Патофізіологічні механізми розвитку структурно-метаболічних і функціональних порушень за дії на організм оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних

Для печінки щурів коефіцієнт співвідношення шифові основи/(дієни+ТБК-реактанти) при тривалій дії КМ-ОЕНФ5 у дозі 1/10 ДЛ50 статистично значуще (р=0,005), по відношенню до контрольної групи тварин, збільшувався в 1,7 раза.

Таблиця 5.2 Вміст продуктів перекисного окислення ліпідів у гомогенаті печінки та головного мозку щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних (n=15; Ме [25%; 75%] або М±s)

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

Для ОЕНФ12 спостерігали аналогічну тенденцію до зростання коефіцієнта, але воно було недостовірним (р=0,06). Порівняння розподілу коефіцієнту у групі тварин, яким вводили речовини у дозі 1/100 ДЛ50, та контролі між собою, не виявило будь-яких статистично значущих відмінностей (р=0,27 та р=0,152).

Таблиця 5.3 Коефіцієнт співвідношення шифові основи/(дієни+ТБК-реактанти) у сироватці крові, печінці та головному мозку щурів на 45-добу впливу оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних (ум.од.; n=15; Ме [25%; 75%] або М±s)

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

На 45-ту добу дії найбільш токсичних серед досліджуваних речовин у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 - ОЕНФ12 та КМ-ОЕНФ5 - у головному мозку експериментальних тварин відмічали достовірне, порівняно з контролем, зниження значення коефіцієнта в середньому в 2 рази.

У цілому збільшення коефіцієнта співвідношення шифові основи/(дієни+ТБК-реактанти) при тривалій дії ОЕНФ12 та КМ-ОЕНФ5 у сироватці крові та печінці щурів переконливо свідчить про спрямованість процесів у бік утворення токсичних кінцевих продуктів ПОЛ - шифових основ, а його зменшення при дії ОЕНФ12 та КМ-ОЕНФ5 у головному мозку, ОЕНФ8 та КМ-ОЕНФ4 у сироватці крові - про активацію ПОЛ на рівні утворення первинних і вторинних продуктів.

У підгострому експерименті виявлено підвищення інтенсивності спонтанної та індукованої хемілюмінесценції (СХЛ, ІХЛ) у сироватці крові щурів за дії ОЕНФ6, 10, 12 у дозі 1/100 ДЛ50, що також підтверджує інтенсифікацію вільнорадикальних процесів (табл. 5.4).

Рівень СХЛ відображує, як правило, інтенсивність вільнорадикального окиснення тканинних ліпідів. Тому за результатами підвищення її рівня в умовах дії на організм щурів ОЕНФ у дозі 1/100 ДЛ50 можна припустити активацію цього процесу, зокрема, у печінці та головному мозку, де визначали до того ж збільшення продуктів ПОЛ.

На 45-ту добу введення ОЕНФ6, 10, 12 у дозі 1/100 ДЛ50 найбільш високі рівні інтенсивності ХЛ спостерігали при індукції люмінолом, найменш - при індукції перекисом водню та хлорним залізом.

Люмінолзалежна ХЛ дає можливість реєструвати утворення гідроксильного радикалу та супероксидного аніону. Тому отримані результати щодо значного підвищення інтенсивності люмінол-індукованої ХЛ сироватки крові за тривалої дії ОЕНФ у дозі 1/100 ДЛ50 можуть свідчити про підвищення вмісту гідроксильного радикалу та супероксидного аніону.

Таблиця 5.4 Інтенсивність хемілюмінесценції сироватки крові щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів у дозі 1/100 ДЛ50 (n=15; М±s)

Посилення інтенсивності ХЛ надлишком іонів двохвалентного заліза пояснюється розкладенням органічних і неорганічних гідропероксидів з утворенням вільних радикалів і прискоренням вільнорадикального окиснення. Тому отримані результати щодо підвищення інтенсивності ХЛ при додаванні хлорного заліза можуть свідчити про підвищений вміст гідропероксидів у сироватці крові щурів на 45-ту добу введення ОЕНФ6, 10, 12. З іншого боку система Н2О2-індукованої ХЛ дозволяє оцінити ефективність генерації, перш за все, гідроксильного радикалу з пероксиду водню завдяки реакції Фентона (реакція розкладу пероксиду водню з утворенням реакційно здатного гідроксильного радикалу, що протікає у присутності іонів металів перемінної валентності). Тому отримані результати щодо підвищення інтенсивності Н2О2-індукованої ХЛ сироватки крові за тривалої дії ОЕНФ у дозі 1/100 ДЛ50 підтверджують підвищення вмісту гідроксильного радикалу.

На 45-ту добу впливу ОЕНФ12 та КМ-ОЕНФ5 у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 виявили активацію процесів окислювальної модифікації білків, що підтверджувалося підвищенням у сироватці крові вмісту їх карбонільних продуктів - нейтральних альдегід-динітрофенілгідразонів (ДНФГ) і кетон-ДНФГ (356 і 370 нм), а також основних альдегід-ДНФГ (430 нм) (табл. 5.5).

Таблиця 5.5 Вміст карбонільних продуктів (альдегід- та кетондинітрофенілгідразонів) окислення білків сироватки крові щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних (n=15; Ме [25%; 75%] або М±s)

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

Слід підкреслити, що для контрольної групи тварин також характерна наявність ДНФГ, що свідчить про перебіг цих процесів за фізіологічних умов. Крім того, в контрольній групі щурів рівень ДНФГ нейтрального характеру в 9-11 разів перевищував вміст ДНФГ основного характеру, що збігається з даними літератури [235]. Тривалий вплив ОЕНФ12 та КМ-ОЕНФ5 у дозі 1/10 ДЛ50 сприяв статистично значущому (р<0,001), порівняно з контролем, зростанню рівня ДНФГ нейтрального характеру в 1,5-2 рази. Для дози 1/100 ДЛ50 зберігалася аналогічна, але менш виразна тенденція: вміст нейтральних ДНФГ збільшувався в 1,2-1,9 раза (р<0,024). На цьому тлі спостерігали статистично достовірне зростання рівня альдегід-ДНФГ основного характеру при 430 нм: в середньому в 2 рази при дії 1/10 ДЛ50 (р<0,001) та 1,5 раза при дії 1/100 ДЛ50 (р<0,014).

Суттєві зміни рівня основних альдегід-ДНФГ можуть бути пов'язані з посиленим глікозилуванням білків за умов токсичного стресового стану. Доведено, наприклад, збільшення вмісту продуктів неферментативного глікозилування білків при оксидативному стресі [407]. У цілому, збільшення у сироватці крові експериментальних тварин рівня окисно-модифікованих білків може свідчити про виснаження резервно-адаптаційних можливостей організму за умов тривалого впливу ОЕНФ та їх похідних [234].

Для оцінки функціональної активності білків сироватки крові досить надійним методичним підходом є фосфоресцентний аналіз. Природними хромофорами білків є тирозинові та триптофанові залишки амінокислот, які можуть оголюватися за умов втрати компактної високоорганізованої структури білкової молекули.

На 45-ту добу перорального введення щурам ОЕНФ6, 10, 12 у дозі 1/100 ДЛ50 спостерігали підвищення інтенсивності фосфоресценції сироватки крові (табл. 5.6). Особливо це було виражено, по відношенню до контролю, у довгохвильовій області збудження (434 нм) - в середньому в 1,6 раза та короткохвильовій області (297 нм) - в середньому в 1,2 раза.

Виявлене підвищення інтенсивності фосфоресценції сироватки крові щурів за умов тривалого впливу ОЕНФ свідчить про розвиток процесу інактивації білкових молекул за рахунок розгортання їх компактних структур, що тісно пов'язано зі структурно-метаболічними змінами в організмі та розвитком тканинної гіпоксії.

Таблиця 5.6 Інтенсивність фосфоресценції сироватки крові щурів на 45-добу впливу оксиетильованих нонілфенолів у дозі 1/100 ДЛ50 (імп/с; n=15; М±s)

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

Для всебічної оцінки стану окислювального гомеостазу у щурів, яким тривалий час вводили ОЕНФ та їх похідні, досліджували активність NO-синтазної окислювальної системи (табл. 5.7).

Серед продуктів метаболізму оксиду азоту найбільший відсоток виходу мають нітрити та нітрати. Виявлено, що тривале пероральне введення щурам речовин у діючій дозі 1/100 ДЛ50 супроводжується статистично значущим (р<0,001), при порівнянні з контрольною групою тварин, підвищенням у сироватці крові вмісту нітритів у середньому в 1,3; 1,7 та 1,5 раза відповідно для ОЕНФ6, 10, 12. Аналогічну динаміку змін спостерігали і для вмісту нітратів - в 1,3 раза за дії ОЕНФ6, в 1, 4 раза - за дії ОЕНФ10 та в 1,7 раза - за дії ОЕНФ12.

Таблиця 5.7 Стан NO-синтазної окислювальної системи у щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів у дозі 1/100 ДЛ50 (n=15; М±s)

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

Циркулюючий пул оксиду азоту утворює S-нітрозотіоли, які розглядають як буферну систему, що відіграє важливу роль у його зберіганні та транспортуванні. У плазмі крові щурів на 45-добу дії речовин у дозі 1/100 ДЛ50 відмічали достовірне збільшення (р<0,001), по відношенню до контролю, концентрації S-нітрозотіолу (в 1,4; 1,6 та 2,0 раза відповідно для ОЕНФ6, 10, 12) (табл. 5.7).

Утворення оксиду азоту забезпечує фермент NO-синтаза (NOS). Розрізняють декілька молекулярних форм NOS, локалізованих у різних тканинах: нейрональну (nNOS), індуцибельну або макрофагальну (iNOS), ендотеліальну (еNOS). Усі ізоферменти NOS каталізують утворення оксиду азоту, але кожний з них має свої особливості як у механізмах дії та локалізації, так і у біологічному значенні для організму. Доведено, що оксид азоту, утворений під дією iNOS може виступати як джерело вільних радикалів на доповнення до продуктів ПОЛ, а також фактором окислювальної модифікації білків. Ця ізоформа NOS генерує в багато разів більшу кількість оксиду азоту порівняно з іншими формами. Генерований у даному випадку оксид азоту може чинити цитотоксичну дію, що виявляється в гальмуванні їм окислювального фосфорилювання через блокування переносу електронів дихальними ферментами мітохондрій, а також у зниженні клітинних запасів АТФ і НАД+.

На 45-ту добу перорального введення щурам ОЕНФ у дозі 1/100 ДЛ50 спостерігали суттєве зростання (р<0,001) активності іNOS. Так, зміна цього показника за умов впливу ОЕНФ6 становила в 2,1 раза, ОЕНФ10 - в 2,4 раза, а ОЕНФ12 - майже в 2,8 раза. Такі результати також опосередковано доводять підвищення в організмі експериментальних тварин при тривалій дії ОЕНФ процесів, пов'язаних з перекисним окисленням ліпідів та білків. Слід відзначити, що на тлі виявлених змін, відбувалося й менш виразне підвищення (р<0,001), порівняно з контролем, активності еNOS в середньому в 1,7 раза (табл. 5.7).

Для більш повної оцінки стану оксидантно-антиоксидантної системи за умов тривалого впливу на організм тварин ОЕНФ та їх похідних досліджували активність ферментів першої лінії антиоксидантного захисту - супероксиддисмутази (СОД) еритроцитів та каталази крові (табл. 5.8).

На 45-ту добу перорального введення речовин у дозі 1/10 ДЛ50 спостерігали статистично значуще (р<0,001), по відношенню до контролю, зниження активності СОД: в 2,5; 2,2; 1,7 та 1,5 раза відповідно для КМ-ОЕНФ4, КМ-ОЕНФ5, ОЕНФ12 та ОЕНФ8. У випадку 1/100 ДЛ50 виявили протилежну динаміку змін. Так, ОЕНФ12 та КМ-ОЕНФ5 викликали статистично значуще (р<0,001), порівняно з контролем, зниження активності еритроцитарної СОД, що можна розглядати як зрив метаболічної адаптації та антиоксидантного захисту в організмі експериментальних тварин. ОЕНФ8 та КМ-ОЕНФ4, навпаки, у дозі 1/100 ДЛ50 призводили до достовірного підвищення активності СОД відповідно в 1,2 (р=0,006) та 1,5 (р<0,001) раза, що можна трактувати як захисно-пристосувальну реакцію організму на тривалий вплив речовин. Тривалий вплив досліджуваних речовин супроводжувався також зниженням активності каталази крові: в середньому в 1,6 раза у випадку дози 1/10 ДЛ50; в 1,4 раза - 1/100 ДЛ50.

Таблиця 5.8 Активність супероксиддисмутази еритроцитів та каталази крові щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних (n=15; Ме [25%; 75%] або М±s)

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

Виявлене зниження активності каталази та СОД є однією з причин розвитку оксидативного стресу, так як дані ферменти відповідальні за видалення первинних активних форм кисню - супероксидних аніон-радикалів і перекису водню.

Стан антиоксидантних систем та процесів ПОЛ добре відображує антиоксидантно-прооксидантний індекс (АПІ) - співвідношення активності каталази до вмісту ТБК-реактантів (табл. 5.9).

Таблиця 5.9 Антиоксидантно-прооксидантний індекс у щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних (n=15; Ме [25%; 75%] або М±s)

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

У всіх тварин чітко простежувалося статистично значуще (р<0,026), порівняно з контролем, зниження значення АПІ: майже в 4,0 і 2,3 раза для ОЕНФ8 відповідно у дозі 1/10 і 1/100 ДЛ50; в 3,0 і 1,7 раза для КМ-ОЕНФ4; в 2,7 і 2,0 раза для КМ-ОЕНФ5; в 1,8 і 1,4 раза для ОЕНФ12.

Отримані результати переконливо свідчать про значне напруження функціонування в організмі експериментальних тварин оксидантно-антиоксидантної системи у бік збільшення продукції активних форм кисню, активації процесів ПОЛ і окислювальної модифікації білків, здатних подолати бар'єр антиоксидантного захисту. Наслідком таких змін є, як правило, суттєві порушення структурно-функціональних властивостей біологічних мембран. Останні визначаються, перш за все, фосфоліпідним складом, який впливає на їхню проникність для різних речовин і продуктів метаболізму, спряженість та послідовність численних ферментативних процесів. Результати свідчили про зміни співвідношення фосфоліпідних фракцій мембран еритроцитів за умов тривалої токсифікації щурів ОЕНФ6, 10, 12 у діючій дозі 1/100 ДЛ50 (табл. 5.10).

Таблиця 5.10 Вміст фракцій фосфоліпідів у мембранах еритроцитів щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів у дозі 1/100 ДЛ50 (% від загального вмісту фосфоліпідів; n=15; М±s)

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

Спостерігали підвищення, при порівнянні з контролем, відсотка фосфатидилетаноламіну у мембранах еритроцитів щурів в середньому в 1,4 раза при введенні ОЕНФ6, в 1,3 раза - при введенні ОЕНФ10; в 1,2 раза - при введенні ОЕНФ12 у дозі 1/100 ДЛ50. Відсотковий вміст фосфатидилхоліну та кардіоліпіну також підвищувався на 45-ту добу дії речовин у середньому в 1,4 та 2,0 раза відповідно. При цьому відзначали статистично значуще (р<0,001), по відношенню до контролю, зниження вмісту сфінгомієліну, фосфатидилсерину та фосфатидилінозитолу в 1,6; 1,7 та майже в 6,0 раза відповідно для ОЕНФ6, 10, 12. Окремо слід підкреслити суттєве збільшення відсоткового вмісту лізоформ фосфоліпідів у мембранах еритроцитів щурів - лізофосфатидилхоліну та лізофосфатидилетаноламіну - в 2,4 та 3,3 раза відповідно.

Оцінку плинності мембран лімфоцитів та еритроцитів щурів за умов тривалої їх токсифікаціїї ОЕНФ у дозі 1/100 ДЛ50 проводили методом флуоресцентних зондів, використовуючи пірен. Останній бере участь в реакції утворення ексимерів, що лімітується швидкістю дифузії в область жирнокислотних ланцюгів ліпідів. Це дозволяє оцінювати плинність мембран за співвідношенням ексимер/мономер, яке залежить від гідрофобного об'єму, доступного для зонда, а також від рухливості вуглеводневих ланцюгів ліпідів. Порушення білок-ліпідних взаємодій у мембранах внаслідок змін доступного для зонда об'єму призводять, як правило, до змін ексимерізації зонда.

На 45-ту добу перорального введення ОЕНФ6, 10, 12 у дозі 1/100 ДЛ50 спостерігали зниження плинності мембран лімфоцитів та еритроцитів щурів, що підтверджувалося статистично значущим (р<0,001), порівняно з контролем, зниженням значення коефіцієнта ексимерізації пірену: у зоні білок-ліпідних контактів - у середньому в 2,1 раза, у зоні ліпідного бішару - в 1,9 раза (табл. 5.11).

Тривалий вплив ОЕНФ6, 10, 12 у дозі 1/100 ДЛ50 супроводжувався також суттєвим підвищенням проникності мембран еритроцитів щурів. Виявили, по відношенню до контрольної групи тварин, суттєве збільшення швидкості мимовільного виходу іонів калію з еритроцитів, а також індукованого антибіотиком валіноміцином (специфічно зв'язує іони калію та транспортує їх через мембрани завдяки ліпофільній природі) (табл. 5.12).

Таблиця 5.11 Значення коефіцієнта ексимерізації пірену для мембран лімфоцитів та еритроцитів щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів у дозі 1/100 ДЛ50 (470/393 нм; n=15; М±s)

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

Таблиця 5.12 Швидкість мимовільного та індукованого валіноміцином виходу іонів калію з еритроцитів щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів у дозі 1/100 ДЛ50 (n=15; М±s)

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

Сумарна кількість іонів калію із розрахунку на 1 млн еритроцитів за дії ОЕНФ6, 10, 12 у дозі 1/100 ДЛ50 при цьому підвищувалася більш, ніж в 5 разів.

Отже, досліджувані сполуки у дозі 1/100 ДЛ50 здатні викликати суттєві зміни з боку фізико-хімічних властивостей мембран клітин крові, зокрема, перерозподіл вмісту фосфоліпідних мембранних фракцій з наступним порушенням їх плинності та проникності. Ймовірно, ці зміни зумовлені виявленою інтенсифікацією процесів перекисного окислення ліпідів і білків, активацією NO-синтазної окислювальної системи на тлі зниження антиоксидантних ресурсів.

5.2 Активність тіолдисульфідної системи

Тенденція в зміні активності тіолдисульфідної системи у мембранах еритроцитів щурів була однаковою за умов впливу всіх досліджуваних ОЕНФ та їх похідних, як у дозі 1/10 ДЛ50, так й у дозі 1/100 ДЛ50 (табл. 5.13).

Отримані результати свідчили про статистично значуще (р<0,001), порівняно з контролем, зниження вмісту тіолових груп на 45-ту добу спостереження. Доза 1/10 ДЛ50 при цьому виявилася більш токсичною, ніж 1/100 ДЛ50. Так, КМ-ОЕНФ6, 12, 6, 8 та КМ-ОЕНФ4 у дозі 1/10 ДЛ50 знижували вміст HS-груп, по відношенню до контролю, відповідно в 2; 1,8; 1,7; 1,5 та 1,2 раза, а у дозі 1/100 ДЛ50 - в 1,8; 1,6; 1,7; 1,3 та 1,1 раза. На тлі цих змін спостерігали статистично значуще (крім дії КМ-ОЕНФ4 у дозі 1/100 ДЛ50, р=0,299), порівняно з контролем, підвищення кількості дисульфідних зв'язків у білках мембран еритроцитів експериментальних тварин. Найбільш виразну дію при цьому чинили КМ-ОЕНФ6 та ОЕНФ12: збільшували (р<0,001) у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 майже в 2 рази. Для ОЕНФ6, ОЕНФ8 та КМ-ОЕНФ4 у дозі 1/10 ДЛ50 збільшення (р?0,001) рівня -S-S-зв'язків становило відповідно в 1,7; 1,5 та 1,4 раза, а у дозі 1/100 ДЛ50 - в 1,5; 1,2 та 1,1 раза.

Виявлене підвищення рівня дисульфідних зв'язків на тлі зниження тіолових груп за умов тривалої дії досліджуваних речовин може бути однією з причин перебудови режимів життєдіяльності клітини: інтенсивності метаболізму, зміни ритмів ділення тощо [].

Таблиця 5.13 Вміст тіолових груп, дисульфідних зв'язків та їх співвідношення у білках мембран еритроцитів щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних (n=15; Ме [25%; 75%] або М±s)

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

Тестовим якісним показником стану окисно-відновлювальної рівноваги у тіолдисульфідній системі та взагалі адаптаційних резервів організму є тіолдисульфідний коефіцієнт (ТДК) - співвідношення концентрацій тіолових груп та дисульфідних зв'язків. Чим більше величина ТДК, тобто чим більше буферна ємність тіолдисульфідної системи, тим вище рівень резистентності організму [285].

У мембранах еритроцитів щурів, яким тривалий час перорально вводили ОЕНФ та їх похідні у дозі 1/10 ДЛ50, спостерігали статистично значуще (р<0,013), порівняно з контролем, зниження ТДК: найбільш виразне для КМ-ОЕНФ6 (в 4,6 раза), найменш - для КМ-ОЕНФ4 (в 1,6 раза) (табл. 5.13). При введенні тваринам речовин у дозі 1/100 ДЛ50 відзначали аналогічну динаміку змін, але менш характерну: зниження в середньому в 3,5 раза за умов дії КМ-ОЕНФ6 (р<0,005) і ОЕНФ12 (р<0,001), в 2 рази - ОЕНФ6 і ОЕНФ8 (р<0,001). Найменш токсичний серед усіх досліджуваних сполук КМ-ОЕНФ4 у дозі 1/100 ДЛ50 також викликав зниження ТДК, але воно було статистично недостовірним (р=0,071).

Виявлена тенденція до зміни ТДК дозволяє передбачати зниження неспецифічної резистентності організму експериментальних тварин за умов тривалого впливу ОЕНФ та їх похідних.

5.3 Стан системи мікросомального окислення

У процесах біотрансформації ксенобіотиків значна роль відводиться системі мікросомального окислення у гепатоцитах, в якій відбуваються їх детоксикація, елімінація, а у деяких випадках метаболічна активація через послідовний ряд окислювальних реакцій [11, 167, 202, 374, 414]. Окремо слід зазначити, що систему мікросомального окислення розглядають як суттєве джерело утворення АФК [78, 392]. Тому, активація мікросомального окислення може супроводжуватися підвищенням вільнорадикальних реакцій. Провели оцінку стану мікросомального окислення у гепатоцитах щурів при тривалій їх токсифікації ОЕНФ у дозі 1/100 ДЛ50 за дихальною активністю мікросом, вмістом цитохромів Р-450 і b5, активністю оксидоредуктаз.

На 45-ту добу перорального введення експериментальним тваринам ОЕНФ10, 12 спостерігали підвищення (р<0,001), по відношенню до контролю, показників швидкості мікросомального окислення (табл. 5.14). Так, швидкість споживання кисню мікросомами гепатоцитів щурів збільшувалася в середньому в 2,2 раза, а швидкість окислення НАДФН2 - в 2,1 раза. Швидкість споживання кисню віддзеркалює, перш за все, сумарну дихальну активність мікросом гепатоцитів, включаючи також процеси ПОЛ, а швидкість окислення НАДФН2 - дихальну активність мікросом за участі ферментних систем. Визначення споживання кисню в умовах, коли перекисне окислення не заблоковане, віддзеркалює не стільки швидкість окислення НАДФН2, скільки швидкість утворення ліпідних перекисів [11].

Таблиця 5.14 Дихальна активність мікросом гепатоцитів щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів у дозі 1/100 ДЛ50 (n=15; М±s)

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

Про активацію системи мікросомального окислення у гепатоцитах щурів свідчило також статистично значуще (р<0,001), при порівнянні з контрольною групою тварин, підвищення вмісту цитохрому Р-450 в середньому в 2,3 раза при дії ОЕНФ10 та в 2,0 раза - при дії ОЕНФ12 (табл. 5.15). Аналогічну динаміку змін реєстрували у випадку цитохрому b5: збільшення вмісту в 2,2 раза за умов впливу ОЕНФ10 та в 1,9 раза - ОЕНФ12.

Таблиця 5.15 Вміст цитохромів Р-450 і b5 в суспензії мікросом гепатоцитів щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів у дозі 1/100 ДЛ50 (n=15; М±s)

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

Одержані результати корелювали зі збільшенням деметилазної активності мікросом гепатоцитів тварин. Так, на 45-ту добу перорального введення ОЕНФ10 активність о-деметилази зростала (р<0,001), порівняно з контролем, в 2,5 раза, а ОЕНФ12 - в середньому в 2,2 раза (табл. 5.16). Досліджувані сполуки також сприяли підвищенню (р<0,001) активності НАДФН- і НАДН-цитохром с-редуктаз: ОЕНФ10 - в 1,6 раза, а ОЕНФ12 - в 1,4 раза (табл. 5.16).

Таблиця 5.16 Активність мікросомальних ферментів гепатоцитів щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів у дозі 1/100 ДЛ50 (n=15; М±s)

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

Виявлене підвищення ферментативної активності мікросом гепатоцитів експериментальних тварин можна трактувати, з одного боку, як захисно-пристосувальну реакцію організму на введення ксенобіотиків, але з іншого боку, це є несприятливим фактором ініціації потоків електронів з відновлених NAДН і NAДФН відповідно на цитохроми b5 і Р450 з генерацією АФК.

На підставі результатів, наведених у даному розділі роботи, можна зробити наступні висновки.

1. У механізмі тривалої дії ОЕНФ та їх похідних - натрієвих солей карбоксиметилатів оксиетильованих ізононілфенолів на організм щурів суттєвою ланкою є порушення окислювального гомеостазу внаслідок ініціації та інтенсифікації процесів ПОЛ та окислювальної модифікації білків, а також процесів, пов'язаних з метаболізмом оксиду азоту, на тлі виснаження антиоксидантної системи.

2. На 45-ту добу перорального введення щурам ОЕНФ та їх похідних - натрієвих солей карбоксиметилатів оксиетильованих ізононілфенолів у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 виникають неспецифічні метаболічні розлади у вигляді активації процесів ліпопероксидації, що підтверджується підвищенням інтенсивності хемілюмінесценції сироватки крові, вмісту дієнів, ТБК-реактантів і шифових основ в органах та тканинах. Останні внаслідок високої реактогенної здатності та вибірковості у біологічній дії можуть виступати в якості основного ланцюга, що лімітує стан стійкості організму до тривалого впливу досліджуваних речовин через зміну фізико-хімічних характеристик клітинних мембран, активності мембрано-локалізованих та ліпідозалежних ферментів, реактивності нейроендокринної, імунної та інших систем організму.

3. У сироватці крові та печінці щурів тривалий вплив ОЕНФ12 і КМ-ОЕНФ5 викликає превалювання кінцевих продуктів ПОЛ - шифових основ, а у головному мозку - первинних та вторинних продуктів: дієнових кон'югатів та ТБК-реактантів. У сироватці крові щурів за умов тривалої дії ОЕНФ8 і КМ-ОЕНФ4 відбувається активація ПОЛ на рівні утворення дієнових кон'югатів та ТБК-реактантів. Виявлені зміни відбуваються на тлі зниження активності ферментів першої лінії антиоксидантного захисту - супероксиддисмутази еритроцитів та каталази крові.

4. Тривала токсифікація щурів ОЕНФ та їх похідними - натрієвими солями карбоксиметилатів оксиетильованих ізононілфенолів у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 ініціює процес окислювальної модифікації білків з порушенням їх структурно-функціональних властивостей, активацію NO-синтазної окислювальної системи, що підтверджується суттєвим збільшенням вмісту карбонільних продуктів окислення білків, інтенсивності фосфоресценції сироватки крові, рівня S-нітрозотіолу, нітритів та нітратів, активності NO-синтази.

5. На 45-ту добу дії ОЕНФ та їх похідних - натрієвих солей карбоксиметилатів оксиетильованих ізононілфенолів у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 у щурів виникають зміни з боку фізико-хімічних властивостей мембран клітин крові, про що свідчить порушення співвідношення фосфоліпідних фракцій (особливо накопичення лізофосфатидилетаноламіну та лізофосфатидилхоліну) з наступним порушенням їх плинності та проникності. Виявлені зміни зумовлені виявленою інтенсифікацією процесів перекисного окислення ліпідів і білків, активацією NO-синтазної окислювальної системи на тлі зниження антиоксидантних ресурсів.

6. Оксиетильовані нонілфеноли та їх похідні - натрієві солі карбоксиметилатів оксиетильованих ізононілфенолів за умов тривалого перорального введення щурам у дозах 1/10 і 1/100 викликають неспецифічні метаболічні розлади у вигляді порушення активності тіолдисульфідної системи, що підтверджується зниженням вмісту тіолових груп у білках мембран еритроцитів на тлі підвищення вмісту дисульфідних зв'язків. Виявлене порушення рівноваги у тіолдисульфідній системі у бік окислювальних еквівалентів також опосередковано свідчить про розгортання процесів окислювальної модифікації білків, ПОЛ на тлі зниження антиоксидантних ресурсів, неспецифічної резистентності організму.

7. Оксиетильовані нонілфеноли сприяють активації процесів мікросомального окислення у гепатоцитах щурів як пускового механізму зміни оксидантно-антиоксидантного гомеостазу у бік превалювання оксидантів, про що свідчить збільшення дихальної, ферментативної, деметилазної активності мікросом, а також вмісту цитохромів Р-450 і b5.

8. Урахування механізмів порушення стану окислювального гомеостазу при тривалому впливі оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних - натрієвих солей карбоксиметилатів оксиетильованих ізононілфенолів є необхідним при виборі засобів профілактики та лікування інтоксикацій в осіб, які контактують з ними в умовах виробництва і довкілля, та розробці методів ранньої діагностики і профілактики професійно та екологічно обумовленої патології.

РОЗДІЛ 6. СТАН БІОЕНЕРГЕТИЧНИХ ПРОЦЕСІВ У ЩУРІВ ПРИ ТРИВАЛОМУ ПЕРОРАЛЬНОМУ ВВЕДЕННІ ОКСИЕТИЛЬОВАНИХ НОНІЛФЕНОЛІВ ТА ЇХ ПОХІДНИХ

При будь-якому ступені інтоксикації розвиток адаптивних реакцій в організмі йде за двома основними напрямками: власне детоксикація КБ (окислення, зв'язування, виведення) з пошуком резервів щодо забезпечення енергією цього процесу та покриття виникаючого енергодефіциту. Вивчення стану біоенергетичних процесів у цьому зв'язку представляє значний інтерес для розкриття механізмів дії досліджуваних хімічних речовин в організмі експериментальних тварин та пошуку засобів їх патогенетичної корекції.

6.1 Активність аденілнуклеотидної системи

На першому етапі оцінку стану енергетичних процесів у печінці щурів за умов тривалої дії ОЕНФ та їх похідних у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 проводили шляхом визначення активності аденілнуклеотидної системи за вмістом АТФ, АДФ, АМФ та їх співвідношенням.

На 45-ту добу дії ОЕНФ8, ОЕНФ12 і КМ-ОЕНФ5 у дозі 1/10 ДЛ50 спостерігали статистично значуще (р<0,001), по відношенню до контролю, зниження вмісту АТФ відповідно в середньому в 3,8-8,6 раза; вмісту АДФ - в середньому в 2,7-4,2 раза на тлі підвищення вмісту АМФ - в 2,6-4,4 раза (табл. 6.1).

Аналогічну динаміку змін, але менш виразну, реєстрували і за умов дії речовин у дозі 1/100 ДЛ50: зниження рівня АТФ становило в середньому в 3 рази для ОЕНФ8, в 4 рази для ОЕНФ12 та в 5 разів для КМ-ОЕНФ5 (р<0,001), а АДФ менш виразно - в середньому в 2 рази для ОЕНФ8 і ОЕНФ12, в 3 рази для КМ-ОЕНФ5. Рівень АМФ при цій дозі, навпаки, підвищувався в середньому в 1,7 раза (табл. 6.1).

Таблиця 6.1 Вміст аденілових нуклеотидів у печінці щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних (n=15; Ме [25%; 75%] або М±s)

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

Аналогічно КМ-ОЕНФ4, 6, 10 у дозі 1/100 ДЛ50 (ураховуючи однакову тенденцію змін вмісту нуклеотидів за дії ОЕНФ8, ОЕНФ12 і КМ-ОЕНФ5 у випробуваних дозах, дію цих речовин вивчали у випадку 1/100 ДЛ50) на 45-ту добу дії виявили зниження рівня АТФ і АДФ (в середньому в 2 рази) на тлі підвищення рівня АМФ (в середньому в 1,6 раза) (табл. 6.1).

Отримані результати переконливо свідчать про порушення активності аденілнуклеотидної системи у печінці щурів на 45-ту добу дії ОЕНФ та їх похідних. Слід відзначити односпрямовану динаміку змін вмісту аденілових нуклеотидів за умов дії речовин у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 (більш виразну у випадку 1/10 ДЛ50).

Для більш повної та коректної оцінки стану аденілнуклеотидної системи у гепатоцитах щурів за умов тривалого впливу речовин визначали не тільки концентрації її компонентів, а також розраховували коефіцієнти їх співвідношення (табл. 6.2).

Про швидкість синтезу та витрати енергії в клітинах, тобто їх енергетичний статус, можна судити за значенням енергетичного заряду. Енергетичний заряд клітин (ЕЗК) представляє собою співвідношення суми концентрації АТФ і половинної концентрації АДФ до суми концентрацій АТФ, АДФ, АМФ [49]. Виявлено, що на 45-ту добу дії ОЕНФ8, 12 у дозі 1/10 ДЛ50 ЕЗ гепатоцитів щурів статистично значуще (р<0,001), по відношенню до контролю, знижувався приблизно в однаковій мірі в середньому в 3 рази. Вплив ОЕНФ8 у дозі 1/100 ДЛ50 зменшував ЕЗ гепатоцитів експериментальних тварин в 1,7 раза, тоді як ОЕНФ12 - в 2,2 раза. Найбільш суттєвий вплив на ЕЗ гепатоцитів виявив тривалий вплив КМ-ОЕНФ5: у випадку дози 1/10 ДЛ50 спостерігали, порівняно з контролем, зниження в 5,6 раза, а у випадку 1/100 ДЛ50 - в 4,8 раза. Інші похідні ОЕНФ, а саме КМ-ОЕНФ4, 6, 10 у дозі 1/100 ДЛ50 також на 45-ту добу введення зменшували (р<0,001), по відношенню до контролю, значення ЕЗ гепатоцитів тварин відповідно в 1,7; 1,6; 1,8 раза.

Зниження ЕЗ гепатоцитів щурів за умов тривалого впливу ОЕНФ та їх похідних свідчить про переважання процесів енергоспоживання над процесами енергоутворення, а також про значний ризик пошкодження та загибелі клітин (особливо у випадку КМ-ОЕНФ5).

Таблиця 6.2 Співвідношення вмісту аденілових нуклеотидів у печінці щурів на 45-добу введення оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних (ум. од., n=15; Ме [25%; 75%] або М±s)

Примітка: р - рівень значущості порівняно з контролем

Про швидкість мітохондріального дихання в організмі щурів за умов тривалої дії досліджуваних речовин можна судити за коефіцієнтом співвідношення концентрації АТФ до концентрації АДФ (енергетичний потенціал). Для ОЕНФ8 виявлена тенденція до зниження, по відношенню до контролю, енергетичного потенціалу гепатоцитів, але воно було статистично недостовірним (р=0,63 і р=0,152 відповідно для 1/10 і 1/100 ДЛ50). Тривала дія ОЕНФ12 та КМ-ОЕНФ5 у дозі 1/10 ДЛ50 супроводжувалася зниженням (р<0,001), порівняно з контрольною групою тварин, енергетичного потенціалу гепатоцитів в середньому в 2,2 раза, а у дозі 1/100 ДЛ50 відповідно в 2,75 і 2 рази. На 45-ту добу інтоксикації щурів КМ-ОЕНФ4, 6, 10 у дозі 1/100 ДЛ50 також спостерігали зменшення (р<0,001), порівняно з контролем, значення енергетичного потенціалу клітин печінки в середньому в 1,6 раза.

Для підтвердження порушень енергетичного гомеостазу в організмі щурів внаслідок тривалого впливу ОЕНФ та їх похідних розраховували коефіцієнт співвідношення концентрації АТФ до суми концентрацій АДФ і АМФ (індекс фосфорилування). Виявлено суттєве зниження цього показника, при порівнянні з контролем, особливо у випадку дії речовин у дозі 1/10 ДЛ50 (більш, ніж в 10 разів для КМ-ОЕНФ5, в 7,5 раза для ОЕНФ12 і в 5,4 раза для ОЕНФ8). На 45-ту добу впливу речовин у дозі 1/100 ДЛ50 зниження (р<0,001), порівняно з контрольною групою тварин, індекса фосфорилування становило в 6 разів для КМ-ОЕНФ5, у 4 рази для ОЕНФ12, у 3 рази ОЕНФ8 та КМ-ОЕНФ4, 6, у 3,5 раза для КМ-ОЕНФ10.

Необхідність аналізу співвідношення концентрації АДФ до концентрації АМФ зумовлена тим, що цей показник встановлює залежність швидкості дихання не від концентрації окремих компонентів, а від стану фосфорилування системи у цілому (термодинамічний контроль дихання) [49]. Результати переконливо свідчили про зниження цього показника, порівняно з контролем, на 45-ту добу дії речовин, особливо у дозі 1/10 ДЛ50 (більш, ніж в 10 разів для ОЕНФ8 і КМ-ОЕНФ5, в 6,5 раза для ОЕНФ12). Такі похідні ОЕНФ, як КМ-ОЕНФ4, 6, 10 у дозі 1/100 ДЛ50 зменшували (р<0,001), по відношенню до контролю, значення термодинамічного контролю дихання в середньому в 2,4 раза. Зниження термодинамічного контролю дихання у гепатоцитах щурів при тривалому впливі досліджуваних речовин також підтверджує роз'єднання процесів окислення та фосфорилування у дихальному ланцюгу, переважання процесів енергоспоживання над процесами енергоутворення.

Загальний аналіз отриманих результатів свідчить, що тривалий вплив на організм щурів ОЕНФ та їх похідних у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 призводить до зниження ступеня «запов...