения жидкости по компартментам. Динамика объемов жидкостных компартментов тела показана на рис. 6.

Рисунок 6. Изменения жидких компартментов. Им - «сухая иммерсия»;

В - восстановление. Представлены средние значения ± стандартная ошибка; * p<0.05 против фона.

Внеклеточная жидкость уменьшилась в начале иммерсии на 5.1 ± 1.3%, с максимальным падением показателя на 7.8 ± 1.4% к 3-им суткам. В абсолютных значениях объем внеклеточной жидкости уменьшился на 3 день на 1.4±0.3 л. Общая вода организма также уменьшилась примерно на 1.6 л на 3-и сутки и оставалась на этом уровне на 5 сутки эксперимента. В период восстановления уже через 7 часов после окончания СИ, показатели объемов внеклеточной жидкости и общей воды тела не отличались значительно от уровня фона. Внутриклеточная жидкость показала незначительные вариации в ходе эксперимента и уменьшилась примерно на 3% на В+1 день. Уровень в крови Na+, K+, Cl-, Ca2+ белков, мочевины, креатинина и осмоляльность оставались в пределах нормы. СИ сопровождалась значительным увеличением содержания K+, Ca2+ и белков крови. Мочевина крови слегка уменьшилась в начале СИ, и немного увеличилась через 24 часа после её окончания (табл. 32).

Таблица 32. Биохимия крови до, во время и после сухой иммерсии

Примечание: Ф - фон; ИМ- «сухая иммерсия»; В - восстановление; представлены средние значения ± стандартная ошибка; * p<0.05 против фона.

Таким образом, весь комплекс выполненных исследований позволил достаточно полно охарактеризовать гидротационный статус организма и водно-электролитный гомеостаз. Так, импедансометрические исследования показали достоверное снижение общей жидкости организма на 3-й день пребывания в иммерсионной ванне по сравнению с фоном (на 3,8±1,0 %, p=0.012), что в абсолютных цифрах составляет около 1,6 л. Содержание внеклеточной жидкости также снижалось, начиная с первых суток, причем максимальное снижение (в среднем по группе на 7,8±1,4%) наблюдалось на 3-и сутки эксперимента. В восстановительном периоде (0-е и 1-е сутки) наблюдалась явная тенденция к сокращению потерь, как общей жидкости тела, так и внеклеточного её сектора по сравнению с периодом «сухой» иммерсии. ОЦП, который измерялся по динамике гемоглобина и гематокрита, достоверно снижался в среднем на 17,8±2,7% через 24 часа после погружения в иммерсионную ванну (p<0,001) и оставался сниженным до конца пребывания в иммерсии. На 2-е сутки восстановления объем плазмы не отличался от исходного. Колебания объема внутриклеточной жидкости в период иммерсии и восстановления были в пределах 2-3% и достоверно не отличались от фона, что свидетельствует о том, что изменения гидратационного статуса во время «сухой» иммерсии не затрагивают тканевой метаболизм. Следовательно, снижение содержания общей жидкости организма происходило, главным образом, за счет потери внеклеточной жидкости. Тощая масса тела за 4 суток иммерсионного воздействия незначительно уменьшилась у всех испытателей, а количество жира, наоборот, превысило фоновый уровень. При этом нормированное на массу тела количество общей жидкости организма снижалось на 4-е сутки эксперимента.

Следовательно, при «сухой» иммерсии происходило увеличение жировой составляющей массы тела, а поскольку жировая ткань практически не содержит жидкости, то увеличение жира создавало впечатление большей потери жидкости и тощей массы тела. Таким образом, можно заключить, что по данным импедансометрии масса тела испытателей практически не изменялась на 4-е сутки эксперимента на фоне снижения уровня гидратации организма [Coupй M. et al., 2013].

3.5.2 Исследование сердечно-сосудистой системы в 5-суточной СИ

ЧСС и давление крови в состоянии покоя до СИ оставались в пределах нормы. ЧСС немного уменьшилось в начале СИ, а систолическое давление крови было несколько ниже в конце эксперимента (табл. 33).

Таблица 33. Утреннее кровяное давление и ЧСС до, во время и после сухой иммерсии.

Примечание: Ф- фон; ИМ- сухая иммерсия; В- восстановление; SBP- систолическое давление крови; DBP- диастолическое давление крови; ЧСС- частота сердечных сокращений; представлены средние значения ± стандартная ошибка; * p<0.05 против Ф-1.

Изучение параметров гормональной регуляции показало, что активность ренина плазмы, через 24 часа после начала СИ уменьшилась вдвое, а концентрация BNP в плазме - увеличилась в четыре раза, альдостерон плазмы не изменялся. Через 24 часа после окончания СИ наблюдали двукратное увеличение активности ренина и трехкратное - содержания альдостерона. На четвертый день восстановления активность ренина и уровень альдостерона не изменялись, а BNP значительно увеличилось (Рисунок 7).

Рисунок 7. Альдостерон крови, ренин и BNP до, во время и после иммерсии. Ф - фон; ИМ - «сухая иммерсия»; В - восстановление. Представлены средние значения ± стандартная ошибка; * p<0.05 против фона.

До СИ только 1 испытуемый из 14 не завершил 20-минутный стандартый тест. После СИ (на R0 день), 4 из 7 испытуемых не смогли его завершить. Однако, испытатели (7 человек), у которых ортопроба была на следующий день (R+1) выполнили тест полностью. Измерения в день ортопробы после иммерсии по сравнению с фоном до эксперимента, проводившиеся в положении лежа на спине, показали значительное увеличение ЧСС и SBP, и тенденцию к увеличению DBP (р=0.058), общее периферическое сопротивление (TPR) (p=0.06) и сосудистое сопротивление кожи (SVR) (более, чем 2-кратное увеличение, р=0.063). Ударный объем (SV) уменьшился, а СО (сердечный выброс) оставалось неизменным. Измерения, проводившиеся в положении стоя, показали увеличение ЧСС и DBP и уменьшение SV после иммерсии, в то время как SBP, TPR, SVR и CО не изменялись. На В+1 день все гемодинамические значения не показали различия от уровня до иммерсии как в положении лежа на спине, так и в положении стоя. SVR в положении стоя было значительно выше, чем в положении лежа при всех измерениях, кроме измерений на R0 день (рис. 8) [Coupй M. et al., 2013].

Рисунок 8. ЧСС, ударный объем и общее периферическое сопротивление в положении лежа на спине и в конце ортопробы до 5-суточной сухой иммерсии, сразу после сухой иммерсии (группа R0) и через 24 часа после окончания сухой иммерсии (группа R+1). * p<0.05 против фона.

В данном эксперименте сотрудниками лаборатории Р.М. Баевского впервые изучались 24-х часовые изменения дисперсии микроколебаний электрокардиографии (ЭКГ). Для анализа использовались данные Холтеровского (суточного) мониторирования, из которых «нарезались» участки записи длительностью в 20-30 минут из каждого часа суточной записи и анализировались их средние значения при усреднении за каждые 4 часа мониторинга. Одновременно анализировалась частота ЧСС и амплитуда QRS-комплекса ЭКГ. При этом рассчитывали индекс метаболической адаптации (индекс ЧССмакс /ИММ макс).

Изменения ЭКГ сигнала при воздействии 5-суточной иммерсии отчетливо проявлялись, начиная с 3-х суток эксперимента. Вначале регистрировался достоверный рост амплитуды основных зубцов ЭКГ, особенно в ночной период (23-06 часов). При этом в интервале 22-02 часа отмечалось достоверное увеличение индекса «Миокард». В стандартном исполнении метода дисперсионного картирования анализ микроколебаний ЭКГ, характеризующих электрофизиологические свойства миокарда, проводится в 30-секундных отрезках с определением различных параметров [Иванов Г.Г., Сула А.С., 2009]. Наибольшие изменения этого индекса отмечались на 5-е сутки эксперимента в периоды 15-18 часов и с 22 часов до 10 часов утра. На 5-е сутки обращал на себя внимание выраженный рост ЧСС с 22 часов до 02 часов ночи и в утренние часы (07-10 часов). Однако, важно отметить, что изменения ЧСС в 1-е сутки эксперимента имели противоположный характер - наблюдалось отчетливое урежение ЧСС. Таким образом, выявлялась картина последовательного включения в реакцию на иммерсионное воздействие вначале электрических, а затем энерго-метаболических процессов в миокарде. Рост частоты пульса указывал на интегральный характер реакции сердечно-сосудистой системы. После эксперимента наблюдался выраженный рост частоты пульса в течение суток (до 100-108 уд/мин), который сопровождался достоверным увеличением амплитуды зубцов ЭКГ. Описанная картина изменений дает основание для обсуждения гипотезы о преимущественно, энерго-метаболическом генезе наблюдаемых реакций (рис. 9) [Иванов Г.Г. с соавт., 2011].

среднесуточные значения амплитуды QRS- комплекса (ЭКГ)

среднесуточные значения нормализованного индекса «миокард» (м-н)

среднесуточные значения частоты пульса в эксперименте с 5-суточной «сухой» иммерсией.

Рисунок 9. Среднесуточные значения амплитуды QRS- комплекса (ЭКГ), нормализованного индекса «миокард» (м-н) и частоты пульса в эксперименте с 5-суточной «сухой» иммерсией.

Изучение функции автономной нервной системы показало, что экскреция эпинефрина и норметанефрина с мочой не изменялись значительно в течение эксперимента. Выведение метанефрина с мочой уменьшалось во время восстановления. Экскреция норэпинефрина мочи обнаруживала тенденцию к увеличению во время первой половины иммерсии (1 день, р=0.076; 2 день, р=0.072; 3 день, p<0.05). Выведение дофамин также выявляло тенденцию к увеличению во время первой половины иммерсии (1 день, р=0.08; 2 день, р=0.09) с тенденцией к уменьшению на R0 день (р=0.07) (Таблица 34).

Таблица 34. Катехоламины мочи до, во время и после сухой иммерсии.

Примечание: Ф - фон; ИМ- «сухая иммерсия; В- восстановление;

представлены средние значения ± стандартная ошибка; * p<0.05 против В-1.

Значительных различий в вариабельности спектре симпатического индекса и чувствительности спонтанного барорефлекса до и после иммерсии (на R0 и R+1 день) не выявлялось (

Оценка спонтанного барорефлекса в позиции стоя показала тенденцию к уменьшению на R0 день, но не на R+1 день.

Вес тела во время СИ уменьшился примерно на 700-800 г. Это уменьшение было значительным на 2 и 3 день, при этом 4 и 5 день тенденция к уменьшению сохранялась (р=0.06). Во время восстановления не было каких-либо значительных изменений веса тела. Все исследуемые значения параметров крови, имеющие отношение к метаболизму, были в пределах нормы. Уровни инсулина, оценка инсулинрезистентности (HOMA-IR), содержание лептина и фракции LDL- и HDL-холестерола увеличились во время СИ. На второй день восстановления эти значения не отличались от фоновых. Уровни глюкозы и триглицердов натощак изменились незначительно во время СИ (табл. 35).

Таблица 35. Метаболические показатели крови до, во время и после сухой иммерсии.

Примечание: Ф - фон; ИМ - «сухая иммерсия»;

В- восстановление; представлены средние значения ± стандартная ошибка; * p<0.05 против фона.

Как следует из приведенных данных, свободный кортизол мочи немного увеличился во время иммерсии (значительно на 2 день и 4 день) и не изменялся в период восстановления (рис. 11).

Рисунок 11. Свободный кортизол мочи до, во время и после сухой иммерсии. Представлены средние значения ± стандартная ошибка; * p<0.05 против В-1.

Таким образом, результаты, полученные в эксперименте, показали, что в течение 5-суток СИ общее содержание воды тела уменьшилось (на 3-4%), главным образом за счет внеклеточного компартмента (уменьшение на 6-8%) и быстро стабилизируется на новом уровне. Пять дней СИ было достаточно, чтобы метаболизм замедлился, уменьшилась глюкозотолерантность и выявилась гиперхолестеролемия, без изменений вегетативной нервной системы. СИ продолжительностью в 5 суток индуцировала заметное ухудшение сердечно-сосудистой системы, изменяя ортостатическую устойчивость при подъеме из иммерсионной среды, которая быстро компенсируется (через 24 часа после возвращения к нормальным условиям). Осмоляльность внеклеточной жидкости остается стабильной в течение СИ, свидетельствуя о том, что не происходит значительных изменений, касающихся внутриклеточного объема. Главные изменения, происходящие в ответ на сухую иммерсию, касаются внеклеточной жидкости, а именно внутрисосудистой и тканевой жидкости. Фундаментальные работы по изучению регуляции жидкостей организма во время краткосрочной водной иммерсии представлены в работе Gauer-Henry и Epstein [Epstein M.J., Blatteis C.M., 1996]. Водно-электролитные изменения при иммерсии вызваны застоем в центральных сосудах: гидростатическое давление снижает объем сосудов периферии и сдвигает баланс Старлинга (Starling) в сторону уменьшения абсорбции тканевой жидкости (гемодилюция), что приводит к центральной гиперволемии. Через 24 часа после начала СИ все еще продолжалось воздействие системных регуляторов (подтверждено 2-кратным уменьшением активности ренина плазмы и 4-кратным увеличением BNP), но через 48 часов иммерсии основные процессы перераспределения заканчиваются и концентрации гормонов возвращаются к доиммерсионному уровню и остаются таковыми до конца СИ [Coupй M. et al., 2013]. Увеличение содержания BNP на четвертый день восстановления может быть не связано непосредственно с регуляцией жидкостных объемов тела и гемодинамикой, а скорее отражает увеличение нагрузки на сердце после периода снижения физической активности во время СИ. Ранее похожее увеличение содержания NT-proBNP, которое отражает содержание BNP, наблюдалось на 4 день восстановления после 7-суточной СИ [Navasiolava N.M. et al., 2011]. Отсутствие увеличения BNP в первые 24 часа периода восстановления может отражать необходимость восполнить воду и компенсировать гиповолемию, что приоритетнее, чем необходимость «разгрузки» нетренированного сердца. Уменьшение объема плазмы, рассчитанное с помощью концентрации общего белка плазмы, составило как минимум 1/3 от значения, вычисленного на основе показателей Hct или Hb и Hct. Эту разницу можно объяснить частичным переносом альбумина (который составляет примерно 60% от общего пула белков) в тканевую жидкость. Во время иммерсии, когда имеет место давление внешних слоев ткани и постоянная транскапиллярная «аутотрансфузия» [Krasney J.A., Blatteis C.M.,1996], увеличивается потеря тканевой жидкости. Чтобы ограничить дегидрацию ткани, альбумин плазмы, по-видимому, должен перейти в тканевую жидкость и чтобы увеличить ее осмотическое давление. Частичный переход белков из плазмы в тканевую жидкость предотвращает дальнейшее уменьшение объема интерстиций, что ограничивает потерю жидкости и обеспечивает ее адекватное перераспределение между внутри - и внесосудистыми секторами [Gogolev K.I., Aleksandrova E.A., Shul'zhenko E.B., 1980]. Белки плазмы могут накапливаться вне сосудов, и, если необходимо, быстро возвращаться в сосуды, чтобы восстановить потерю белков плазмы. Это было показано экспериментами с сухой иммерсией и АНОГ, в которых пул белков плазмы был восполнен в период восстановления со скоростью, превышающей скорость синтеза de novo [Chaika A.M., Balakhovskii I.S., 1982]. Условия СИ, с одной стороны, возможно, увеличивают симпатическую активность из-за гиповолемии и стресса, а с другой стороны, уменьшают ее из-за физической неактивности. Большинство работ по СИ говорит о том, что эти условия увеличивают симпатическую активацию [Navasiolava N.M. et al., 2011]. Мы, однако, не наблюдали выраженных изменений активности вегетативной нервной системы. Вариабельность ЧСС оставалась неизменной, хотя чувствительность барорефлекса была несколько ослаблена. Концентрации катехоламинов мочи и их метаболитов изменялись незначительно.

Пять суток СИ индуцировали заметное ухудшение функций сердечно-сосудистой системы, вызвав тахикардию и уменьшение ударного объема в положении лежа и стоя. Наблюдаемая тахикардия и увеличение TPR совместно с сужением сосудов кожи помогают поддерживать давление крови в условиях уменьшенного объема крови. Более, чем 2-кратное увеличение SVR в положении лежа без увеличения SVR в положении стоя сразу после СИ может отражать напряжение систем, поддерживающих кровоток мозга. Метаболические эффекты СИ главным образом связаны с вынужденной физической неактивностью. СИ быстро ухудшает метаболизм глюкозы и липидный профиль, вызывая уменьшение чувствительности к инсулину и дислипидемию. Такие же изменения наблюдаются в экспериментах с постельным режимом. Важно заметить, что физическая неактивность даже в течение короткого периода может ухудшить метаболизм [Bergouignan A. et al., 2010; Blanc S. et al., 2010]. Увеличение свободного кортизола во время СИ может быть связано как с увеличением диуреза, так и стрессом, вызванным участием в эксперименте [Fenske M., 2006]. Ряд механизмов может участвовать в детренированности сердца, при СИ: потеря объема циркулирующей крови [Convertino V.A., 1996], ухудшение чувствительности барорефлекса [Convertino V.A., 2002], дисфункция вегетативной нервной системы [Convertino V.A., 2002; Mano T., 2005], уменьшение сократительной способности стенок сосудов [Convertino V.A., 1995], вызванное уменьшением мышечного тонуса [Григорьев А.И., Козловская И.Б., Шенкман Б.С., 2004], макрососудистая [Zhang L.F., 2001] и микрососудистая [Coupe M. et al., 2009] дизрегуляция, вызванная физической неактивностью и продолжительным уменьшением напряжения сдвига (share-stress) [de Groot P.C., Bleeker M.W., Hopman M.T., 2006], ослабление миокарда, гормональные изменения, вестибулярные изменения или изменения метаболизма [Ларина И.М., Суханов Ю.В., Лакота Н.Г., 1999; Ларина И.М. с соавт., 2008]. По-видимому, гиповолемия является главной причиной наблюдаемого быстрого ухудшения функций сердечно - сосудистой системы при СИ. Важность гиповолемии показана обратным взаимодействием между сокращением объема плазмы, вызванным микрогравитацией, и ортостатической устойчивостью [Convertino V.A., 1996]. Coyle с соавт. показали, что уменьшение SV, максимального потребления кислорода, увеличение ЧСС и общего периферического сопротивления, в положении стоя, после двух недель малоподвижного образа жизни (без тренировок) у мужчин, которые до этого интенсивно тренировались в течение нескольких лет, главным образом было следствием падения объема крови. При увеличении объема крови инфузией раствора декстрана спад работы сердечно-сосудистой системы после нескольких недель без тренировок был минимальным [Coyle E.F., Hemmert M.K., Coggan A.R.1986]. Интересно сравнить данную работу, в которой объема плазмы был нормализован спонтанно, с работами, в которых объем плазмы, был восстановлен по предписанию. Нормализация объема плазмы солью и водой после 12-суточного АНОГ препятствовала ортостатической гипотензии и изменениям гемодинамики и эндокринным изменениям в положении лежа, но не была эффективной в предотвращении тахикардии и гиперчувствительности к эпинефрину в вертикальном положении тела [Waters W.W. et al., 2005]. Восстановление объема плазмы флюдрокортизоном (синтетический минералокортикоид) после 7-суточной АНОГ значительно ограничило ортостатическую неустойчивость (только 1 из 7 испытуемых остался неустойчивым) и предотвратило изменения чувствительности барорефлекса [Vernikos J., Convertino V.A., 1994]. Использование бедренных манжет в 7-суточном АНОГ значительно (но не полностью) ограничило уменьшение объема плазмы и барорефлекторную чувствительность, однако, не смогло предотвратить ортостатическую неустойчивость [Custaud M.A., 2000].

3.5.3. Прямое профилирование сыворотки крови в 5-суточной СИ

При прямом профилировании образцов сыворотки крови, полученных в ходе эксперимента, было детектировано 175 пиков в диапазоне масс от 1000 до 17 000 Да после обработки магнитными частицами MB WCX. При этом были обнаружены достоверные отличия по 48 пикам (что составило 27,4% от всех пиков протеомного профиля) в масс-спектрах, по сравнению с фоновым периодом. После идентификации белков была проведена сравнительная оценка площадей их пиков на масс-спектрах, пропорциональная содержанию белка в образце. В результате выявлялось достоверное увеличение пиков фрагментов комплемента С3 (m/z=1779; 1449 Да) на 3-и и 5-е (m/z=1866,0) сутки эксперимента (рис. 12).

Рисунок 12. Фрагмент комплемента С3. Представлены средние значения ± стандартная ошибка; * p<0.05, на 5 сутки эксперимента.

Белок С3 является главным белком системы комплемента, он играет основную роль в активации системы комплемента по классическому и альтернативному путям [Sahu A., Lambris J.D., 2001]. На 1-е сутки (рис. 13) восстановительного периода достоверно увеличивались площади пиков белка С4а системы комплемента (m/z=1741,33; 3208,87 Да), что можно отнести к эффектам острофазной реакции.

Рисунок 13. Фрагмент комплемента С4. Представлены средние значения ± стандартная ошибка; * p<0.05, на 1сутки.

Хорошо известно, что при повышении протеолитической активности плазмы крови, белки системы комплемента могут подвергаться действию протеаз [Бельтюков П.П., Галебская Л.В., Симкина Н.Б., 2003]. После завершения длительных космических полетов были выявлены сдвиги в уровне белка С3 системы комплемента [Пахарукова Н.А. с соавт., 2010]. У одного из космонавтов обнаружено снижение концентрации С3 и С4 факторов комплемента после 16-ти суточного КП [Гусева Е.В., Ташпулатов Р.Ю., 1979]. У двух космонавтов было обнаружено увеличение и С3, и С4 фактора комплемента после 49-суточного полета [Гусева Е.В., Ташпулатов Р.Ю., 1980]. Отмечено увеличение С3 белка системы комплемента в условиях микрогравитации (28 суток) [Goncalves A. et al., 2006].

На 2-е и 3-и сутки (рис. 14) иммерсии происходило достоверное увеличение пика с m/z=1065, 96 Да.

Рисунок 14. Фрагмент брадикинина. Представлены средние значения ± стандартная ошибка; * p<0.05, на 2 и 3сутки эксперимента.

Пик соответствует брадикинину - физиологически активному пептиду, состоящему из 9 аминокислот, который образуется при действии калликреина на молекулу-предшественник - кининоген. Брадикинин быстро разрушается на неактивные метаболиты (время полужизни данного пептида invivo составляет всего 17 секунд, поэтому его концентрация в плазме крови и тканях изменяется в очень больших пределах [Villanueva J. et al., 2006].

Высокомолекулярный кининоген (фактор XV или фактор Фитцджеральда) относится к белкам системы гемостаза, участвует в активации фазы плазменного протеолиза, контролирует адгезию и активность тромбоцитов; подавляет активность цистеиновых протеиназ, препятствуя их деградирующему действию на плазменные белки при повреждении различных тканей [Goncalves A. et al., 2006; Villanueva J. et al., 2006]. Модулирует воспалительные и антитромботические реакции, создает важную регуляторную систему при взаимодействии плазменных белков с клетками крови и сосудистой стенки, принимает участие в процессе свертывания крови [Яровая Г.А., 2001].

Во всех изученных пробах было обнаружено достоверное увеличение фрагмента фибриногена (m/z = 2863,54Да) на 3-и и 5-е сутки эксперимента (рис. 15).

Рисунок 15. Фрагмент фибриногена. Представлены средние значения ± стандартная ошибка; * p<0.05, на 5сутки эксперимента.

Полученные результаты могут быть объяснены либо активацией протеолиза, либо значительным увеличением концентрации фибриногена. Некоторые авторы указывают на увеличение содержания фибриногена в крови после космических экспедиций [Фомин А.Н., 1981; Stein T.P., Leskiw M.J., 2000]. При острых воспалительных процессах в организме, стрессе и изменении уровня физической активности [Козлов А.А. с соавт., 2006]. Вероятно, что высокая степень эмоционального напряжения добровольцев на заключительном этапе эксперимента могла также повлиять на содержание фибриногена в крови [Пастушкова Л.Х. с соавт., 2011]. Кроме того, увеличение содержания данного белка может быть связано с адаптивным снижением объема циркулирующей крови [Фомин А.Н., 1981].

Достоверное увеличение на 5-ые сутки иммерсии и 3-и сутки восстановительного периода тромбоцитарного фактора IV (m/z = 7765 Да) (рис. 16), являющегося важным компонентом коагуляционного каскада, свидетельствует об увеличении активности системы сосудисто-тромобоцитарного (или первичного) гемостаза в крови [Баркаган, З.С., Момот, А.П., 2008].

Рисунок 16. Фрагмент тромбоцитарного фактора. Представлены средние значения ± стандартная ошибка; * p<0.05, на 5сутки эксперимента и 3 сутки восстановительного периода.

На 7-е сутки восстановительного периода было отмечено достоверное отличие по сравнению с фоном площади пика фрагмента высокомолекулярного кининогена (m/z=2134,8 Да) (рис. 17).

Рисунок 17. Фрагмент кининогена. Представлены средние значения ± стандартная ошибка; * p<0.05, на 7сутки восстановительного периода.

Таким образом, все вышеупомянутые белки относятся к белкам иммунной системы, "острой фазы" и системы коагуляции, которые выявляются в сыворотке крови и других биологических жидкостях и обладают различными физиологическими свойствами. Общей характеристикой белков данной группы является их выраженная опсонизирующая, антипротеолитическая и бактериостатическая активность, а также способность к связыванию свободных радикалов, усилению коагуляции крови и активации системы комплемента [Пахарукова Н.А., 2010; Пастушкова Л.Х. с соавт., 2011]. Возможно, что эти белки являются наиболее пластичной частью протеома сыворотки крови, чьи изменения наступают уже в период срочной адаптации. В работе Тигранян с соавт. показано, что острый период адаптации после кратковременных полетов связан с активацией протеолитических систем, главным образом с калликреин-кининовой системой (ККС), которая играет важную роль в регуляции активности каскадных протеолитических систем плазмы крови [Тигранян Р.А. с соавт., 1987].

3.5.4 Белки, выполняющие функции в сердечно-сосудистой системе

В результате прямого профилирования мочи в эксперименте было получено 213 пика в диапазоне масс от 1 000 Да до 10 000 Да, при этом 61 пик (или 28% из общего числа пиков) изменялся, очевидно, представляя наиболее пластичную часть мочевого протеома. Наибольшее количество изменений отмечено на 5-ые сутки эксперимента и сразу после окончания воздействия. Следует отметить, что все отмеченные на данных точках пики обладают разнонаправленными изменениями, характеризующимися как увеличением, так и уменьшением площади пика. На 8-ой день выхода из эксперимента отмечено наименьшее количество достоверно изменяющихся пиков, что можно связать с восстановлением и возвращением белковой композиции к фоновым значениям [Пастушкова Л.Х. с соавт., 2012].

После хромато-масс-спектрометрического анализа всех образцов мочи добровольцев было идентифицировано 256 различных белков (по номенклатуре UniProtKB). Далее из общего числа выявленных белков с помощью системы ANDSystem было выявлено 9 белков, участвующих в функциях сердечно-сосудистой системы (табл. 36).

Таблица 36. Белки мочи, выполняющие функции в сердечно-сосудистой системе во время сухой иммерсии (%).

Примечание: ММ - молекулярная масса; Ф - фон; ИМ - «сухая иммерсия»;

В- восстановление; n-число исследованных образцов.

К ним относились сывороточный альбумин, фетуин А, цистатин-С, Е-кадхерин, витамин D-связывающий белок, кининоген-1, калликреин-1, перлекан, эпидермальный фактор роста. В большинстве случаев эти белки экспрессировались в различных тканях: печени, почках, сердце, поджелудочной железе, селезенке, и попадали в мочу из крови. Один из них выявлялся в моче постоянно, вне зависимости от фазы эксперимента - альбумин.

Альбумин был аннотирован ранее в главе «Постоянно присутствующие белки в моче здоровых людей», цистатин - С - в главе «Анализ протеома мочи в АНОГ».

Фетуин А - кальций-связывающий белок, продуцируемый преимущественно в печени, является циркулирующим ингибитором сосудистой кальцификации. Циркулирующий в крови фетуин способен депонироваться в гладкомышечных клетках сосудов, что ингибирует их превращение в остеобластоподобные клетки [Земченков А.Ю., Герасимчук Р.П., 2009]. Отмечают, что низкие уровни фетуина в сыворотке крови являются фактором риска кальцификации артерий у больных с хронической почечной недостаточностью, также связаны с атеросклеротическими поражениями сердечно-сосудистой системы [Громова О.А. с соавт., 2011]. Wilund с соавт. предполагают, что постоянные физические упражнения могут одновременно подавлять кальцификацию коронарных артерий и повышать минеральную плотности костной ткани. Фетуин А положительно коррелирует с максимальным потреблением кислорода (р = 0,679, p <.05). Он тормозит патологические обызвествления в мягких тканях и сосудах, даже в условиях атеросклероза [Westenfeld R. et al., 2009]. Фетуин А играет важную роль в метаболических расстройствах, таких как резистентность к инсулину, сахарный диабет, ишемический инсульт и нейродегенеративные заболевания [Mori K., Emoto M., Inaba M., 2012]. У нокаутных по гену фетуина-А мышей наблюдается повышенная чувствительность к инсулину, высокий клиренс глюкозы, низкий уровень жирных кислот и триглицеридов в плазме крови [Ix J.H. et al., 2012]. В данном эксперименте уровень инсулина, лептина и фракции LDL- и HDL-холестерола увеличивались, а уровни глюкозы и триглицердов натощак изменились незначительно. На второй день восстановительного периода эти значения не отличались от фоновых показателей [Coupe M. et al., 2013]. Динамика присутственности в моче фетуина хорошо согласуется с этими данными.

E-кадхерин - мембранный белок, гликопротеин из надсемейства кадхеринов, кальций - зависимый белок клеточной адгезии. Он участвует в механизмах, регулирующих межклеточные контакты, подвижность и пролиферацию эпителиальных клеток [Agiostratidou G. et al., 2006]. Снижение уровня Е-кадхерина в моче отмечено на фоне нефропатического синдрома [Andersen R.F. et al., 2012]. Экспрессия Е-кадхерина широко выражена в дистальных канальцах и собирательных трубках нефрона, а благодаря его роли в межклеточных взаимодействиях. Он может вносить вклад в механизмы реабсорбции натрия и воды на фоне нефропатии, что объясняет его роль в ответе организма на перераспределение жидкости на фоне иммерсионного воздействия [Tani T. et al., 1995].

Выявление витамин-Д-связывающего белка было эпизодическим к концу СИ и сохранило тенденцию к повышению после иммерсии. Помимо основной функции, (регуляция костного метаболизма и фосфорно-кальциевого обмена), гормонально-активные метаболиты витамина Д играют важную роль в иммунной, сердечно-сосудистой системах, в углеводном обмене. Отмечена негативная корреляция между уровнем витамина Д и уровнем артериального давления, выраженностью атеросклероза коронарных артерий [Ших Е.В., Милотова Н.М., 2009]. Витамин D и его метаболиты оказывают протективные эффекты при различных сердечно-сосудистых заболеваниях: противовоспалительные и антисклеротические [Pilz S. et al., 2010], в предотвращении гипертрофии кардиомиоцитов [Artaza J.N., Sirad F., Ferrini M.G., Norris K.C., 2010], уменьшают агрегацию тромбоцитов и тромбообразование [Aihara K. et al., 2004]. Показано, что этот белок, наряду с аполипопротеином Е, альдолазой, может выступать в качестве биомаркера повреждения сосудов, что подтверждается в исследовании на лабораторных животных, выполненном методом двумерного электрофореза с последующем масс-спектрометрическим анализом. Показано, что на 2-ую и 5-ую неделю после повреждения сосудов, уровень витамин Д-связывающего белка снижался, по сравнению, с контрольной группой животных [Huang N.F., Lee R.J., Li S., 2010]. По-видимому, эпизодическое появление в моче на поздних сроках СИ и после нее, этого белка, скорее связано со снижением селективности для него клубочкового фильтра, чем является отражением динамики в крови. О правомерности такого заключения свидетельствуют данные авторов, выявлявших отрицательную корреляцию между уровнем витамина Д и активностью ренина плазмы [Xiang W. et al., 2005].

Перлекан - играет важную роль в формировании внеклеточного субэндотелиального матрикса и базальной мембраны сосудов, способствуя поддержанию барьерной функции эндотелия и его целостности за счет связывания с молекулами клеточной адгезии, подавляет пролиферацию гладкомышечных клеток и стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток посредством связывания факторов роста [Aplin J.D., 1997; Максименко А.В., Турашев А.Д., 2014].

Эпидермальный фактор роста - открытый в 60-х годах ХХ века американскими учеными, обнаружившими новый белок в коже, эпидермальный фактор роста является одним из самых распространенных белков протеома мочи [Nagaraj N., Mann M., 2011]. Исследователи EGF получили Нобелевскую премию в области биологии и медицины [Glogowska A. et al., 2012]. Этот белок был аннотирован ранее, в главе «Постоянно присутствующие белки в моче здоровых людей».

Кроме вышеперечисленных, среди белков сердечно-сосудистой системы, которые были выявлены с помощью программы ANDVisio, были обнаружены белки калликреин - кининовой системы: KNG1 - кининоген-1 и KLK1 - калликреин. Эта система является ключевой протеолитической системой, включающей калликреины, кининогены, рецепторы кининов, кининазы, участвующей в регуляции широкого спектра физиологических функций организма. Частота выявления в моче калликреина 1 (KLK1), снизившись вначале СИ, затем нарастала до 100% и не восстанавливалась до фоновых значений в течение недели после окончания иммерсии. KLK1синтезируется во многих органах, включая почки и артерии, где при его участии образуются вазодилататоры брадикинин и каллидин. В почках калликреины продуцируются в клетках дистальных канальцев, где и происходит высвобождение кининов [Ponticelli C., Meroni P.L. 2009]. Калликреин-кининовая и ренин-ангиотензиновая системы регулируют тонус сосудов и обеспечивают оптимальный уровень оксигенации тканей. Связь между этими системами осуществляется на уровне проренина, который активируется калликреином, а также ангиотензинпревращающего фермента, участвующего в деградации брадикинина и образовании ангиотензина II. Последний выполняет функцию вазоконстриктора и является основным маркером повреждения эндотелия сосудов, а брадикинин расширяет просвет сосудов [Yao Y. et al. 2012]. В настоящее время описано 4 основных вида рецепторов ангиотензина II. Наиболее интересными для нас являются рецепторы ангиотензина 1 типа, расположенные на эндотелии сосудов и опосредующие все основные сердечно-сосудистые эффекты ангиотензина. Ангиотензин II является одним из самых мощных вазоконстрикторов, что определяет его роль в патогенезе артериальной гипертонии [Минушкина Л.О...