Патофізіологічні механізми розвитку структурно-метаболічних і функціональних порушень за дії на організм оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних

Оксиетильовані нонілфеноли з числом оксиетильованих груп 4, 6, 8, 10, 12 (ОЕНФ4, 6, 8, 10, 12) - в'язкі рідини світло-жовтого кольору, добре розчинні в органічних розчинниках; ОЕНФ4, 6, 8 - мало розчинні, а ОЕНФ10, 12 - добре розчинні у воді; молекулярна маса коливається від 396 до 1320; щільність при 20?С - 1,00-1,025 кг/м3; за фізико-хімічними властивостями та особливостями будови молекул відносяться до неіоногенних СПАР. Загальна формула:

С9Н19-С6Н4О-(С2Н4О)nН

де n - ступінь оксиетилювання

Натрієві солі карбоксиметилатів оксиетильованих ізононілфенолів з числом оксиетильованих груп 4, 5, 6, 10 (КМ-ОЕНФ4, 5, 6, 10) - рідкі пасти світло-жовтого кольору, добре розчинні у воді і органічних розчинниках; молекулярна маса коливається від 474 до 727; щільність при 20?С - 1,025-1,030 кг/м3; за фізико-хімічними властивостями та особливостями будови молекул відносяться до аніонактивних СПАР. Загальна формула:

СН3-(СН2)8-С6Н4О-(СН2СН2О)n-СН2СООН

де n - ступінь оксиетилювання

Для досягнення мети та вирішення завдань дослідження опрацьовано поетапну програму (рис. 2.1).

2.2 Методи дослідження, що використовувалися в роботі

Вивчення механізмів дії ОЕНФ та їх похідних згідно з поетапною програмою досліджень проводили у під гострому експерименті (45 діб) на 330 статевозрілих щурах лінії WAG масою 180-220г, яких утримували у стандартних умовах віварію за постійної температури та природного освітлення у пластикових клітках на збалансованому харчовому раціоні. Щурів піддавали пероральній затравці за допомогою зонда водними розчинами речовин щоденно одноразово протягом 45 діб. Всі маніпуляції проводили в стандартних умовах з 900 до 1000. Тваринам контрольної групи вводили відповідні об'єми питної води. Дослідження показників проводили через 45 діб після початку експерименту. У кожній групі було по 15 тварин. Забій проводили шляхом декапітації гільйотинним ножем, попередньо анестезуючи тіопенталом натрію у дозі 50 мг/кг маси; швидко вилучали необхідні для дослідження печінку та головний мозок. Для виділення печінки щурів після декапітації фіксували на препарувальному столику та розрізали черевну порожнину. Печінку перфузували охолодженим розчином до повного видалення слідів крові; видаляли, вирізали ділянки сполучної тканини, просушували. Виділені органи заморожували та зберігали в рідкому азоті.



Рис. 2.1 Поетапна програма досліджень

Для розрахунку необхідних для введення доз речовин попередньо визначили параметри їх токсичності [104]. Дози були обрані таким чином, щоб визначити летальний ефект в інтервалі летальних доз ДЛ0-ДЛ100. Спостереження за тваринами проводили протягом 15 діб. Реєстрували час загибелі тварин і сумарну кількість введеної речовини. Оцінювання результатів проводили на підставі середнього ефективного часу загибелі тварин [161]. За встановленими параметрами токсичності ОЕНФ та їх похідні відносяться до помірно- та малотоксичних речовин (3-4 клас небезпеки) (табл. 2.1).

Таблиця 2.1 Параметри токсичності оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних натрієвих солей карбоксиметилатів оксиетильованих ізононілфенолів (технічної марки «Неоноли»)

Речовина	Параметри токсичності	Клас небезпеки
	ДЛ16, г/кг	ДЛ50, г/кг	ДЛ84, г/кг	ДЛ100, г/кг	ЕТ50, год	МНД, мг/кг	МНК, мг/л
ОЕНФ4	3,3	5,8±0,9	6,3	6,6	33,6	0,61	12,2	4
ОЕНФ6	3,1	4,2±0,9	5,8	6,2	38,4	0,51	10,2	3
ОЕНФ8	3,3	5,1±0,5	6,1	7,4	45,6	0,54	10,8	4
ОЕНФ10	2,5	4,3±1,0	5,5	6,2	43,2	0,44	8,8	3
ОЕНФ12	2,6	3,4±0,8	4,0	4,7	12,0	0,32	6,4	3
КМ-ОЕНФ4	4,3	6,1±0,8	10,1	10,8	66,2	0,64	12,8	4
КМ-ОЕНФ5	2,8	2,8±0,9	4,3	4,8	84,7	0,32	6,4	3
КМ-ОЕНФ6	2,0	2,2±1,0	3,6	3,9	78,5	0,25	5,0	3
КМ-ОЕНФ10	2,5	3,2±0,8	4,6	5,3	43,2	0,35	7,0	3

У подальших експериментах тварин піддавали пероральній затравці водними розчинами речовин у дозах 1/10, 1/100 і 1/1000 ДЛ50.

Для дослідження основних показників імунної системи використовували методичні рекомендації МОЗ України «Дослідження імунотоксичної дії потенційно небезпечних хімічних речовин при їх гігієнічній регламентації» (наказ № 356 від 25.07.2003 р.) [98] та рекомендації ВООЗ [418].

Гематологічні дослідження проводили, використовуючи стандартні методики. Підрахунок загальної кількості лейкоцитів крові здійснювали у лічильній камері Горяєва. Для диференційного підрахунку лейкоцитів з гепаринізованої цільної крові готували мазки, фіксували їх етанолом та фарбували за Романовським [178].

Визначення субпопуляцій лімфоцитів проводили за допомогою діагностикумів на основі моноклональних антитіл проти антигенів (ТОВ НВЛ «Гранум», Україна) згідно методики виробника. Метод ґрунтується на реакції розеткоутворення з еритроцитами, на яких абсорбовані моноклональні антитіла проти рецепторів СD3 (загальна популяція Т-лімфоцитів), СD4 (Т-хелпери/індуктори), СD8 (Т-цитотоксичні лімфоцити/супресори), СD19 (В-лімфоцити).

Вміст імуноглобулінів А, М, G у сироватці крові визначали методом радіальної імунодифузії в гелі за допомогою моноспецифічних сироваток проти імуноглобулінів виробництва ФГУП «НПО Микроген» (Росія).

Рівень цитокінів визначали імуноферментним методом з використанням наборів реагентів «ProCon IL-1?», «ProCon IL-2», «ProCon IL-4», «ProCon IL-6», «ProCon IL-10», «ProCon TNF-?» («Протеиновый контур», Росія), «Интерлейкин-8-ИФА-БЕСТ» («Вектор-Бест», Росія) і аналізатора імуноферментного Stat Fax 303 Рlus. Для одержання сироватки пробірки з кров'ю термостатували протягом 20 хвилин з наступним центрифугуванням протягом 10 хвилин при 1500 об/хв.

Фагоцитарну активність нейтрофілів щурів оцінювали за фагоцитарним числом (середньою кількістю частинок латексу, поглинених одним фагоцитом), індексом поглинання і перетравлення, абсолютними показниками поглинання і перетравлення по відношенню до золотистого стафілококу (штам 209). У кожному мазку переглядали 100 нейтрофілів і відмічали кількість клітин, які підлягали фагоцитозу [98]. Мікроскопічним методом по периферії мазка підраховували 100 нейтрофілів, визначали відсоток клітин, які вміщують мікроорганізми (фагоцитарний показник), середнє число мікроорганізмів у одному фагоциті (фагоцитарний індекс), відносну кількість пошкоджених (слабкозабарвлених або нерівномірно забарвлених) мікробних клітин фагоцитованих нейтрофілами (відсоток перетравлених клітин). Для об'єктивного висновку про стан фагоцитарної функції визначали абсолютну кількість фагоцитуючих нейтрофілів. Для цього використовували дані загального аналізу крові - кількість лейкоцитів і нейтрофілів.

Визначення вмісту гаптоглобіну в сироватці крові проводили фотоелектроколориметричним методом, що ґрунтується на осадженні ріванолом комплексу гемоглобін-гаптоглобін [137]. Екстинкцію всіх проб вимірювали проти дистильованої води на спектрофотометрі СФ-46 при довжині хвилі 540 нм.

Вміст церулоплазміну в сироватці крові визначали за методом Ravin [420] у модифікації Мошкова та співавт. [7], що ґрунтується на реакції ферментативного окислення парафенілендіаміну церулоплазміном. Проби інкубували протягом години у сухоповітряному термостаті при 37С, колориметрували при довжині хвилі 530 нм.

Вміст фібриногену у плазмі крові щурів визначали методом Клауса з використанням наборів реагентів «Фібриноген-тест» (НПО «РЕНАМ», Росія) шляхом вимірювання часу згортання розведеної плазми надлишком тромбіну. Плазму отримували шляхом центрифугування гепаринізованої крові протягом 20 хвилин при 3000 об/хв.

Визначення активності лізоциму проводили фотоелектроколометричним методом зі змінами температурного режиму реакції сироватки крові з культурою М. lisodecticus. Метод ґрунтується на змінах оптичної густини середовища у результаті здатності лізоциму крові викликати лізис тест-культури М. lisodecticus у фосфатному буфері. Для розрахунку активності лізоциму зі значення оптичної щільності досліджуваної проби віднімали значення щільності мікробної суспензії [66]. Вміст діоксифенілаланіну (ДОФА), дофаміну, норадреналіну, триптофану та серотоніну у гомогенаті головного мозку визначали спектрофлюориметрично після виділення хроматографічним методом на колонках з катіонобмінною смолою (Dowex 50Wx4, 200-400 mesh, натрієва форма, параметри колонки d=4 мм, h=75 мм) [357]. Швидкість протікання розчинів через колонки не перевищувала 1 мл/хв. До наважки тканини додавали 0,2 М HCIO4 з 0,5 % ЕДТА, гомогенізували. Гомогенат залишали на 20-30 хвилин на холоді, а потім центрифугували. Центрифугат зливали, осад промивали 0,2 М HCIO4 з 0,5 % ЕДТА і знов центрифугували. Центрифугати об'єднували, нейтралізували насиченим розчином Na2CO3 до рН 6,0-6,5, пропускали через колонки з наступною послідовною промивкою водою. ДОФА елюїрували 0,1 М натрій-цитратно-фосфатним буфером, який містив 0,2 моль/л NaCI (рН 2,5), далі елюцію проводили цим буфером з рН 4,5. Триптофан елюїрували 0,1 М натрій-фосфатним буфером (рН 6,5) з 0,1 % ЕДТА. Для елюїрування норадреналіну використовували 1 н водну соляну кислоту. Дофамін елюїрували соляною кислотою в етанолі, змішаних у рівних кількостях. Серотонін екстрагували 50% N-етанольною соляною кислотою. Триптофан визначали на спектрофлюориметрі «Hitachi MPF-4A» при довжині хвилі збудження 290 нм та довжині хвилі люмінесценції 345 нм, ДОФА - 330/375, дофамін - 330/375, норадреналін - 395/485, серотонін - 303/330 нм. Визначення адреналіну в сироватці крові також проводили після виділення хроматографічним методом C. Atack еt al. [357]. Елюїрування адреналіну проводили 1 н НСl, вміст оцінювали на спектрофлюориметрі «Hitachi MPF-4A» при довжині хвилі збудження - 445 нм, люмінесценції - 490 нм.

Вміст гама-амінобутирату у гомогенті головного мозку щурів також визначали після хроматографічного виділення [369] на колонках з катіонообмінною смолою Dowex 50Wx4, 200-400 mesh, натрієва форма, параметри колонки d=4 мм, h=75 мм. Після екстракції хлорною кислотою та нейтралізації до рН 3,0 зразок пропускали через колонку. Після промивання колонки водою, елюїрування ГАМК проводили з використанням 0,025 М натрій-цитратного буфера (рН 4,5). Для кількісного визначення ГАМК здійснювали реакцію з нінгідрином. До елюату додавали 2,5 М К2СО3, потім 0,8 мл елюату змішували з 0,4 мл розчину нінгідрину в 2,5 М К2СО3 (рН 8,5). Інкубували при 60?С протягом 30 хвилин з наступним охолодженням до кімнатної температури та вимірювали флюоресценцію при довжині хвилі збудження 380 нм і флюоресценції 450 нм.

Вміст мелатоніну, тиреотропіну, тироксину, кортизолу, кортикотропіну, інсуліну, глюкагону, кальцитоніну, соматотропіну, паратирину лютропіну, фоллітропіну, прогестерону, тестостерону, пролактину, естрадіолу, в сироватці крові визначали методом твердофазного імуноферментного аналізу за допомогою діагностичних тест-систем «Mеlatonin ELISA» (Німеччина), «ТироидИФА-ТТГ», «ТироидИФА-тетрайодтиронин» (Росія), «Стероид ИФА-кортизол-01» (Росія), «DSL-10-5100 Active ACTH Elisa» (США), «Гонадотропин ИФА-ЛГ» (Росія), «Гонадотропин ИФА-ФСГ» (Росія), «Стероид ИФА-прогестерон-01» (Росія), «Стероид ИФА-тестостерон-01» (Росія), «Стероид ИФА-пролактин-01» (Росія), «Estradiol ELISA» (CША), «Insulin ELISA» (США) та аналізатора імуноферментного Stat Fax 303 Рlus. Концентрацію гормонів у пробах розраховували після вимірювання оптичної щільності розчинів на основі калібрувальних кривих.

Вміст дієнових кон'югатів у сироватці крові, гомогенаті печінки та головного мозку визначали спектрофотометричним методом при 233 нм [158]. Ліпіди екстрагували гептан-ізопропаноловою сумішшю. Вміст дієнових кон'югатів розраховували, виходячи з коефіцієнта молярної екстинкції ?=2,2•105 моль-1см-1. Вміст ТБК-реактантів у сироватці крові, гомогенаті печінки та головного мозку оцінювали методом [317], що ґрунтується на реакції між малоновим діальдегідом і тіобарбітуровою кислотою, яка в умовах високої температури та кислого середовища відбувається з утворенням забарвленого триметинового комплексу з максимумом поглинання при довжині хвилі 532 нм. Кількість ТБК-реактантів розраховували, виходячи з молярного коефіцієнта екстинкції ?=1,56•105 моль-1см-1. Шифові основи, як продукти взаємодії карбонільних сполук і аміногруп білків, амінокислот, нуклеїнових кислот, екстрагували сумішшю Фолча (хлороформ-метанол) з подальшим спектрофлюориметричним визначенням в хлороформному екстракті при довжині хвилі збудження 360 нм і довжині хвилі емісії 430 нм [424]. Для отримання гомогенату печінки наважку тканини подрібнювали на холоді та гомогенізували протягом 1-2 хвилини за допомогою скляного гомогенізатора Поттера з тефлоновим товкачиком в охолодженому середовищі виділення (0,25 М розчин сахарози, який готували на 0,01 М трис-НСI буфері, рН-7,4 з додаванням 1 мМ ЕДТА). Співвідношення тканина/середовище (вага/об'єм) становило 1г/9 мл. Для отримання гомогенату головного мозку гомогенізацію проводили в охолодженому середовищі виділення, що складалося з 0,32 М сахарози на 0,05 М трис-НСI буфері, рН-7,4.

Оцінку інтенсивності спонтанної окислювальної модифікації білків сироватки крові проводили за допомогою модифікованого методу Дубініної та співавт. [235], що ґрунтується на реакції взаємодії карбонільних похідних білків і шифових основ з 2,4-динітрофенілгідразином з утворенням 2,4-динітрофенілгідразонів, які реєстрували при 356, 370 і 430 нм. Осадження білків сироватки проводили 20% розчином трихлороцтової кислоти. До денатурованих білків додавали 0,1 М розчин 2,4-динітрофенілгідразину на 2 М розчин HCl. Проби інкубували протягом години, центрифугували з метою осадження білків при 3000 об/хв., осад промивали сумішшю етанол-етилацетат (1:1) для екстракції ліпідів та 2,4-ДНФГ, що не прореагували з карбонільними групами окислених білків, та розчиняли у 8 М розчині сечовини. Кількість утворення 2,4-динітрофенілгідразонів розраховували, використовуючи коефіцієнт молярної екстинкції, що становив 21·10-3 моль-1см-1. Вміст карбонільних груп (ступінь окислювальної модифікації) розразовували за формулою: Х = Vпр.·?D·R/?·C·Vрозв., мкмоль/г білку, де Vпр. - об'єм проби, ?D - оптична щільність, R - коефіцієнт розведення, ? - коефіцієнт молекулярної екстинкції, C - концентрація, Vрозв. - об'єм розведеного білку в пробі.

Активність супероксиддисмутази (КФ 1.15.1.1) еритроцитів визначали спектрофотометричним методом за ступенем інгібування відновлення нітросинього тетразолію [82]. Еритроцити відділяли від плазми центрифугуванням стабілізованої гепарином крові протягом 15 хвилин при 3000 g (кінцеве розведення гепарин - цільна кров становило 1:100). Суспензію еритроцитів декілька разів промивали охолодженим 0,89% розчином NaCI.

Активність каталази (КФ 1.11.1.6) визначали у крові спектрофотометричним методом за зменшенням перекису водню в інкубаційному середовищі, що містить трис-НСl-ЕДТА (рН 8,0), 10 мМ/л розчин перекису водню. Зниження оптичної щільності вимірювали проти контрольної проби без гемолізату кожні 30 с протягом 3 хвилин при кімнатній температурі при 230 нм [101].

Вміст тіолових груп у білках мембран еритроцитів визначали методом прямого амперометричного титрування нітратом срібла [284], що ґрунтується на компенсації тіолами дифузійного електричного струму, індуктором якого є іони срібла на поверхні платинового електрода. Вміст дисульфідних зв'язків - визначали методом зворотного амперометричного титрування з використанням платинового електрода та відповідного електрода порівняння [283]. Метод грунтується на розщепленні дисульфідних зв'язків за умов дії сульфіту натрію у присутності залишку іонів срібла, які з новими тіоловими групами утворюють прозорий меркаптидний зв'язок, а залишок вільних іонів металу відтитровується еквімолярним розчином тіолу. У посуд для титрування, що містив аміачний буфер, додавали 0,001 М розчин нітрату срібла, мембранну фракцію еритроцитів, насичений розчин сульфіту натрію. Зворотне титрування проводили 0,001 М цистеїном. Мембрани еритроцитів виділяли шляхом гіпоосмотичного гемолізу з наступним осадженням при центрифугуванні 6000 об/хв. протягом 10 хвилин.

Для оцінки фосфоліпідного складу мембран еритроцитів останні відмивали від плазми 0,9% NaCl, ліпіди екстрагували методом Кейтса [141], екстракти випаровували у струмі сухого азоту. Розділення фосфоліпідів на фракції проводили методом двохмірної мікротонкошарової хроматографії [438]; фосфоліпіди ідентифікували, використовуючи специфічні реакції та стандартні розчини. Кількісний вміст загальних та індивідуальних фосфоліпідів у ліпідних екстрактах оцінювали за кількістю неорганічного фосфору, який визначали за допомогою молібденового реагенту [366]. Співвідношення фосфоліпідних фракцій розраховували у відсотках фосфору фосфоліпідів кожної фракції до фосфору загальних ліпідів, прийнятих за 100 %.

Для підтвердження індукування речовинами вільнорадикальних процесів використовували хемілюмінесцентний метод шляхом вимірювання інтенсивності надслабкого світіння сироватки крові в області спектра 400-600 нм, що виникає внаслідок хемілюмінесцентних реакцій [157, 160, 254]. У біологічних системах квант світла випромінюється у реакції рекомбінації пероксидних радикалів. Надслабке світіння фіксували без використання будь-яких домішок - спонтанну хемілюмінесценцію (ХЛ) та за допомогою флюорохромів - хімічних добавок, що підсилюють слабке спонтанне світіння (люмінолу, перекису водню, хлорного заліза). Хемілюмінограми реєстрували на хемілюмінометрі ХЛМ1Ц-01. Вимірювальні блоки хемілюмінометру забезпечували виведення інформації у цифровому вигляді на табло прибору та печатний пристрій; запис хемілюмінограм на діаграмній стрічці самописця; перемішування проб і реактивів, що подавалися через гніздо дозування, зміну проб та їх світлозахист; термостатування кювет та охолодження фотоелектропомножувача.

Для підтвердження індукування речовинами окислювальної модифікації білків вимірювали інтенсивність фосфоресценції сироватки крові після збудження її джерелом світла спектрофлюориметричним методом. На кварцову пластину наносили сироватку крові та 3% люмінол; висушували при 30?С до утворення твердої плівки. Після цього кварцову пластину з висушеною сироваткою крові розташовували у фосфороскопі люмінесцентного комплексу і вимірювали інтенсивність фосфоресценції. Джерелом збуджуючого світла була ртутна лампа ДРК-120. За допомогою монохроматора ДМР-4 виділяли спектральні лінії 297, 313, 334, 365, 404 і 434 нм. Кванти світла поглиналися плівкою сироватки крові з подальшим випромінюванням квантів фосфоресценції за допомогою ФЕП-130. Ширина вихідної щілини монохроматора становила 2 мм. Реєстрацію фосфоресценції здійснювали при кімнатній температурі в режимі підрахунку фотонів за допомогою лічильника СБС-2. Усі процедури вимірювання автоматизовані, похибка не перевищувала в усіх випадках 3 %.

Вміст нітритів, нітратів, S-нітрозотіолу та активність NO-синтази у крові оцінювали за методичними рекомендаціями [150]. Для визначення рівня нітритів проводили депротеїнізацію шляхом змішування сироватки крові з 96% етанолом у співвідношенні 1:2 та наступного центрифугування протягом 20 хвилин при 2500 g. До супернатанту додавали VCI3 та реактив Грисса, проби інкубували 30 хвилин при 37?С, вимірювали оптичну щільність при довжині хвилі 540 нм. Кількість нітритів знаходили за калібрувальною кривою, побудованою зі стандартним розчином NaNO2. Для визначення нітратів сироватку крові інкубували з реактивом Грисса без додавання VCI3; кількісний вміст знаходили шляхом вираховування кількості нітритів з сумарної кількості цих метаболітів оксиду азоту. За приростом вмісту нітратів і нітритів у дослідних пробах судили також про активність NO-синтази. Вміст S-нітрозотіолу у плазмі крові визначали за вимірюванням рівня 5,5-дітіобіс-(2-нітробензойної) кислоти - продукту окислення тіолових груп 5-тіо-2-нітробензойної кислоти оксидом азоту. Для цього плазму крові розводили фізіологічним розчином в 2 рази, додавали 0,1 мМ розчин сульфату амонію, інкубували 10 хвилин при кімнатній температурі з метою осадження NO2, реакцію зупиняли додаванням 2,8 М розчину NaOH. Флюоресценцію вимірювали при 360/450 нм. Розрахунок проводили за калібрувальною кривою, побудованою з використанням різних концентрацій відновленого глутатіону.

Для оцінки стану системи мікросомального окислення наважку печінки гомогенізували у середовищі виділення (0,3 М сахароза, 1 мМ трилон Б, 10 мМ трис-НСl буфер, рН 7,4) на холоді у тефлоновому гомогенізаторі протягом хвилини (20-30 up/down, швидкість обертання 1000 об/хв, зазор скло-тефлон 0,2 мм). Гомогенат центрифугували при 600 g протягом 10 хвилин; надосадову рідину центрифугували при 10000 g протягом 10 хвилин. Мембрани ендоплазматичного ретикулума виділяли за методом Komoth, Narayn [398] у модифікації [183]. До постмітохондріальної фракції додавали 1 М СаСl2, центрифугували при 10000 g протягом 10 хвилин. До осаду мікросом додавали 0,15 М КСl й центрифугували 10 хвилин при 10000 g. Осад суспендірували в середовищі, що містило 125 мМ КСl, 20 мМ трис-НСl буфер (рН 7,4). Концентрація білка в суспензії становила 15-20 мг/мл. Визначення швидкості споживання кисню суспензією мікросом проводили за допомогою закритого платинового кисневого електроду Кларка полярографічним методом [238]. Швидкість окислення НАДФН2 визначали флюориметрично, вимірюючи швидкість зниження флюоресценції при окисленні в інкубаційній суміші, що містила 100 мМ трис-НСl буфер (рН 7,4) і близько 3 мг білка мікросом. Реакцію починали додаванням НАДФН2 до концентрації 33 мкМ. Реєстрацію флюоресценції проводили на спектрофлюориметрі при 30С при довжині збудження 366 нм, довжині флюоресценції - 420 нм. Визначення активності оксидоредуктаз проводили у присутності акцептора електронів цитохрому с [238] шляхом вимірювання зміни поглинання акцептора електронів при переході з окисленої форми на відновлену. Інкубаційна суміш для визначення активності НАД(Ф)Н-цитохром с-редуктази містила 100 мкМ НАДФН (НАДН), 50 мкМ цитохром с, 330 мкМ NaCN, 100 мМ трис-НСl буфер (рН 7,4), 40 мкг білка мікросом при використанні як субстрату НАДФН і 15 мкг - як субстрату НАДН. Вимірювання швидкості відновлення цитохрому с проводили на двопроменевому спектрофотометрі «Specord UV VIS» при 30С при довжині хвилі 550 нм. Активність оксидоредуктаз розраховували за допомогою коефіцієнта молярної екстинкції цитохрому с, що складав 18,5103 см-1М-1 [238]. Вміст цитохромів b5 та Р-450 у суспензії мікросом визначали методом диференційної спектрофотометрії [238]. При визначенні цитохрому b5 враховували різницю в поглинанні окисленої та відновленої форми гемопротеїнів. При визначенні цитохрому Р-450 вимірювали величину поглинання комплексу відновленого цитохрому Р-450 з монооксидом вуглецю при довжині хвилі 450 нм. Вміст цитохромів визначали за допомогою двопроменевого реєструючого спектрофотометра «Specord UV VIS». Для визначення швидкості реакції окислювального деметилювання, субстратом якої був р-нітроанізол, суспензію мікросом додавали у середовище інкубації, ініціюючи її внесенням НАДФН. Зупиняли реакцію додаванням розчину трихлороцтової кислоти. Реакційну суміш обробляли лугами, зсаджували білок центрифугуванням і спектрофотометрично визначали р-нітрофенол при довжині хвилі 436 нм на спектрофотометрі СФ-46.

Оцінку проникності мембран еритроцитів проводили методом потенціометричного визначення вмісту К+ за допомогою скляного іоноселективного електроду 2407К+ [253]. До середовища інкубації (0,15 М сахароза, 2,5 мМ MgCI2, 5 мМ трис-HCI буфер, рН 7,4), додавали суспензію мембран еритроцитів, реєстрували концентрацію калію у позаклітинному середовищі протягом 1-2 хвилин. До проб додавали також валіноміцин (0,1 нМ/мг білка) і вимірювали вміст К+ у позаклітинному середовищі.

Оцінку плинності мембран лімфоцитів та еритроцитів проводили методом латеральної дифузії гідрофобного флуоресцентного зонду пірену [253], що ґрунтується на утворенні активних димерів пірену у ліпідному оточенні (ексимерів) [93]. Інкубацію суспензії клітин з піреном проводили при 25?С протягом хвилини. Флюоресценцію пірену вимірювали на спектрофлюориметрі «Hitachi MPF-4A»: плинність ліпідного бішару при довжині хвилі збудження 334 нм, довжині хвилі мономерів - 393 нм, довжині хвилі ексимерів - 470 нм; плинність білок-ліпідних контактів відповідно при 286/393/470 нм. Оцінювали стан плинності мембран за коефіцієнтом ексимерізації пірену (співвідношення інтенсивності флюоресценції ексимерів до інтенсивності флюоресценції мономерів). Виділення мембран лімфоцитів проводили шляхом розділення у двохфазній системі декстран-поліетиленгліколь. Для цього змішували та струшували 30% декстран, 24% поліетиленгліколь (6000), 50мМ фосфатний буфер (рН 7,8). Суміш залишали на добу при 4?С, потім відбирали верхню та нижню фази. Лімфоцити руйнували трьохкратним заморожуванням-розморожуванням та обробленням 0,2% тритоном Х-100. До пробірок вносили нижню фазу, на неї послідовно нашаровували верхню фазу та зруйновані лімфоцити. Центрифугували при 3000 об/хв. протягом 30 хвилин. Кільце мембран лімфоцитів знимали після центрифугування з розділу фаз.

Вміст глутамату, аспартату, гліцину у депротеїнізованому гомогенаті головного мозку щурів, орнітину, таурину - у сироватці крові визначали методом рідинної хроматографії на автоматичному аналізаторі ААА-339 (Чехія) [429]. Для проведення калібрувальних тестів, а також кількісної оцінки хроматограм використовували промислові стандартні розчини амінокислот виробництва фірми «Lachema». Для визначення цим методом вмісту вільних амінокислот у плазмі крові, останню після відділення еритроцитарної маси депротеїнізували додаванням сульфосаліцилової кислоти у співвідношенні 10:1 з наступним центрифугуванням при 2000 об/хв протягом 20 хвилин. Отриману надосадову рідину наносили на пробовідбірник аналізатора. Вміст ?-аміномасляної кислоти (ГАМК) у плазмі крові визначали після хроматографічного виділення на колонках з катіонообмінною смолою Dowex 50Wx4, (200-400) mesh [369].

Вміст пірувату, креатиніну, загального білка, альбуміну, сечовини у сироватці крові визначали за наборами реактивів фірми «Cone Lab» (Фінляндія) та «Roche» (Швеція) на біохімічному автоматичному поліаналізаторі «Cobas mira» фірми «Хофман Лярош» (Австрія-Швейцарія).

Тканинний екстракт печінки для визначення вмісту аденілових нуклеотидів готували наступним чином: за умов постійного охолодження шматочки тканини зважували, розтирали у попередньо охолодженій фарфоровій ступці, кількісно переносили у 6% розчин хлорної кислоти для екстракціі кислоторозчинних речовин (співвідношення наважки тканини і хлорної кислоти становило 1:4). Отриманий екстракт гомогенізували в охолодженому скляному гомогенізаторі, гомогенат переносили у центрифужні пробірки. Проби центрифугували при 0-4?С протягом 15 хвилин при 3000 об/хв. Осад промивали з розрахунку кінцевого розведення тканини 1:5, знов центрифугували. Безбілковий екстракт тканини нейтралізували 5 М К2СО3; через 30 хвилин залишок перхлорату калію видаляли центрифугуванням. У надосадовій фракції оцінювали рівень аденілових нуклеотидів.

Вміст АТФ у тканині печінки визначали за методом Beutler [362]. АТФ у присутності гексокінази та іонів магнію фосфорилює глюкозу з утворенням глюкозо-6-фосфату. Останній за дії глюкозо-6-фосфатдегідрогенази окислюється за допомогою НАДФ, причому кількість АТФ, що прореагувала, еквімолярна кількості утвореного НАДФН, за зміною рівня якого можна судити про АТФ. НАДФН, що утворюється в результаті хімічної реакції, збільшує оптичну щільність проби, визначення якої проводили на спектрофотометрі при довжині хвилі 340 нм. Реакційне середовище містило трис-НСI буфер (рН 7,5), розчини MgCI2, НАДФ, глюкози, тканинного екстракту та глюкозо-6-фосфатдегідрогеназу. Вимірювали первинну оптичну щільність Е1, потім через 5 хвилин та повторно через 1-2 хвилини до постійної величини. Додавали суспензію гексокінази та вимірювали зміну оптичної щільності Е2 до постійної величини. До контрольної проби замість тканинного екстракту додавали дистильовану воду та вимірювали оптичну щільність Е3. Вміст АТФ розраховували за формулою: С=Е·V·K/6,22, де Е=(Е1-Е2)-Е3; С - кількість АТФ у 1 мкмоль на 1 г тканини; V - кінцевий об'єм проби; К - фактор розведення проби по відношенню до 1 г тканини; 6,22 - коефіцієнт екстинкції відновленої форми піридинових нуклеотидів при 340 нм. Вміст АДФ і АМФ у тканині печінки визначали в одній пробі за методом Joworek D. et al. [394, 395]. АМФ за присутності АТФ фосфорилюється міокіназою з утворенням АДФ; останній фосфорилюється піруваткіназою за рахунок фосфоенолпірувату, який перетворюється на піруват. Концентрацію пірувату можна вимірювати в індикаторній реакції з НАДН та лактатдегідрогеназою (ЛДГ). За умов, що рівновага у всіх реакціях зсунута вправо, це дозволяє прореагувати всьому АМФ. Реакційне середовище містило триетаноламіновий буфер (рН 7,55), розчин фосфоенолпірувату, НАД, тканинний екстракт та суспензію ЛДГ. Через 1 та 5 хвилин при 340 нм вимірювали оптичну щільність Е1; додавали суспензію піруваткінази та знов вимірювали оптичну щільність до постійного значення Е2. Зниження екстинкції Е1-Е2 пропорційно кількості АДФ в пробі. Після цього до реакційного середовища додавали суспензію міокінази, через 25 хвилин знов вимірювали оптичну щільність Е3; зниження екстинкції при цьому відбувається за рахунок кількісного перетворення АМФ. ЕАДФ і ЕАМФ з урахуванням холостої проби використовували для розрахунку вмісту АДФ і АМФ у тканині печінки.

Активність дихального ланцюга мітохондрій гепатоцитів вивчали полярографічним методом [268]. Визначали основні параметри за Чансом [370]. Функціональний стан I та II комплексів оцінювали у присутності специфічних субстратів та інгібіторів за параметрами: 1) стан V4 - високий вміст у середовищі інкубації субстратів I комплексу - 5 мМ глутамату, 5 мМ малату або субстрату II комплексу - сукцинату при відсутності АДФ; 2) стан V3 - аналогічні умови, що й у випадку V4, але у присутності 200 мкМ АДФ (при цьому фактором, що лімітує швидкість реакції, є саме дихальний ланцюг); 3) стан Vd - аналогічні умови, що й у випадку V4, але у присутності роз'єднувача окислення та фосфорилування 30 мкМ 2,4-динітрофенолу. Мітохондрії виділяли методом диференційного центрифугування [354]. Для цього спочатку тканину печінки гомогенізували у середовищі, що містило 250 мМ сахарозу, 3мМ трис-НСI буфер з 0,5 мМ ЕДТА (рН 7,3). Гомогенат центрифугували при 700 g, отриманий супернатант центрифугували у середовищі, що містило 250 мМ сахарозу, 3мМ трис-НСI буфер (рН 7,3) при 7000 g. Мітохондріальний осад двічі промивали та знов центрифугували.

Вміст біогенних елементів (натрію, калію, кальцію, магнію, фосфору, цинку, міді, заліза, марганцю) визначали атомно-абсорбційним методом [126]. Для проведення аналізу сироватку крові піддавали попередньому озолінню та екстрагуванню [187], потім екстракт розпиляли у струмі газового пальника. Вміст біогенних елементів реєстрували за ступенем поглинання світла визначеної довжини хвилі шляхом порівняння з еталонними зразками та калібрувальними даними.

Статистичний аналіз отриманих результатів проводили з використанням комп'ютерного пакета прикладних програм для обробки статистичної інформації Statistica 6.1 (StatSoft,Inc., США). Статистичне опрацювання кількісних експериментальних даних починали з перевірки припущення про відповідність розподілу отриманих вибірок закону нормального розподілу за критерієм Шапіро-Вілка. Кількісні ознаки з нормальним розподілом описували параметричними характеристиками - середнім значенням досліджуваного показника (М) та середнім квадратичним відхиленням (s); у разі відсутності нормального розподілу непараметричними характеристиками - медіаною вибірки (Ме) та інтерквартильним розмахом [значеннями 25-го та 75-го процентилів]. Для порівняння двох нормальних розподілів застосовували t-критерій Стьюдента. Якщо принаймні один з розподілів не був нормальним, то для порівняння незалежних вибірок застосовували ранговий критерій Манна-Вітні. За критичний рівень значущості при перевірці статистичних гіпотез приймали р<0,05. Застосування перерахованих вище методів сприяло накопиченню фактичного матеріалу, який в сукупності з наявними літературними даними дозволив вирішити поставлені мету та задачі даного дослідження.

РОЗДІЛ 3 ОСОБЛИВОСТІ ІМУННИХ ПОРУШЕНЬ В ОРГАНІЗМІ ЩУРІВ ПРИ ТРИВАЛОМУ ПЕРОРАЛЬНОМУ ВВЕДЕННІ ОКСИЕТИЛЬОВАНИХ НОНІЛФЕНОЛІВ ТА ЇХ ПОХІДНИХ

Однією з найбільш чутливих систем у підтримці постійної сталості внутрішнього середовища організму є імунна система, функціонування якої може порушуватися за умов дії хімічних факторів довкілля. За фізіологічних умов імунна відповідь реалізується завдяки збалансованій роботі компонентів неспецифічної резистентності та специфічної імунологічної реактивності організму [134, 149, 195, 216, 321]. Розгортання неадекватних імунних реакцій на надходження чужорідних хімічних сполук розглядають як прояв імунотоксичності, який може характеризуватися порушенням процесів проліферації та диференціювання клітин кісткового мозку, синтезу цитокінів, роботи рецепторного апарату на мембранах імунокомпетентних клітин та іншим [92, 112, 113, 114, 119, 127, 282]. З огляду на вище наведене, вважали доцільним розпочати вивчення патофізіологічних механізмів дії ОЕНФ та їх похідних зі стану імунного статусу експериментальних тварин.

3.1 Стан специфічної імунної резистентності організму щурів

На 45-ту добу перорального введення ОЕНФ та їх похідних у дозі 1/10 ДЛ50 спостерігали статистично значуще (р<0,001), по відношенню до контролю, зниження загальної кількості білих клітин крові - лейкоцитів, у тому числі лімфоцитів, особливо у випадку ОЕНФ10 і КМ-ОЕНФ5, 6, 10 (у середньому в 3 рази) (табл. 3.1). Таку ж тенденцію, але менш виразну, виявили і при щоденному пероральному введенні речовин у дозі 1/100 ДЛ50. При цьому найбільш сильну дію чинили ОЕНФ10 і КМ-ОЕНФ10 (знижували в середньому в 2,5 раза; р<0,001), найменш - ОЕНФ4 і КМ-ОЕНФ4 (знижували в 1,6 раза; р<0,006) (табл. 3.2).

Таблиця 3.1 Загальна кількість лейкоцитів і лімфоцитів у периферичній крові щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних у дозі 1/10 ДЛ50 (n=15; Ме [25%; 75%] або М±s)

Речовина	Лейкоцити, х109/л	Лімфоцити, х109/л
ОЕНФ4	7,21±1,55 р<0,001	5,4 [4,3; 6,8] р<0,001
ОЕНФ6	6,5 [4,0; 7,7] р<0,001	4,57±1,23 р<0,001
ОЕНФ8	6,3 [4,5; 8,9] р<0,001	4,81±1,33 р<0,001
ОЕНФ10	4,95±1,92 р<0,001	3,88±1,02 р<0,001
ОЕНФ12	5,41±1,35 р<0,001	4,06±1,20 р<0,001
КМ-ОЕНФ4	7,07±1,62 р<0,001	4,8 [3,8; 6,0] р<0,001
КМ-ОЕНФ5	4,46±0,93 р<0,001	2,9 [2,2; 3,9] р<0,001
КМ-ОЕНФ6	3,56±0,67 р<0,001	2,5 [1,9; 3,7] р<0,001
КМ-ОЕНФ10	4,10±0,96 р<0,001	3,19±1,12 р<0,001
Контроль	11,2±2,08	7,7 [7,2; 8,2]

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

Дія ОЕНФ та їх похідних у дозі 1/1000 ДЛ50 у загальному плані не виявила статистично значущих, порівняно з контролем, відмінностей з боку загального вмісту лейкоцитів і лімфоцитів у периферичній крові щурів. Але у випадку дії цієї дози відмічали незначне, але достовірне, збільшення загальної кількості лейкоцитів для ОЕНФ8 (р=0,015) і зменшення кількості лімфоцитів для ОЕНФ10 (р=0,018), КМ-ОЕНФ5 (р=0,029) (табл. 3.3).

На тлі виявленого зменшення загальної кількості лейкоцитів і лімфоцитів у периферичній крові щурів відзначали зміни з боку відносного вмісту таких субпопуляцій лімфоцитів, як СD3 (загальна популяція Т-лімфоцитів), СD4 (Т-хелпери/індуктори), СD8 (Т-цитотоксичні лімфоцити/супресори) та СD19 (В-лімфоцити). Так, на 45-добу найбільш токсичні, за попередніми результатами, ОЕНФ10 і КМ-ОЕНФ5, 6, 10 у діючій дозі 1/100 ДЛ50 викликали зниження в середньому в 1,3 раза (р<0,009), порівняно з контролем, рівня Т-лімфоцитів (СD3), що відображує дефіцит Т-клітинних механізмів захисту, здійснюючих імунологічний нагляд за антигенним гомеостазом (табл. 3.4).

Таблиця 3.2 Загальна кількість лейкоцитів і лімфоцитів у периферичній крові щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних у дозі 1/100 ДЛ50 (n=15; Ме [25%; 75%] або М±s)

Речовина	Лейкоцити, х109/л	Лімфоцити, х109/л
ОЕНФ4	9,09±1,57 р=0,004	6,31±2,04 р=0,015
ОЕНФ6	7,39±1,98 р<0,001	5,63±1,45 р<0,001
ОЕНФ8	8,27±1,70 р<0,001	6,67±1,31 р=0,024
ОЕНФ10	6,82±2,02 р<0,001	5,0 [3,7; 6,8] р<0,001
ОЕНФ12	7,46±1,86 р<0,001	5,06±1,19 р<0,001
КМ-ОЕНФ4	8,88±2,21 р=0,006	6,22±2,25 р=0,02
КМ-ОЕНФ5	6,63±2,43 р<0,001	4,03±1,33 р<0,001
КМ-ОЕНФ6	4,63±1,14 р<0,001	3,29±0,91 р<0,001
КМ-ОЕНФ10	5,69±1,22 р<0,001	3,98±1,30 р<0,001
Контроль	11,2±2,08	7,7 [7,2; 8,2]

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

З боку імунорегулюючих субпопуляцій Т-лімфоцитів також спостерігали достовірне, відносно контрольної групи тварин, зменшення в середньому в 1,5 раза як Т-хелперів (р<0,001), так і Т-супресорів (р<0,068) (табл. 3.4). За умов тривалої дії КМ-ОЕНФ6 і КМ-ОЕНФ5 у дозі 1/100 ДЛ50 відзначали статистично значуще збільшення (р=0,0045 і р=0,024 відповідно) імунорегуляторного індекса - співвідношення СD4/CD8 - до (2,3±1,21) і (2,2±1,32) ум.од. відносно контролю (1,8±0,93) ум.од. Достовірно значущих відмінностей (р>0,05), при порівнянні з контрольною групою тварин, для імунорегуляторного індекса у випадку дії ОЕНФ10 і КМ-ОЕНФ10 не виявлено.

Таблиця 3.3 Загальна кількість лейкоцитів і лімфоцитів у периферичній крові щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних у дозі 1/1000 ДЛ50 (n=15; Ме [25%; 75%] або М±s)

Речовина	Лейкоцити, х109/л	Лімфоцити, х109/л
ОЕНФ4	10,9±2,22 р=0,686	8,12±1,52 р=0,431
ОЕНФ6	11,3±2,81 р=0,937	7,0 [6,5; 8,9] р=0,302
ОЕНФ8	13,3±2,24 р=0,015	7,85±1,73 р=0,836
ОЕНФ10	9,41±1,84 р=0,048	6,2 [5,3; 7,9] р=0,028
ОЕНФ12	10,4 [7,7; 13,4] р=0,561	8,05±1,54 р=0,709
КМ-ОЕНФ4	11,6 [9,5; 13,4] р=0,852	7,9 [6,3; 9,7] р=0,917
КМ-ОЕНФ5	9,71±2,41 р=0,078	6,4 [5,2; 7,7] р=0,029
КМ-ОЕНФ6	10,1±2,97 р=0,244	6,7 [5,8; 8,2] р=0,120
КМ-ОЕНФ10	13,2 [10,5; 14,4] р=0,740	9,8 [6,0; 11,4] р=0,431
Контроль	11,2±2,08	7,7 [7,2; 8,2]

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

У периферичній крові щурів також спостерігали зниження (р<0,008), при порівнянні з контролем, відносного вмісту СD19-клітин (табл. 3.4). Найсуттєвіша зміна виявлена для дії КМ-ОЕНФ5: рівень СD19-лімфоцитів знижувався майже в 2 рази. Для ОЕНФ10, КМ-ОЕНФ6 і КМ-ОЕНФ10 цей показник зменшувався в середньому в 1,5 раза.

Основною характеристикою В-лімфоцитів є наявність на їх поверхні рецепторів для розпізнавання антигенів, основу яких складають молекули імуноглобулінів (Ig). Після взаємодії рецептора з антигеном В-лімфоцити диференціюються в плазматичні клітини, які секретують Ig. Порушення функціонування В-лімфоцитів у щурів при тривалій дії досліджуваних хімічних речовин може призвести до зниження антитілоутворення.

Таблиця 3.4 Відносний вміст субпопуляцій лімфоцитів у периферичній крові щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних у дозі 1/100 ДЛ50 (n=15; Ме [25%; 75%] або М±s)

Речовина	СD3, %	СD4, %	СD8, %	СD19, %
ОЕНФ10	49,1±6,56 p=0,002	33,0±5,81 p<0,001	19 [12; 24] p=0,068	19,7±4,71 p=0,008
КМ-ОЕНФ5	47,1±8,49 p<0,001	28 [24; 35] p<0,001	15 [10; 18] p<0,001	12 [10; 18] p<0,001
КМ-ОЕНФ6	43 [30; 50] p<0,001	26 [23; 37] p<0,001	12 [9; 17] p<0,001	15,9±5,17 p<0,001
КМ-ОЕНФ10	52 [43; 54] p=0,009	30,5±7,18 p<0,001	17,1±2,80 p=0,004	17 [12; 20] p<0,001
Контроль	60,1±10,28	41,5±4,76	22,9±6,42	25,3±6,01

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

На 45-ту добу введення ОЕНФ та їх похідних у дозі 1/10 ДЛ50 спостерігали статистично значуще (p<0,001), порівняно з контролем, зменшення вмісту IgА в сироватці крові щурів: для ОЕНФ10 і КМ-ОЕНФ5 в середньому в 2 рази, а для КМ-ОЕНФ6 і КМ-ОЕНФ10 - майже в 3 рази (табл. 3.5). Таку ж динаміку змін вмісту IgА відзначали й для дози 1/100 ДЛ50, але менш виразну (зменшення в середньому в 1,5 раза). Доза 1/1000 ДЛ50 виявилася недіючою на рівень цього показника.

Рівень IgМ у сироватці крові щурів також достовірно значуще (p<0,001), відносно контролю, знижувався на 45-ту добу перорального введення хімічних речовин у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 в середньому відповідно в 2,0 і 1,5 раза (табл. 3.6). Найсуттєвіше підвищення вмісту IgМ реєстрували для КМ-ОЕНФ5, найменш - для ОЕНФ10. Слід відзначити, що тривалий вплив КМ-ОЕНФ5 і КМ-ОЕНФ10 у дозі 1/1000 ДЛ50 також супроводжувався статистично значущим (р=0,003 та р=0,032 відповідно), порівняно з контролем, зниженням вмісту IgМ, тоді як ОЕНФ10 і КМ-ОЕНФ6 у цій дозі не впливали на рівень цього показника (р=0,163 і р=0,087).

Таблиця 3.5 Вміст імуноглобуліну А у сироватці крові щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних (г/л; n=15; Ме [25%; 75%] або М±s)

Речовина	Доза, ДЛ50
	1/10	1/100	1/1000
ОЕНФ10	0,29±0,06 p<0,001	0,39 [0,36; 0,41] р<0,001	0,53 [0,48; 0,55] p=0,237
КМ-ОЕНФ5	0,22±0,04 p<0,001	0,33 [0,29; 0,37] p<0,001	0,51±0,03 р=0,69
КМ-ОЕНФ6	0,19 [0,17; 0,20] p<0,001	0,35 [0,28; 0,37] p<0,001	0,49±0,03 р=0,384
КМ-ОЕНФ10	0,18 [0,15; 0,22] p<0,001	0,29±0,04 p<0,001	0,46 [0,43; 0,48] р=0,019
Контроль	0,50±0,05

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

Вміст IgG у сироватці крові щурів на 45-добу дії ОЕНФ та їх похідних у дозі 1/10 ДЛ50 також знижувався (p<0,001) при порівнянні з контрольною групою тварин (табл. 3.7). Найсуттєвіше рівень IgG змінювався у випадку дії КМ-ОЕНФ6 (майже в 2 рази), найменш - у випадку ОЕНФ10 (в 1,4 раза). Тривалий вплив ОЕНФ10 і КМ-ОЕНФ5, 6, 10 у діючій дозі 1/100 ДЛ50 також супроводжувався статистично значущим, порівняно з контролем, зниженням рівня IgG у сироватці крові щурів, але менш виразним (в середньому в 1,3 раза; р<0,006), ніж у дозі 1/10 ДЛ50. Досліджувані речовини у дозі 1/1000 ДЛ50 практично не змінювали рівень IgG.

Таблиця 3.6 Вміст імуноглобуліну М у сироватці крові щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних (г/л; n=15; Ме [25%; 75%] або М±s)

Речовина	Доза, ДЛ50
	1/10	1/100	1/1000
ОЕНФ10	0,52±0,09 p<0,001	0,63±0,07 p<0,001	0,82±0,06 р=0,163
КМ-ОЕНФ5	0,38±0,04 p<0,001	0,47±0,07 p<0,001	0,7 [0,69; 0,79] р=0,003
КМ-ОЕНФ6	0,42 [0,38; 0,44] p<0,001	0,52 [0,49; 0,56] p<0,001	0,76±0,04 р=0,087
КМ-ОЕНФ10	0,46±0,04 p<0,001	0,56±0,05 p<0,001	0,83±0,04 р=0,032
Контроль	0,81±0,03

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

Тривале пероральне введення щурам досліджуваних речовини призвело до порушень цитокінового профілю сироватки крові (табл. 3.8). Токсифікація тварин ОЕНФ та їх похідними у діючій дозі 1/100 ДЛ50 викликала статистично значуще (р<0,003), по відношенню до контролю, зниження рівня сироваткового інтерлейкіну 1? (ІЛ-1?): у випадку КМ-ОЕНФ5 - майже в 2 рази, КМ-ОЕНФ6 і КМ-ОЕНФ10 - в середньому в 1,8 раза, а ОЕНФ10 - лише в 1,4 раза. На 45-добу в сироватці крові щурів відзначали також зниження рівня ІЛ-2 майже в 2 рази за умов впливу КМ-ОЕНФ5 (р<0,001), в 1,8 раза - КМ-ОЕНФ6 (р<0,001), 1,5 раза - КМ-ОЕНФ10 (р<0,001) та 1,3 раза - ОЕНФ10 (р=0,003). У сироватці крові щурів на 45-ту добу введення речовин у дозі 1/100 ДЛ50 виявили статистично значуще (р<0,001), при порівнянні з контролем, зниження рівня ІЛ-4: у випадку КМ-ОЕНФ5 - в 2 рази, КМ-ОЕНФ6 - в 1,6 раза, ОЕНФ10 - в 1,4 раза, а КМ-ОЕНФ10 - в 1,3 раза.

Таблиця 3.7 Вміст імуноглобуліну G у сироватці крові щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних (г/л; n=15; Ме [25%; 75%] або М±s)

Речовина	Доза, ДЛ50
	1/10	1/100	1/1000
ОЕНФ10	3,96±0,62 p<0,001	4,53±0,53 р=0,006	5,8 [4,9; 6,5] р=0,455
КМ-ОЕНФ5	2,90±0,53 p<0,001	3,95±0,88 p<0,001	5,06±0,95 р=0,283
КМ-ОЕНФ6	2,6 [2,4; 3,2] p<0,001	3,87±0,71 p<0,001	5,0 [4,8; 6,4] р=0,88
КМ-ОЕНФ10	3,26±0,65 p<0,001	4,3 [3,6; 5,0] р=0,002	5,41±0,79 р=0,89
Контроль	5,5±1,05

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

Тривала дія ОЕНФ та їх похідних супроводжувалася зниженням (р<0,0015), порівняно з контролем, у сироватці крові експериментальних тварин вмісту ІЛ-6 в середньому в 1,7 раза. Аналогічно спостерігали тенденцію до статистично значущого (р<0,001), порівняно з контролем, зниження вмісту ІЛ-8. Найсуттєвіше (в середньому в 2,4 раза) це виявилося для тривалої дії ОЕНФ10 у дозі 1/100 ДЛ50. Інші хімічні речовини знижували вміст ІЛ-8 в середньому в 1,7 раза.

До цитокінів з виразним протизапальним ефектом відноситься ІЛ-10, що продукується Т-клітинами і розглядається як антагоніст ряду інших цитокінів. ОЕНФ10 і КМ-ОЕНФ5, 6 у діючій дозі 1/100 ДЛ50 на 45-добу введення статистично значуще (р<0,001), порівняно з контролем, знижували рівень ІЛ-10 в середньому в 2 рази. Для КМ-ОЕНФ10 зменшення (р<0,0013) вмісту ІЛ-10 менш виразне, лише в 1,3 раза. Такі зміни вказують на порушення функціонального стану захисних систем.

Таблиця 3.8 Вміст цитокінів у сироватці крові щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних у дозі 1/100 ДЛ50 (n=15; Ме [25%; 75%] або М±s)

Показник	ОЕНФ10	КМ-ОЕНФ5	КМ-ОЕНФ6	КМ-ОЕНФ10	Контроль
ІЛ-1?, нг/л	40,2 [30,7; 50,5] p<0,001	29,3±6,36 p<0,001	30,3±5,69 p=0,0018	32,5 [29,0; 46,0] p<0,001	56,9±7,05
ІЛ-2, нг/л	48,3±8,53 p=0,003	30,6±6,12 p<0,001	36,5 [25,8; 40,1] p<0,001	43,9 [32,1; 50,0] p<0,001	64,7±17,1
ІЛ-4, нг/л	29,5 [26,0; 39,4] p<0,001	20,3 [17,5; 29,0] p<0,001	26,3±8,37 p<0,001	32,0 [27,9; 39,0] p<0,001	40,9 [39,4;60,3]
ІЛ-6, нг/л	24,4±6,04 p<0,001	18,9 [12,0; 28,5] p<0,001	28,9 [19,2; 30,2] p=0,0015	23,1±5,88 p<0,001	39,8 [35,0; 50,6]
ІЛ-8, нг/л	31,8±6,58 p<0,001	20,1 [17,0; 27,0] p<0,001	25,1±6,27 p<0,001	30,5 [28,0; 44,5] p<0,001	48,4 [44,0; 59,0]
ІЛ-10, нг/л	25,0 [19,3; 31,0] p<0,001	20,0 [15,1; 22,5] p<0,001	24,7 [17,0; 29,0] p<0,001	32,7±7,57 p=0,0013	43,9±9,66
ФНП-?, нг/л	110 [90,6; 119] p<0,001	97,8 [80,5; 108] p<0,001	85,8±11,8 p=0,0016	118±9,39 p<0,001	137 [123; 148]

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

У імунометаболічному плані важливе значення мають результати щодо вмісту ФНП-?. У сироватці крові щурів на 45-ту добу перорального введення досліджуваних хімічних речовин вміст цього показника статистично значуще (р<0,001), при порівнянні з контролем, знижувався в середньому в 1,4 раза.

Зміни з боку імуноглобулінів та цитокінів можуть слугувати додатковими прогностичними тестами, що характеризують несприятливий вплив ОЕНФ та їх похідних.

3.2 Вплив на клітинні та гуморальні фактори неспецифічної імунної резистентності організму щурів

Оскільки клітини крові безпосередньо беруть участь як у специфічній, так й неспецифічній імунній відповіді, то вважали за необхідне оцінити показники лейкоцитарної формули за умов тривалої дії ОЕНФ та їх похідних.

До популяції імунних клітин, що визначають високу специфічність імунної відповіді, відносяться лімфоцити. У щурів, яким вводили ОЕНФ та їх похідні у дозі 1/10 ДЛ50, на 45-добу спостерігали статистично значуще (p<0,001), порівняно з контролем, зниження їх вмісту (табл. 3.9). Найбільш виразною зміна цього показника була у випадку введення КМ-ОЕНФ10 (майже в 2 рази), КМ-ОЕНФ6 (в 1,7 раза), КМ-ОЕНФ5 і ОЕНФ12 (в середньому в 1,5 раза), а найменш - у випадку КМ-ОЕНФ4, ОЕНФ4, 8, 10 (в середньому в 1,3 раза).

Аналогічну тенденцію, але менш виразну, виявили й у разі перорального введення речовин у дозі 1/100 ДЛ50 (табл. 3.10). У даному випадку найбільш токсичними були КМ-ОЕНФ5, 6, 10 і ОЕНФ12: вміст лімфоцитів, порівняно з контрольною групою, зменшувався в середньому в 1,3 раза. Виявлена лімфоцитопенія свідчить про розвиток імунодефіцитного стану в організмі щурів за умов тривалого впливу хімічних речовин.

Основним критерієм наявності інтоксикації в організмі є нейтрофільна ланка. На 45-добу дії хімічних речовин у дозі 1/10 ДЛ50 статистично достовірне, по відношенню до контролю, збільшення вмісту паличкоядерних нейтрофілів визначили лише для ОЕНФ4 (в 1,5 раза, p<0,001) і ОЕНФ8 (в 1,2 раза, р=0,036), тоді як для ОЕНФ12 і КМ-ОЕНФ10 спостерігали, навпаки, їх зниження (p<0,001) майже в 2 рази (табл. 3.9).

Таблиця 3.9 Показники лейкоцитарної формули у щурів на 45-ту добу введення оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних у дозі 1/10 ДЛ50 (n=15; Ме [25%; 75%] або М±s)

Речовина	Нейтрофіли, %	Лімфоцити, %	Моноцити, %	Еозинофіли, %
	паличко-ядерні	сегменто-ядерні
ОЕНФ4	6,13±1,36 p<0,001	32,1±3,39 p<0,001	51,9±3,28 p<0,001	6,27±1,22 p<0,001	3 [2; 3] р=0,01
ОЕНФ6	4,93±1,33 р=0,06	39 [37; 44] p<0,001	50 [43; 56] p<0,001	4,87±1,30 p=0,037	1,93±0,62 р=0,59
ОЕНФ8	5 [4; 7] р=0,036	35,1±4,22 p<0,001	53 [50; 63] p<0,001	2,87±1,28 р=0,11	2,07±0,80 р=0,46
ОЕНФ10	3,5 [3; 5] p=0,65	37,6±4,17 p<0,001	52,3±4,45 p<...

Подобные документы

• Молекулярні механізми реалізації нейротропної дії вітаміну РР та його біологічно активних похідних

  Біологічна дія вітаміну РР, його похідних за різних функціональних станів центральної нервової системи. Реалізація нейротропних ефектів вітаміну РР на рівні модуляції процесів зворотного поглинання та вивільнення нейромедіаторів синаптичними закінченнями
  
  автореферат [51,5 K], добавлен 29.03.2009
  

• Вплив ритмічної краніоцеребральної гіпотермії на нейрогуморальні механізми регуляції циклічних процесів репродуктивної системи

  Пошук в експерименті впливу ритмічної краніоцеребральної гіпотермії на нейрогуморальні механізми регуляції циклічних процесів репродуктивної системи в самок-щурів, які перенесли емоційно-больовий стрес. Регуляторні процеси в центральній нервовій системі.
  
  автореферат [612,6 K], добавлен 09.03.2009
  

• Біохімічні механізми впливу свинцю на клітини крові щурів

  Свинець – важкий метал, поширений у земній корі в усьому світі. Потенційний ризик, зв’язаний з свинцем, посилюється тим, що свинець акумулюється як у навколишньому середовищі, так і в кістковій тканині організму. Процеси гемопоезу в організмі тварин.
  
  автореферат [44,1 K], добавлен 07.03.2009
  

• Вплив похідних амінопропанолу з n-алкіларильним радикалом на біоплівки staphylococcus

  Дослідження антимікробної активності похідних амінопропанолів з N-алкіларильним радикалом проти сформованих біоплівках S. aureus. Дослідження впливу сполук та препаратів на плівкоутворення. Ознайомлення з антибіоплівковою активністю гентаміцину.
  
  статья [788,7 K], добавлен 07.02.2018
  

• Патофізіологічні механізми пневмонії на різних етапах її розвитку

  Проблема патогенезу, ранньої діагностики та своєчасного лікування пневмонії. Етіологічні фактори. Формування гострої пневмонії. Стан неспецифічних та специфічних клітинних та гуморальних механізмів пошкодження та захисту в різні періоди захворювання.
  
  автореферат [103,4 K], добавлен 26.01.2009
  

• Масаж біологічно активних точок

  Ознайомлення з історією виникнення точкового масажу. Вивчення "біологічно активних точок" на тілі людини. Оцінка ефективності впливу точкового масажу на організм людини. Аналіз методів впливу на "біологічно активні точки" та оцінка їх ефективності.
  
  контрольная работа [43,4 K], добавлен 18.06.2015
  

• Метаболічні зміни в органах щурів за умов свинцево-кадмієвих токсикозів та їх корекція гепатопротекторами

  Метаболічни зміни у тканинах щурів при умовах коротко- та довготривалого експериментального свинцево-кадмієвого токсикозу і його корекції селенітом натрію та ліолівом. Доцільність використання даних препаратів з метою корекції метаболічних порушень.
  
  автореферат [41,3 K], добавлен 24.03.2009
  

• Розробка лікарських форм

  Принципи створення нових лікарських речовин: етапи їх пошуку, зв'язок між структурою молекул речовин і їх дію на організм, залежність фармакологічної дії від фізичних і хімічних властивостей. Порядок проведення доклінічних і клінічних випробувань.
  
  курсовая работа [716,8 K], добавлен 28.03.2016
  

• Особливості гормонального статусу жінок та його вплив на організм

  Дослідження ролі естрогенів і гестагенів у регуляції функції серцево-судинної системи. Проблеми особливостей гормонального статусу у жінок та його вплив на організм в цілому. Оцінка взаємозв’язку між станом регуляції серця та фазами менструального циклу.
  
  статья [25,9 K], добавлен 31.08.2017
  

• Стан системної гемодинаміки при сполучній дії на організм компонентів шахтного вибуху і електричного струму

  Особливості системної гемодинаміки при дії на організм дозованого електричного струму (50 В, 50 Гц). Порушення при сполучному впливі на щурів комплексу несприятливих виробничих факторів, компонентів шахтного вибуху, моделювання їх одночасної дії.
  
  автореферат [26,9 K], добавлен 10.04.2009
  

• Алкоголь як провідний чинник ризику для здоров'я українців

  Історія пияцтва в Україні. Собріологія, її закони. Міфи про алкоголь. Статистика алкогольної смертності. Особливості впливу алкоголю на дітей і підлітків. Пріоритетні напрями алкогольної політики на найближчі роки. Наслідки вживання алкоголю на організм.
  
  дипломная работа [243,4 K], добавлен 14.03.2013
  

• Лімфоцитопосередковані механізми за умов хронічної гіперімунокомплексемії та вплив на них корвітину в експерименті

  Особливості NO-синтазного та аргіназного шляхів метаболізму L-аргініну у лімфоцитах та ендотеліоцитах при їх сумісній інкубації in vitro, в нормі та за умов хронічної гіперімунокомплексемії та вивчення впливу й можливість корекції цих процесів корвітином.
  
  автореферат [191,7 K], добавлен 29.03.2009
  

• Зміни структурно-функціональних властивостей кісткової тканини у дітей із хронічним пієлонефритом та їхня корекція на різних етапах реабілітації

  Стан фізичного розвитку дітей, хворих на хронічний пієлонефрит, у співвідношенні з кістковим віком. Структурно-функціональні зміни кісткової тканини. Відновлювальний етап та методи корекції порушень для оптимізації комплексної реабілітаційної терапії.
  
  автореферат [86,9 K], добавлен 21.03.2009
  

• Патогенетичні механізми ефективності застосування кардіоліну у хворих на ішемічну хворобу серця з супутньою патологією цукрового діабету

  Патофізіологічні особливості та причини розвитку ішемічної хвороби серця при наявному цукрового діабету 2 типу. Доцільність застосування кардіоліну як допоміжного фітотерапевтичного препарату у хворих. Поліпшення мозкового та коронарного кровотоку.
  
  статья [22,4 K], добавлен 06.09.2017
  

• Вплив основних представників Torch-інфекцій на перебіг та виникнення акушерської патології

  Вивчення стану питання впливу вірусів на перебіг вагітності жінок у роботах вітчизняних та зарубіжних учених. Токсоплазмоз та краснуха як результат впливу Torch-інфекцій на організм вагітних жінок. Аналіз способів лікування та попередження захворювань.
  
  курсовая работа [64,9 K], добавлен 21.03.2014
  

• Шкідливий вплив алкоголю на організм людини

  Алкоголь - отрута, яка негативно впливає на весь організм людини: в першу чергу на центральну нервову систему. Навіть мінімальні дози алкоголю погіршують розумові здібності, ведуть до послаблення пам'яті.
  
  реферат [5,0 K], добавлен 07.06.2006
  

• Мікробіологічне обгрунтування нових підходів до лікування та профілактики стафілококових інфекцій на основі дослідження протимікробних властивостей похідних тіазолідину, фурану, хіноліну, акридину і біологічно активних речовин природного походження

  Локальне і глобальне поширення поліантибіотикорезистентних збудників нозокоміальних і опортуністичних інфекцій. Нові стратегічні підходи до протимікробної терапії. Пошук у стафілококових клітинах нових потенційних мішеней для протимікробних препаратів.
  
  автореферат [112,7 K], добавлен 29.03.2009
  

• Отруєння грибами у дітей

  Вплив на живий організм отрут різного походження. Порушення біохімічних процесів та функцій життєво важливих органів. Головні синдроми та прояви отруєння грибами. Заходи щодо видалення отрути, яка не всмокталася та всмокталася у кров’яне русло.
  
  презентация [343,2 K], добавлен 06.02.2013
  

• Механізми ефективності застосування просталаду у пацієнтів з діабетичною нефропатією

  Основні патогенетичні механізми у розвитку діабетичної нефропатії. Доцільність застосування просталаду як допоміжного фітотерапевтичного препарату у хворих з діабетичною нефропатією. Заспокійливий, загальнозміцнюючий, антимікробний вплив на організм.
  
  статья [30,1 K], добавлен 06.09.2017
  

• Клініко-патогенетичні аспекти йододефіцитних захворювань у дітей шкільного віку в умовах легкої йодної ендемії

  Дослідження впливу легкого йодного дефіциту на виникнення порушень фізичного, статевого, інтелектуального розвитку, психоемоційного стану та когнітивних функцій дітей з урахуванням вікових та статевих особливостей. Лікувально-профілактичні заходи.
  
  автореферат [57,8 K], добавлен 19.03.2009
  

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам