Патофізіологічні механізми розвитку структурно-метаболічних і функціональних порушень за дії на організм оксиетильованих нонілфенолів та їх похідних

Згідно з метою та задачами роботи опрацьовано методично визначену програму досліджень із застосуванням адекватних інформативних методів, основними етапами якої було оцінити:

- стан імунної системи за лейкоцитарною формулою, вмістом субпопуляцій лімфоцитів, імуноглобулінів, цитокінів, білків гострої фази (гаптоглобіну, церулоплазміну, фібриногену), лізоциму та фагоцитарною активністю нейтрофілів;

- активність процесів нейрогуморальної регуляції за вмістом у головному мозку щурів ДОФА, дофаміну, норадреналіну, серотоніну, триптофану, глутамату, аспартату, гліцину, ГАМК та гормональним спектром сироватки крові;

- стан білкового обміну за рівнем у сироватці крові амінокислот, пірувату, ?-амінобутирату, таурину, орнітину, загального білка, сечовини, креатиніну, альбуміну;

- стан мінерального обміну за вмістом у сироватці крові та еритроцитах калію, натрію, кальцію, магнію, фосфору, заліза, цинку, міді, марганцю;

- стан оксидантно-антиоксидантної системи за рівнем продуктів перекисного окислення ліпідів та окисної модифікації білків, метаболітів оксиду азоту; активністю супероксиддисмутази еритроцитів та каталази крові;

- стан клітинних мембран за фосфоліпідним складом і проникністю мембран еритроцитів; плинністю мембран еритроцитів і лімфоцитів;

- активність мікросомального окислення та окисно-відновлювальних процесів за швидкістю споживання кисню та окисленням НАДФН2, вмістом цитохромів Р-450 та b5, активністю НАД(Ф)Н-цитохром с - редуктаз та о-деметилази у мікросомальній фракції гепатоцитів; вмістом тіолових і дисульфідних зв'язків у білках мембран еритроцитів;

- стан енергетичних процесів за вмістом АТФ, АДФ, АМФ у печінці та активністю дихального ланцюга мітохондрій гепатоцитів.

У роботі використано зразки речовин з регламентованими фізико-хімічними характеристиками: ОЕНФ з числом оксиетильованих груп 4, 6, 8, 10, 12 (ОЕНФ4, 6, 8, 10, 12) та КМ-ОЕНФ з числом оксиетильованих груп 4, 5, 6, 10 (КМ-ОЕНФ4, 5, 6, 10). Експерименти проведено на статевозрілих щурах-самцях лінії WAG, масою 180-220 г, яких піддавали пероральній затравці за допомогою зонда водними розчинами речовин щоденно одноразово протягом 45 діб у дозах 1/10, 1/100 і 1/1000 ДЛ50. Середньолетальні дози становлять для ОЕНФ4 - 5,8 г/кг; ОЕНФ6 - 4,2 г/кг; ОЕНФ8 - 5,1 г/кг; ОЕНФ10 - 4,3 г/кг; ОЕНФ12 - 3,4 г/кг; КМ-ОЕНФ4 - 6,1 г/кг; КМ-ОЕНФ5 - 2,8 г/кг; КМ-ОЕНФ6 - 2,2 г/кг; КМ-ОЕНФ10 - 3,2 г/кг маси тіла. За параметрами токсичності ОЕНФ та їх похідні відносяться до помірно- та малотоксичних речовин (3-4 клас небезпеки).

Слід зазначити, що введення речовин у дозі 1/1000 ДЛ50 не викликає змін досліджуваних показників у щурів, що дозволяє її визначити як недіючу. Доза 1/10 ДЛ50 виявляється для всіх речовин токсичною, а 1/100 ДЛ50 - діючою.

Динаміку змін показників, передбачених програмою дослідження, в дослідних групах тварин оцінювали по відношенню до контрольної групи.

Зовнішньому впливу, зокрема хімічному, однією з перших піддається імунна система, яка відіграє важливу роль у формуванні адаптаційних і захисних реакцій організму. Напруження стану імунної системи так чи інакше призводить до порушення функціонування інших систем і виникнення патології [92, 112, 113, 114, 119, 127, 282, 352]. Розкриття патофізіологічних механізмів дії ОЕНФ та їх похідних вважали доцільним розпочати саме зі стану імунної системи у піддослідних тварин.

Тривалий вплив досліджуваних речовин викликає у щурів виразну лімфоцитопенію, що свідчить про розвиток імунодефіцитного стану. Крім того, у периферичній крові експериментальних тварин відбуваються зміни відносного вмісту загальної популяції Т-лімфоцитів (СD3), Т-хелперів/індукторів (СD4), Т-цитотоксичних лімфоцитів/супресорів (СD8) і В-лімфоцитів (СD19). Так, наприклад, ОЕНФ10 і КМ-ОЕНФ5, 6, 10 у діючій дозі 1/100 ДЛ50 знижують рівень Т-лімфоцитів, що свідчить про дефіцит Т-клітинних механізмів захисту. Серед імунорегулюючих субпопуляцій Т-лімфоцитів також спостерігається зниження в середньому в 1,5 раза Т-хелперів, Т-супресорів. На 45-ту добу токсифікації тварин визначається тенденція до зниження відносного вмісту СD19-лімфоцитів (особливо у випадку ОЕНФ10, КМ-ОЕНФ5, 6, 10 - у середньому в 1,5-2,0 раза), що свідчить про формування недостатності гуморального ланцюга імунітету. У цілому можна стверджувати про порушення Т-клітинного ланцюга імунітету щурів при тривалому пероральному введенні досліджуваних хімічних речовин у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50, що виявляється зниженням загальної кількості лейкоцитів і лімфоцитів у периферичній крові, відсоткового вмісту зрілих Т-лімфоцитів за рахунок Т-хелперів-індукторів і Т-супресорів/цитотоксичних клітин. Зміна загальної кількості лейкоцитів відображує, як правило, стан кровотворних органів та їх реакцію на шкідливі впливи. Зменшення числа білих клітин крові лейкопенія може бути наслідком пригнічення функції кровотворних органів, їх виснаження або підвищеного розпаду лейкоцитів. Зниження кількості Т-лімфоцитів та їх субпопуляцій також характеризує недостатність клітинного ланцюга імунітету та зниження резистентності організму до дії досліджуваних хімічних речовин. Підвищення імунорегуляторного індекса у випадку найбільш токсичних натрієвих солей карбоксиметилатів оксиетильованих ізононілфенолів КМ-ОЕНФ5, 6 у дозі 1/100 ДЛ50 свідчить про переважне пригнічення продукції СD8-лімфоцитів.

В-лімфоцити характеризуються наявністю на їх поверхні рецепторів для розпізнавання антигенів, основу яких складають молекули імуноглобулінів. Взаємодія рецептора з антигеном ініціює диференціювання В-лімфоцитів у плазматичні клітини, які секретують імуноглобуліни. Порушення функціонування В-лімфоцитів може призвести до зниження антитілоутворення. Тривалий вплив ОЕНФ та їх похідних у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 супроводжується зниженням у сироватці крові рівня Ig А в середньому в 1,5-3,0 раза, що підтверджує формування недостатності гуморального та місцевого імунітету. Досліджувані речовини сприяють зменшенню вмісту IgМ в 1,5-2,0 раза. Оскільки IgМ з'являються на першому етапі імунної відповіді та знаходяться в основному в судинному руслі, вони відіграють важливу захисну роль на ранніх стадіях токсемії. Виявлене зниження вмісту IgМ за умов тривалої дії ОЕНФ та їх похідних на організм експериментальних тварин також свідчить про недостатність гуморального імунітету, порушення їх синтезу або посилення катаболізму. На 45-ту добу токсифікації тварин відзначється зниження у сироватці крові рівня IgG (для дози 1/10 ДЛ50 - в 1,4-2,0 раза, а 1/100 ДЛ50 - в середньому в 1,2-1,3 раза), що відображує виснаження захисної ролі антитіл цього класу.

Адекватна імунна відповідь ґрунтується на балансі клітинно-опосередкованих і гуморальних імунних реакцій, розвиток яких підтримується та регулюється цитокінами [51, 134, 143, 339, 373]. Тривале пероральне введення щурам ОЕНФ та їх похідних у діючій дозі 1/100 ДЛ50 порушує цитокіновий профіль сироватки крові. Це підтверджується зниженням рівня ІЛ-1? (в середньому в 1,4-2,0 раза), ІЛ-2 (в 1,3-2,0 раза), ІЛ-4 (в 1,3-2,0 раза), ІЛ-6 (в 1,6-1,8 раза), ІЛ-8 (в 1,7-2,4 раза). Прозапальний цитокін ІЛ-1? має чисельні загальні ефекти, сприяє розвитку системного характеру патологічного процесу шляхом формування аутоантитіл і підвищення концентрації у крові С-реактивного білка. Його зниження є важливим діагностичним критерієм хронічного перебігу запального процесу в організмі. Цитокін ІЛ-2 розглядається як регуляторний, здатний компенсувати прояви імунної недостатності, відновлювати баланс Т-хелперів, що призводить до регуляції продукції проти- та прозапальних цитокінів. Зниження його продукції за умов тривалого впливу ОЕНФ та їх похідних є підтвердженням виникнення Т-клітинного імунодефіциту. До маркерів аутоімунних і алергійних процесів відноситься ІЛ-4, який обумовлює активацію гуморального ланцюга імунної системи, стимулює проліферацію та диференціювання В-клітин, синтез загального IgЕ, а також інгібує моноцити й макрофаги, продукцію ФНП-?. Виявлене зниження секреції ІЛ-4 може супроводжуватися пригніченням процесу антигенної стимуляції Т- і В-лімфоцитів, макрофагів, тучних клітин, базофілів, стромальних клітин, гемопоетичних попередників тощо. Біологічна роль ІЛ-6, по-перше, полягає в індукції відновлювальних механізмів та активації імунного захисту (активація та диференціювання Т-клітин, визрівання В-клітин, посилення гемопоезу). Поряд з цим також відома гальмівна дія ІЛ-6 на запальну реакцію шляхом гальмування синтезу ряду прозапальних субстанцій, в тому числі ФНП-?. Виявлене зменшення рівня ІЛ-6 за умов тривалої дії досліджуваних хімічних речовин може призвести до пригнічення їх функціональної активності та зниження гуморальної імунної відповіді. Цитокін ІЛ-8 продукується моноцитами та макрофагами, виконує роль індуктора гострих запальних реакцій, викликаючи експресію молекул міжклітинної адгезії та посилюючи адгезію нейтрофілів до ендотеліальних клітин і субендотеліальних матричних білків, що свідчить про його основну роль в опосередкуванні запальної відповіді. Зниження його продукції при тривалій дії ОЕНФ та їх похідних є однією з причин пригнічення клітинного та гуморального імунітету. До цитокінів з виразним протизапальним ефектом відноситься ІЛ-10, що продукується Т-клітинами і розглядається як антагоніст ряду інших цитокінів. ІЛ-10 пригнічує продукцію прозапальних цитокінів, проліферативну відповідь Т-клітин на антигени і мітогени, а також зменшує секрецію активованими моноцитами ІЛ-1?, ФНП-?, ІЛ-6. Але одночасно ІЛ-10 може стимулювати синтез IgE. У результаті він сприяє розвитку гуморальної складової імунної відповіді. За умов тривалої дії досліджуваних КБ у дозі 1/100 ДЛ50 на організм щурів також відзначається зниження рівня цього цитокіну у сироватці крові в середньому в 1,3-2,0 раза, що вказує на порушення функціонального стану захисних систем.

У імунометаболічному плані важливе значення мають результати щодо вмісту ФНП-?. У сироватці крові щурів на 45-ту добу перорального введення досліджуваних хімічних речовин вміст цього показника також знижується в середньому в 1,2-1,6 раза. ФНП-? продукується як клітинами імунної системи (В- і Т-лімфоцитами, базофілами, еозинофілами, дендритними клітинами, NK-клітинами, нейтрофілами), так й іншими типами клітин (астроцитами, фібро-бластами, гліальними клітинами, кератиноцитами), однак основними продуцентами є моноцити та тканинні макрофаги. Низькі рівні ФНП-? за умов тривалого впливу ОЕНФ та їх похідних можуть бути пов'язані з недостатньою стимуляцією макрофагального захисту організму щурів.

Отже, ОЕНФ та їх похідні - натрієві солі карбоксиметилатів оксиетильованих ізононілфенолів на 45-ту добу дії у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 призводять до порушення специфічної імунної резистентності організму експериментальних тварин, що підтверджується, перш за все, зниженням в крові відсоткового вмісту Т-лімфоцитів за рахунок Т-хелперів і Т-супресорів, В-лімфоцитів (СD19), імуноглобулінів, інтерлейкінів, ФНП-?. Але тривала токсифікація піддослідних тварин викликає й зміну показників неспецифічної імунної резистентності.

Основним критерієм наявності інтоксикації в організмі є нейтрофільна ланка. Збільшення вмісту паличкоядерних нейтрофілів спостерігається лише для дії ОЕНФ4, 8 (в 1,2-1,5 раза) у дозі 1/10 ДЛ50, тоді як для ОЕНФ12 і КМ-ОЕНФ10, навпаки, знижують майже в 2,0 раза. У випадку дози 1/100 ДЛ50 визначається зменшення їх рівня для ОЕНФ4, 12 в середньому в 1,4 раза, а для ОЕНФ10 - збільшення в 1,3 раза. Інші хімічні речовини у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 не викликають змін з боку цього показника. На цьому тлі спостерігається підвищення вмісту сегментоядерних нейтрофілів при пероральному введенні щурам досліджуваних речовин у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50. У загальному плані підвищення нейтрофілів свідчить про наявність інтоксикації, а їх зниження, можливо, відбувається за рахунок пригнічення процесів кровотворення або внаслідок виснаження організму на тлі тривалої інтоксикації. Поряд з нейтрофілами найбільш філогенетично старим елементом клітинного імунітету є моноцити. Речовини у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 практично не впливають на їх рівень, лише для КМ-ОЕНФ10, ОЕНФ4, 6, 12 у дозі 1/10 ДЛ50 і для ОЕНФ12, КМ-ОЕНФ10 у дозі 1/100 ДЛ50 спостерігається незначна тенденція до підвищення, що можна розглядати як захисну реакцію організму щурів на тривалу токсифікацію. На 45-ту добу дії ОЕНФ та їх похідних у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 у межах фізіологічної норми знаходиться вміст еозинофілів, але при цьому окреслюється тенденція до його збільшення.

У якості універсального ефектора гомеостазу, що реагує на різноманітні сигнали щодо дестабілізації внутрішнього середовища організму розглядають фагоцитоз. Досліджувані речовини на 45-ту добу дії, у випадку дози 1/10 ДЛ50 знижують фагоцитарну активність нейтрофілів, про що свідчить зменшення фагоцитарного числа, індекса поглинання та перетравлення, абсолютних показників поглинання та перетравлення по відношенню до золотистого стафілококу (штам 209). Для дози 1/100 ДЛ50 на 45-ту добу експерименту виявляється інша динаміка змін: для найбільш токсичних речовин (наприклад, КМ-ОЕНФ5, 6) зниження фагоцитарного числа, індекса поглинання та перетравлення, абсолютних показників поглинання та перетравлення стафілококів, тоді як для найменш токсичних (наприклад, ОЕНФ4 і КМ-ОЕНФ4) - їх збільшення, що можна розглядати як захисно-компенсаторну реакцію організму експериментальних тварин на тривалу токсифікацію. Виявлене падіння фагоцитарної активності нейтрофілів у щурів на тлі тривалого введення досліджуваних хімічних речовин свідчить про зниження функціональних резервів клітин та є прогностично несприятливою ознакою.

До гуморальних факторів неспецифічної імунної резистентності організму відносяться білки гострої фази, які синтезуються печінкою: транспортні - церулоплазмін, трансферин, гаптоглобін; інгібітори протеїназ - ?1-антитрипсин, ?2-макроглобулін; фактори коагуляції та фібринолізу (протромбін, фібриноген) тощо [134]. У нормі вони присутні в крові у референтних концентраціях, але при пошкодженні тканин їх рівень досить значно підвищується, що дозволяє розглядати їх як індикатори запальної відповіді. З іншого боку, відносна стабільність процесів обміну білків гострої фази за нормальних фізіологічних умов та досить швидке відхилення їх вмісту від норми за умов загострення патологічних процесів вважається надійним критерієм при дослідженні гомеостатичної функції організму. Виявлено, що тривалий вплив найбільш токсичних КМ-ОЕНФ4, 5, 6, і ОЕНФ4 у дозі 1/10 ДЛ50 супроводжується зниженням вмісту у крові щурів гаптоглобіну (в 1,5 раза), церулоплазміну (в 1,4 раза) та фібриногену (в 1,3 раза). Для найменш токсичних ОЕНФ4 і КМ-ОЕНФ4 у цій дозі, навпаки, рівень гаптоглобіну та церулоплазміну підвищується в середньому в 1,3-1,5 раза. Слід відзначити, що рівень фібриногену в плазмі крові щурів при пероральному введенні речовин у дозі 1/100 ДЛ50 практично не змінюється. Виявлене зниження вмісту білків гострої фази в крові піддослідних тварин свідчить, перш за все, про порушення білоксинтезуючої функції печінки, яка відіграє важливу роль у формуванні клітинної та гуморальної ланок імунної системи. Ураження печінки призводить до значних змін функціонального імунітету, зокрема, до зниження активності неспецифічної реактивності та розвитку імунного дистресу [114]. Підвищення вмісту білків гострої фази можна розглядати як адаптаційну реакцію організму на тривалу дію хімічних речовин у дозі 1/100 ДЛ50.

До вагомих факторів неспецифічної імунної резистентності організму відноситься антибактеріальний фермент - лізоцим. На 45-ту добу дії речовин у дозі 1/10 ДЛ50 його вміст у сироватці крові щурів знижується в середньому в 1,3-1,8 раза. Для дози 1/100 ДЛ50 відмічається незначне зменшення вмісту цього показника лише для КМ-ОЕНФ4, 5, 6 в середньому 1,2 раза. Виявлена динаміка змін вмісту лізоциму також підтверджує пригнічення неспецифічної імунної резистентності організму щурів та зниження антибактеріального захисту.

Таким чином, досліджувані ОЕНФ та їх похідні за умов тривалого перорального введення щурам у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 справляють імунотоксичний ефект, призводячи до порушення захисної функції імунної системи. Кумуляція змін окремих компартментів імунного захисту, ймовірно, реалізується через порушення структурної цілісності та функціональної повноцінності імунної системи в цілому.

Опірність організму до впливу несприятливих для здоров'я факторів і ймовірність виникнення патологічних процесів багато в чому визначаються станом фізіологічних систем неспецифічної резистентності, надійністю механізмів адаптації [272, 285, 300]. Біологічний сенс і характер останніх полягають в забезпеченні відносної динамічної сталості організму на основі автоматичної саморегуляції [52, 175, 206, 274, 277, 338]. Кінцевий результат мобілізації адаптаційних механізмів - пристосування організму до нових умов зовнішнього і внутрішнього середовища, або неспроможність систем неспецифічного захисту, що має наслідком розвиток патологічних станів, - залежить від ряду умов і факторів: сили і тривалості дії подразника, індивідуальних, вікових, статевих, видових особливостей організму та іншого. Механізми неспецифічної резистентності включають різні рівні структурної організації біосистем: субмолекулярний, молекулярний, надмолекулярний, субклітинний, клітинний, органо-тканинний, організменний [175, 285]. Провідну роль у механізмах адаптації відіграють процеси нейроендокринної регуляції. Викликане екстремальним фактором збудження вищих вегетативних центрів, активація адренергічної та гіпоталамо-гіпофізарно-наднадниркової систем призводять до біохімічних зсувів з метою мобілізації резервів організму, що дозволяють йому протистояти шкідливій дії фактора [47, 133, 196, 197, 318, 345]. З огляду на вище наведене, задачами даної роботи було оцінити стан моноамінергічних та аміноацидергічних систем за вмістом у головному мозку щурів біогенних моноамінів, їх попередників та нейроактивних амінокислот на тлі тривалої токсифікації досліджуваними хімічними речовинами.

Доведено, що ОЕНФ та їх похідні на 45-ту добу перорального введення піддослідним тваринам у дозі 1/10 ДЛ50 викликають зниження моноамінергічної активності головного мозку, що підтверджується зменшенням рівня норадреналіну, серотоніну та його попередника триптофану на тлі зростання вмісту дофаміну. Виникаюче підвищення рівня дофаміну на тлі зниження норадреналіну може бути пов'язаним зі зміною активності ферментів їх синтезу та метаболізму, наприклад, зі зростанням активності ДОФА-декарбоксилази, зниженням активності дофамін-бета-оксидази. Однак, одержані результати більше свідчать про деяке виснаження запасів катехоламінів у нервових клітинах щурів завдяки їх участі у патогенезі порушень внаслідок тривалої дії досліджуваних речовин у токсичній дозі 1/10 ДЛ50. Зниження у головному мозку піддослідних тварин рівня серотоніну, ймовірно, пов'язано з декількома можливими причинами: виснаженням його запасів внаслідок участі у різних патологічних реакціях; зменшенням синтезу в умовах порушення метаболічних процесів; зниженням функціонування регуляторних структур головного мозку щурів.

За умов тривалого введення речовин у дозі 1/100 ДЛ50, навпаки, відбувається посилення синтезу моноамінів (дофаміну, норадреналіну, серотоніну), що дозволяє розглядати це як захисно-компенсаторну реакцію організму щурів. Такий характер свідчить про стимулювання активності клітин, що синтезують норадреналін. При цьому зростання рівня дофаміну може відбуватися через активацію ?- і ?-адренорецепторів. Такий вплив звичайно пов'язують не тільки з безпосередньою стимуляцією цих рецепторів, а також зі здатністю дофаміну вивільняти норадреналін з гранулярних пресинаптичних депо, тобто оказувати опосередковану адреноміметичну дію [171]. Дофамін і норадреналін, крім того, сприяють адаптації організму до стресових ситуацій, зокрема спровокованих такими хімічними факторами, як ОЕНФ та їх похідні. Аналіз результатів у випадку дії 1/100 ДЛ50 також дозволяє припустити можливе збільшення проникності гематоенцефалічного бар'єру для триптофану та стимуляцію синтезу серотоніну в головному мозку, з метою його участю, перш за все, в адаптаційно-пристосувальних реакціях.

У передачі нервових імпульсів у ЦНС та на периферії принципово важлива роль належить кільком амінокислотам, одні з яких виконують функцію збуджувальних, інші - гальмівних нейротрансмітерів. До числа перших відносяться кислі (дикарбонові) амінокислоти глутамат та аспартат; до другої групи належать гама-амінобутират і гліцин. Порушення їх вмісту є однією з причин виникнення різних патологічних процесів [142, 259].

Широко розповсюдженими практично у всіх структурах головного мозку теплокровних є глутаматергічні та глутаматрецептивні нейрони, що свідчить про важливість цього типу медіаторної передачі [84]. Доведено, що нейромедіаторні амінокислоти та їх рецептори беруть участь у фундаментальних процесах нервової діяльності: синаптичній пластичності, регуляції полімодальних сенсорних систем мозку, м'язового тонусу, фізіологічних механізмах тривоги, чутливості мозгу до гіпоксії тощо [153, 259, 334]. Окремо слід відзначити, що активація глутаматних рецепторів є одним із шляхів ініціювання продукції вільних радикалів за рахунок кальцій-залежної активації каскаду арахідонової кислоти, продукції оксиду азоту [155, 334].

У патофізіологічних механізмах дії ОЕНФ та їх похідних - натрієвих солей карбоксиметилатів оксиетильованих ізононілфенолів однією із ланок є порушення аміноацидергічних систем головного мозку щурів. Тривалий вплив речовин у дозі 1/10 ДЛ50 супроводжується підвищенням вмісту збуджувальних амінокислот (глутамату, аспартату) на тлі зниження гальмівних (гліцину, гама-амінобутирату). Такі результати опосередковано свідчать про виснаження адаптаційних можливостей організму щурів з розвитком іонного дисбалансу, утворенням вільних радикалів, які сприяють вивільненню надлишкової кількості глутамату пресинаптичними нервовими закінченнями, що може призвести до реалізації його ексайтотоксичного ефекту. Сутність останнього полягає у гіперстимуляції медіаторами збудження NMDA-рецепторів, які провокують дилатацію кальцієвих каналів, масивне надходження кальцію в клітини з подальшою активацією протеаз і фосфоліпаз. У результаті цього, нейрони та глія становляться об'єктом впливу каскаду нейродеструктивних процесів, що викликають порушення їх структурно-функціональної цілісності [324]. Тривалий вплив досліджуваних речовин у дозі 1/100 ДЛ50, навпаки, супроводжується зниженням вмісту збуджувальних амінокислот (глутамату, аспартату) на тлі підвищення гальмівних (гліцину, гама-амінобутирату), що опосередковано свідчить про включення захисно-пристосувальних механізмів в організмі експериментальних тварин. Як відомо, гальмування обмежує розповсюдження збудження на інші нервові структури, попереджує порушення їх нормального функціонування, забезпечує захист організму від пошкоджуючої дії факторів довкілля.

До систем, що гостро реагують на вплив хімічних факторів навколишнього середовища, відноситься й ендокринна система у силу своєї регуляторної функції, реактивності, пластичності [118, 318, 350]. Більш того, на даний час набула широкого поширення теорія дії багатьох КБ як ендокринних роз'єднувачів - дисрапторів, що порушують нормальне функціонування ендокринної системи (синтез, секрецію, транспорт, зв'язування, дію або елімінацію власних гормонів організму), призводячи також до виникнення різного роду патологічних станів [271, 322]. Ендокринні дисраптори включають до себе гетерогенну групу хімічних речовин (наприклад, поліхлоровані біфеніли, деякі метали, пестициди, пластифікатори та інші) з різними функціями, загальною властивістю яких є здатність викликати порушення функціонування ендокринної системи. Отже, зміна гормонального профілю також може вважатися одним із критеріїв впливу хімічних чинників довкілля. Найбільш поширеним у цьому плані є визначення вмісту гормонів гіпофізу, щитоподібної, наднирникових та статевих залоз. Але для отримання цілісної картини та визначення ступеня впливу екологічних факторів на гормональний профіль бажано визначення й інших груп гормонів. що було дотримано у даному дослідженні. Крім того, наявність даних щодо гормонального профілю сироваткі крові в поєднанні з результатами оцінки інших систем можуть бути вагомими свідченнями впливу хімічних факторів довкілля.

Тривала токсифікація організму щурів ОЕНФ та їх похідними у дозі 1/10 ДЛ50 викликає зниження вмісту у сироватці крові адреналіну, тироксину, мелатоніну на тлі підвищення рівня кортикотропіну, тиреотропіну, кортизолу, що свідчить про формування напруженого адаптивного стану з початковими ознаками виснаження захисно-компенсаторних механізмів. Тривала дія досліджуваних речовин у дозі 1/100 ДЛ50 супроводжується підвищенням вмісту у сироватці крові щурів кортикотропіну, кортизолу, адреналіну, тироксину на тлі зменшення рівня тиреотропіну, мелатоніну, що свідчить про формування стану організму, спрямованого на збереження більш стабільних гомеостатичних параметрів. Наднирники, як периферійна ланка гіпоталамо-гіпофізарно-наднирникової системи, є ендокринним ефектором адаптивної і стрес-реалізуючої систем, що забезпечують розвиток компенсаторно-пристосувальних реакцій та відповідь організму на різні екстремальні дії. Любий фізіологічний або екзогенний стресорний вплив на організм призводить до стимуляції секреції кортикотропіну і відповідно кортизолу, забезпечуючи, тим самим, адаптацію організму [402]. Тому підвищення вмісту кортикотропіну та кортизолу свідчить, перш за все, про необхідність їх участі у реалізації адаптаційних реакцій в організмі щурів. Гіперпродукція глюкокортикоїдів, як правило, викликає посилення глюконеогенезу, забезпечуючи легко доступне джерело енергії для реакцій адаптації.

Виявлене збільшення вмісту тиреотропіну при впливі дози 1/10 ДЛ50 можна пов'язати зі зменшенням секреції тироксину за механізмом негативного зворотного зв'язку. Аналогічно можна пояснити падіння рівня тиреотропіну на 45-ту добу експерименту при дії речовин у дозі 1/100 ДЛ50 на тлі гіперпродукції щитоподібною залозою тироксину. Але у цілому спостережувані зміни вмісту тиреотропіну та тироксину свідчать про формування дисфункції щитоподібної залози, десинхронізацію ритмів гіпофізарно-тиреоїдного ланцюга, що призводить до порушення систем управління гомеостатичної функції організму за умов негативної дії досліджуваних ОЕНФ та їх похідних.

Виявлене зниження секреції мелатоніну за умов тривалого впливу досліджуваних ОЕНФ та їх похідних у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 є причиною порушення численних його ефектів, зокрема, діяльності біоритмів організму, антиоксидантного захисту, імуномодулюючого впливу, а також фізіологічних процесів, пов'язаних з діяльністю епіфізу, зокрема, адаптаційних [9, 15].

Тривале пероральне введення щурам досліджуваних речовин викликає зміни вмісту у сироватці крові інших гормонів, що мають свій внесок у формування адаптаційно-пристосувальних механізмів. На 45-ту добу введення речовин щурам-самцям у дозі 1/100 ДЛ50 реєструється зниження вмісту інсуліну, кальцитоніну, соматотропіну, тестостерону на тлі підвищення рівня глюкагону, паратирину; щурам-самицям - зниження вмісту фоллітропіну, пролактину, лютропіну, естрадіолу.

Отже, виявлене напруження функціональних резервів та компенсаторних механізмів ендокринної системи при тривалій дії досліджуваних речовин на організм щурів, особливо у дозі 1/10 ДЛ50, може призвести до виснаження її секреторної здатності, а неузгодженість центральних і периферійних елементів, зворотних зв'язків - до гормональної дисрегуляції метаболічних процесів з перевищенням катаболічних над анаболічними, що формують дистрофічні та деструктивні порушення в органах і тканинах. Для підтвердження цього припущення провели оцінку динаміки змін деяких показників стану білкового та мінерального обміну за умов тривалої дії досліджуваних речовин.

На 45-ту добу перорального введення ОЕНФ12 у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 у плазмі крові піддослідних тварин виявляються зміни амінокислотного спектра: в середньому в 2,0 раза зниження вмісту гліцину, цистеїну, треоніну, серину, аланіну, метіоніну, ізолейцину, валіну, тирозину, фенілаланіну, лізину, триптофану, лейцину на тлі підвищення аспартату, аспарагіну, глутамату, глутаміну, аргініну, проліну, оксипроліну, гістидину. Крім того, тривала токсифікація щурів ОЕНФ12 сприяє підвищенню вмісту у сироватці крові щурів пірувату (продукту, на який перетворюються деякі амінокислоти - аланін, цистеїн, гліцин, треонін, серин) в середньому в 1,9-2,9 раза. У цей термін спостереження у сироватці крові щурів знижується вміст ?-амінобутирату та таурину (продуктів декарбоксилування глутамату та цистеїну) в середньому в 1,5-2,4 раза, орнітину (ключового метаболіту циклу уреогенезу, продукту гідролізу аргініну) в 1,4-2,2 раза, а також основних продуктів азотистого обміну - загального білка в 1,2-1,6 раза, креатиніну - в 1,4-1,6 раза на тлі підвищення рівня альбуміну в середньому в 1,5 раза та сечовини в 1,4 раза.

Виявлене підвищення певних амінокислот у плазмі крові щурів можна пояснити посиленням катаболічних процесів у тканинах, що є свого роду пристосувальною реакцією при патологічних станах, спрямованою на забезпечення гомеостазу. Виявлене підвищення вмісту проліну та оксипроліну вказує на структурно-метаболічну дисфункцію сполучної тканини та порушення міжклітинного матриксу. Зниження кількості сірковмісних амінокислот (цистеїну, метіоніну) свідчить про зниження резервів та інгібування антиоксидантної системи. За таких умов слід очікувати порушення окисно-відновлювальних процесів, активності деяких ферментів, гормонів, білків і пептидів. Слід відзначити, що зниження рівня тирозину та фенілаланіну може бути пов'язано з порушенням синтезу та обміну тироксину, трийодтироніну, адреналіну, норадреналіну, а зниження триптофану - з обміном серотоніну, мелатоніну та інших. Спостережуване зменшення вмісту у плазмі крові щурів глікогенних (гліцину, серину, треоніну, аланіну, цистеїну) та кетогенних (лізину, лейцину, ізолейцину, фенілаланіну, триптофану) амінокислот може бути пов'язано з посиленням синтезу глюкози та кетонових тіл. Також відмічається збільшення вмісту замінних амінокислот, здатних синтезуватися з гліцерину, оксалоацетату, пірувату, альфа-кетоглутарату та інших субстратів у реакціях трансамінування, що слід розглядати як захисно-пристосувальну реакцію організму. Порушення пулу глікогенних амінокислот, що надходять до циклу Кребса через піруват та Ацетил-КоА, а також кетогенних амінокислот, що вступають у цикл Кребса через ацетоацетил-КоА та Ацетил-КоА, свідчить на тлі активації глюконеогенезу, підвищення лактату та пірувату про тканинну гіпоксію, енергетичний голод та накопичення кетонових тіл. Під впливом ОЕНФ у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 у плазмі крові щурів підвищується вміст аспартату та аспарагіну, які входять у цикл Кребса через оксалоацетат, та аргініну, проліну, гістидину, глутаміну, глутамату, що перетворюються на альфа-кетоглутарат - важливий енергетичний субстрат. З аналізу динаміки змін вмісту цих амінокислот слід очікувати блокування енергетичного альфа-кетоглутаратдегідрогеназного комплексу, субстратами окислення якого є альфа-кетоглутарат, а продуктами реакції - сукциніл-КоА, коферментна форма НАДН2 та діоксид вуглецю. Дослідження свідчать про переключення аеробного шляху отримання енергії на анаеробний - гліколітичний, що підтвержується підвищенням вмісту аспартату, аспарагіну - субстратів синтезу глюкози, а також лактату і пірувату - субстратів глюконеогенезу. Зниження вмісту таких амінокислот, як валін, метіонін, ізолейцин, ймовірно відбувається внаслідок посилення процесів, пов'язаних із синтезом сукциніл-КоА, який є макроергом та бере участь в синтезі АТФ на рівні субстратного фосфорилування, що опосередковано свідчить про активацію анаеробного типу біоенергетики та інгібування тканинного дихання. Підвищення аспарагіну та глутаміну свідчить про порушення дезамінування амідів. Динаміка вмісту нейромедіаторних амінокислот (ГАМК, глутамату, гліцину, аспартату, таурину) суттєво порушується. Так як глутамат та ГАМК пов'язані між собою як спряжена метаболічна система, то співвідношення ГАМК/глутамат в контрольній групі становить в середньому 2,73 ум.од., тоді як при дії ОЕНФ у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 - 0,55 та 1,26 ум.од. Це свідчить про переважання у тварин процесів збудження над процесами гальмування, що також відображує напруження адаптаційно-пристосувальних механізмів. Отже, ОЕНФ сприяють розбалансуванню білкового обміну.

Негативний вплив ОЕНФ та їх похідних у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 супроводжується суттєвими порушеннями стану мінерального обміну, що підтверджується зміною вмісту біогенних елементів у сироватці крові (зниження вмісту натрію на тлі підвищення вмісту калію, магнію, кальцію, фосфору, заліза, цинку, міді, марганцю) та еритроцитах (зниження вмісту калію, заліза, марганцю, кальцію, фосфору, магнію, цинку, міді на тлі підвищення рівня натрію). Підвищення у сироватці крові рівня біогенних елементів може бути зумовлено, по-перше, порушенням структурно-функціональної організації сполучної тканини та її матриксу, цитоплазматичних мембран клітин, внутрішньоклітинних органел, складних надмолекулярних метаболічних комплексів (енергетичних та синтетичних), активності ферментів та іншим; а по-друге, зниженням процесів, пов'язаних з використанням їх для синтетичних потреб клітинного апарата. Доведено, що зниження вмісту натрію у сироватці крові може бути пов'язано з посиленням процесів виведення їх з організму або підвищенням необхідності використання з анаболічною метою [146, 278]. Ураховуючи кофакторну, регуляторну, структурну, транспортну та енергетичну функції натрію, калію, кальцію, магнію, заліза, міді, фосфору, марганцю, а також встановлену динаміку їх змін у сироватці крові, можна припустити, що тривала дія ОЕНФ супроводжується, перш за все, структурними змінами біомембран, порушеннями окисно-відновлювальних процесів, біоенергетики та тканинного дихання. Високі рівні у сироватці крові калію, магнію, заліза, міді, цинку, кальцію на тлі зниження рівня натрію може свідчити також про порушення кислотно-лужного балансу у щурів під впливом ОЕНФ. Протилежена динаміка змін біогенних елементів в еритроцитах щурів дозволяє припустити розвиток мембранної патології та інгібування активності ферменту Na,K-АТФази, який забезпечує градієнт концентрації іонів на мембранах еритроцитів та інших клітин. Доведено, що іони кальцію та натрію запускають ранні метаболічні зсуви у клітині, контролюють рівень біосинтезу та активності ферментів, білків, процесів запліднення та раннього ембріогенезу, забезпечують активний транспорт речовин, тканинне дихання, скорочення м'язів, беруть участь у функціонуванні загортальної та антизгортальної системи крові, виконують регуляторну, гормональну та структурну функції [106]. Зміни вмісту моновалентних катіонів створюють сприятливі метаболічні умови для індукції пухлинного росту та можуть бути прогностичним показником посилення диференціювання та проліферації тканин, наприклад, при затримці іонів натрію в організмі та підвищенні екскреції іонів калію з сечею. Суттєве збільшення рівня натрію в еритроцитах скоріше пов'язано з порушенням структурно-метаболічної активності плазматичних мембран та Nа, K-залежних АТФаз [130]. Зниження в еритроцитах всіх інших досліджуваних біогенних елементів при тривалій токсифікації ОЕНФ може вказувати на те, що у цих без'ядерних клітинах відбувається інгібування окисно-відновлювальних процесів, спряжених з пригніченням біоенергетики, відновлювальних синтезів, порушенням транспортної функції субстратів через плазматичну мембрану та здатності клітин доставляти кисень до периферичних органів та тканин. Дисфункція в еритроцитах обміну натрію, калію, цинку здатна призвести до порушення кислотно-лужної рівноваги, яке на тлі розвитку мембранної патології та зниження рівня заліза, міді може супроводжуватися гіпохромною анемією [106].

Таким чином, у механізмі тривалої дії ОЕНФ та їх похідних - натрієвих солей карбоксиметилатів оксиетильованих ізононілфенолів у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 на організм щурів провідною ланкою є негативний вплив на процеси нейрогуморальної регуляції, що підтверджується розбалансуванням моноамінергічних та аміноацидергічних нейромедіаторних систем головного мозку, гормонального профілю сироватки крові, білкового та мінерального обмінів. Ці процеси завжди пов'язані зі збільшенням енергетичних витрат. Тому підтримання сталості енергетичного балансу біосистеми також вважають необхідною умовою адаптації.

Підвищення стійкості організму до пошкоджуючої дії КБ забезпечується значною перебудовою внутрішньоклітинних біоенергетичних процесів. Пусковим механізмом цих змін є виникаючі в результаті хімічного навантаження початкові ознаки внутрішньоклітинного енергедефіциту, поступове накопичення недоокислених ендогенних субстратів [83, 129, 145, 219]. При хронічному надходженні КБ у дозах, значно нижче середньолетальних, особливо у дозах, близьких до порогових, адаптаційні можливості організму реалізуються з більшою ефективністю. При цьому клітина, що має запас енергії та часу для захисту від негативної дії, здатна реалізувати найбільш вигідні та оптимальні шляхи та механізми свого функціонування [338].

Доведено, що тривала токсифікація щурів ОЕНФ8,12 і КМ-ОЕНФ5 у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 викликає зниження у гепатоцитах ступеня «заповнення» системи АТФ-АДФ-АМФ високоенергетичними фосфатними зв'язками, зокрема АТФ, при переважанні процесів використання АТФ над його синтезом, виснаження енергетичних ресурсів клітин, зниження швидкості мітохондріального дихання, що підтверджується зниженням рівня АТФ (у середньому в 6 разів у випадку 1/10 ДЛ50; в 4 рази у випадку 1/100 ДЛ50), АДФ (в 3,0 та 2,5 раза відповідно) на тлі збільшення рівня АМФ, зменшенням енергетичного заряду та потенціалу гепатоцитів, індекса фосфорилування та термодинамічного контролю дихання. Виявлене зниження рівня АТФ і АДФ у гепатоцитах експериментальних тварин на тлі підвищення рівня АМФ свідчить про виснаження їх енергетичних ресурсів. Виникаючий за умов тривалої дії ОЕНФ та їх похідних дефіцит високоенергетичних фосфатних зв'язків АТФ, АДФ сприяє формуванню енергодефіцитного стану. Можна передбачати, що такі результати можуть бути пов'язані з деструкцією та порушенням проникності зовнішньої та внутрішньої мембран мітохондрій гепатоцитів, пригніченням функціонування електрон-транспортного дихального ланцюга і, як наслідок, зниженням синтезу АТФ. З іншого боку, зменшення вмісту АТФ у гепатоцитах щурів при дії ОЕНФ та їх похідних може бути пов'язано зі зниженням його синтезу в реакціях окисного фосфорилування внаслідок недостатності кисню та переходу клітин на реакції субстратного фосфорилування в анаеробних умовах [188]. Продуктивність останніх по відношенню до АТФ, як правило, відносно незначна.

Оцінку стану енергетичних процесів проводили також шляхом визначення активності дихального ланцюга мітохондрій гепатоцитів у присутності специфічних субстратів та інгібіторів першого (НАДН-коензим Q-оксидоредуктази) та другого (сукцинат-коензим Q-оксидоредуктази) комплексів. Доведено, що досліджувані хімічні речовини на 45-ту добу перорального введення піддослідним тваринам у дозі 1/100 ДЛ50 викликають зниження активності сукцинат-коензим Q-оксидоредуктази при підвищенні активності НАДН-коензим Q-оксидоредуктази, що підтверджується зменшенням швидкості дихання мітохондрій у станах V3 та V4 на сукцинаті на тлі збільшення у цих станах на глутаматі та малаті. Виявлене підвищення активності НАДН-коензим Q-оксидоредуктази, ймовірно, має компенсаторний характер. З іншого боку, доведено, що перший комплекс дихального ланцюга мітохондрій може сприяти реакції одноелектронного відновлення кисню до супероксидного аніону [78, 279, 280] - фактору ініціювання вільнорадикальних реакцій з наступним пошкодженням мембран, у тому числі й мітохондріальних. За умов нормального функціонування печінки активність цієї реакції пригнічується завдяки дії антиоксидантів. З огляду на вище зазначене, підвищення активності першого комплексу дихального ланцюга мітохондрій гепатоцитів щурів у разі тривалого впливу ОЕНФ та їх похідних може бути пов'язано з порушенням транспорту електронів цим комплексом, що може супроводжуватися утворенням значної кількості токсичних супероксидних аніонів. Крім того, результати проведених досліджень дозволили виявити у всіх досліджуваних речовин властивість роз'єднувати процеси окислення та фосфорилування на субстратах другого комплексу дихального ланцюга мітохондрій клітин печінки експериментальних тварин.

Отже, тривала дія ОЕНФ та їх похідних сприяє виразному порушенню стану аденілнуклеотидної системи та активності дихального ланцюга мітохондрій гепатоцитів щурів, що потребує своєчасної та адекватної корекції з метою попередження незворотних змін у печінці.

До регуляторних систем клітин, що беруть участь в адаптаційних процесах і регуляції метаболічних шляхів, відноситься й прооксидантно-антиоксидантна система [14, 31, 245]. Дія багатьох хімічних факторів довкілля на організм може значно індукувати процеси вільнорадикального окислення на тлі виснаження антиоксидантних ресурсів, що за умов оксидативного стресу може деструктивно впливати на стабільність гомеостазу [74, 78, 121, 217, 236, 416]. Лавиноподібне неконтрольоване утворення окислених макромолекул та їх тривала циркуляція в організмі так чи інакше формує розвиток патологічних процесів. Субстратами шкідливої ??дії вільних радикалів виступають білки, ліпіди, нуклеїнові кислоти [64, 102, 208]. Найбільш вивченою в патогенезі багатьох захворювань є роль ПОЛ, яке вважається одним з універсальних і фундаментальних механізмів пошкодження клітинних мембран [14, 34, 169, 173, 257, 385, 417]. Але до перших субстратів, що зазнають окислювальної модифікації, відносять білки [102, 190, 234, 311]. Накопичення окисних білків є одним із факторів регуляції синтезу та розпаду цього класу біомолекул, активації протеїназ, які вибірково їх руйнують. Даний процес до того ж розглядається як прояв антиоксидантного захисту організму. Тому оцінка ступеня окислювальної модифікації білків є одним з ранніх і найбільш надійних індикаторів пошкодження вільнорадикальним окисленням мембран, клітин і тканин, тому що білки крові, які потрапили під окислювальну деструкцію, мають більш тривалий період розпаду, ніж продукти ПОЛ, що робить їх перспективним маркером інтенсивності вільнорадикального окислення [234].

Основа дії продуктів вільнорадикального окислення в процесах інактивації білків полягає у взаємодії з активними сірковмісними, аміновмісними та метильними групами їх молекул, що може призводити до змін третинної та четвертинної структури білка, утворенню білок-білкових зшивок і фрагментації молекул. Внаслідок цього знижується/втрачається багатогранна функціональна активність білків (структурна, каталітична, регуляторна, захисна, скорочувальна, транспортна, рецепторна та інші), а деякі з цих функціональних порушень білкової структури сприяють виникненню мутацій або призводять до формування аутоантигенів і порушення імунної рівноваги в організмі. Окислення білків має складний виборчий характер, однак внаслідок впливу активних форм кисню (АФК) утворюються загальні продукти - карбонільні похідні. Саме за рівнем цих продуктів найчастіше судять про ступінь пошкодження білків у тканинах. Досліджувані хімічні речовини на 45-ту добу введення в організм щурів викликають підвищення у сироватці крові вмісту карбонільних похідних - нейтральних альдегід-ДНФГ і кетон-ДНФГ (в середньому в 1,5-2,0 раза при дозі 1/10 ДЛ50; в 1,2-1,9 раза при дозі 1/100 ДЛ50), а також основних альдегід-ДНФГ (в середньому в 1,5-2,0 раза), що підтверджує окислювальну модифікацію білків.

Для підтвердження порушення функціональної активності білків внаслідок їх окислювальної модифікації досить надійним методичним підходом є фосфоресцентний аналіз, висока чутливість та інформативність якого дозволяє визначати наявність молекулярної патології на рівні вивчення електронних збуджених станів молекул [95, 182]. Відомо, що природними хромофорами білків є тирозинові та триптофанові залишки амінокислот, які оголюються за умов втрати компактної високоорганізованої структури. Білки у розчинах практично не фосфоресцирують. Фосфоресценція білків має місце у тих випадках, коли їх хромофори знаходяться у мікрооточенні з високою жорсткістю. Саме агрегація білків, втрата ними компактної структурно-функціональної організації призводить до суттєвого підвищення жорсткості мікрооточення триптофанових залишків, що поєднано з підвищенням інтенсивності фосфоресценції [266]. Тривале пероральне введення піддослідним тваринам ОЕНФ6, 10, 12 у дозі 1/100 ДЛ50 супроводжується підвищенням інтенсивності фосфоресценції сироватки крові, особливо у довгохвильовій області збудження (434 нм) - в середньому в 1,6 раза та короткохвильовій області (297 нм) - в середньому в 1,2 раза. Такі результати підтверджують розвиток у щурів процесу інактивації білкових молекул за рахунок розгортання їх компактних структур, що тісно пов'язано зі структурно-метаболічними змінами в організмі та розвитком тканинної гіпоксії.

На 45-ту добу перорального введення щурам ОЕНФ та їх похідних - натрієвих солей карбоксиметилатів оксиетильованих ізононілфенолів у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 виникають неспецифічні метаболічні розлади у вигляді активації процесів ліпопероксидації, що підтверджується підвищенням інтенсивності ХЛ сироватки крові, вмісту дієнів, ТБК-реактантів і шифових основ в органах та тканинах. У сироватці крові та печінці щурів тривалий вплив ОЕНФ12 і КМ-ОЕНФ5 викликає превалювання кінцевих продуктів ПОЛ - шифових основ, а у головному мозку - первинних та вторинних продуктів: дієнових кон'югатів та ТБК-реактантів. У сироватці крові щурів за умов тривалої дії ОЕНФ8 і КМ-ОЕНФ4 відбувається активація ПОЛ на рівні утворення дієнових кон'югатів та ТБК-реактантів. Продукти ліпопероксидації внаслідок високої реактогенної здатності та вибірковості у біологічній дії можуть виступати в якості основного ланцюга, що лімітує стан стійкості організму до тривалого впливу досліджуваних речовин через зміну фізико-хімічних характеристик клітинних мембран, активності мембрано-локалізованих та ліпідозалежних ферментів, реактивності нейроендокринної, імунної та інших систем організму.

Пряме відношення до процесів генерації АФК має оксид азоту та його метаболіти, які можуть брати участь в окисленні білків і ліпідів, порушувати структуру мембран [313, 323, 358, 391, 405, 408, 410]. Взаємодія оксиду азоту із супероксид-радикалом утворює цитотоксичний продукт пероксинітрит. Ця реакція відбується, як правило, за умов гіперекспресії NO-синтази у макрофагах ендотелію, а також при зниженні активності СОД і підвищенні утворення супероксид-радикала [386, 388, 437]. Досліджувані речовини у разі тривалого введення щурам у діючій дозі 1/100 ДЛ50 змінюють активність NO-синтазної окислювальної системи, призводячи до підвищення у сироватці крові вмісту нітритів і нітратів (в середньому в 1,3-1,7 раза), у плазмі крові рівня S-нітрозотіолу (в середньому в 1.4-2,0 раза). Синтез оксиду азоту каталізує фермент NO-синтаза (NOS), для якого характерні декілька молекулярних форм: нейрональна (nNOS), індуцибельна або макрофагальна (iNOS), ендотеліальна (еNOS). Кожна форма NOS має свої особливості у механізмах дії, локалізації, біологічному значенні для організму. Так, синтезований оксид азоту за умов дії iNOS є джерелом вільних радикалів, фактором окислювальної модифікації білків. На 45-ту добу перорального введення піддослідним тваринам ОЕНФ у дозі 1/100 ДЛ50 відбувається суттєве збільшення її активності (в середньому в 2,1-2,8 раза), що може опосередковано свідчити про внесок в активацію процесів, пов'язаних з ПОЛ та окислювальною модифікацією білків. Слід відзначити, що на тлі таких змін, відбувається й менш виразне підвищення активності еNOS (в середньому в 1,7 раза).

Для оцінки стану оксидантно-антиоксидантної рівноваги у щурів, токсифікованих досліджуваними речовинами, визначали активність ферментів першої лінії антиоксидантного захисту - СОД еритроцитів та каталази крові. Спостергається суттєве зниження активності СОД при дії речовин у дозі 1/10 ДЛ50, наприклад, в 2,5; 2,2; 1,7 та 1,5 раза відповідно для КМ-ОЕНФ4, КМ-ОЕНФ5, ОЕНФ12 та ОЕНФ8. Але у випадку дози 1/100 ДЛ50 визначається різноспрямовані результати. Так, ОЕНФ12 та КМ-ОЕНФ5 сприяють зниженню активності еритроцитарної СОД, що можна розглядати як зрив метаболічної адаптації та антиоксидантного захисту, а ОЕНФ8 та КМ-ОЕНФ4, навпаки, її підвищенню (в 1,2-1,5 раза), що можна трактувати як захисно-пристосувальну реакцію організму. Тривалий вплив досліджуваних речовин супроводжується також зниженням активності каталази крові: в середньому в 1,6 раза у випадку дози 1/10 ДЛ50; в 1,4 раза - 1/100 ДЛ50. Виявлене зниження активності досліджуваних антиоксидантних ферментів є однією з причин розвитку оксидативного стресу, так як вони відповідальні за видалення первинних АФК - супероксидних аніон-радикалів і перекису водню.

Одержані результати переконливо свідчать про значне напруження функціонування в організмі піддослідних тварин оксидантно-антиоксидантної системи у бік збільшення продукції АФК, активації процесів ліпопероксидації та окислювальної модифікації білків, здатних подолати бар'єр антиоксидантного захисту. Це добре підтверджується зниженням антиоксидантно-прооксидантного індекса - співвідношення активності каталази до вмісту ТБК-реактантів, наприклад, майже в 4,0 і 2,3 раза для ОЕНФ8 відповідно у дозі 1/10 і 1/100 ДЛ50; в 3,0 і 1,7 раза для КМ-ОЕНФ4; в 2,7 і 2,0 раза для КМ-ОЕНФ5; в 1,8 і 1,4 раза для ОЕНФ12. Наслідком таких змін є суттєві порушення структурно-функціональних властивостей біомембран, що підтверджується на 45-ту добу дії ОЕНФ та їх похідних у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ50 порушенням співвідношення фосфоліпідних фракцій мембран клітин крові (особливо накопиченням лізофосфатидилетаноламіну та лізофосфатидилхоліну в середньому 2,4-3,3 раза) з наступним порушенням їх плинності та проникності. Відмічається підвищення відсотка фосфатидилетаноламіну у мембранах еритроцитів щурів (в середньому в 1,2-1,4 раза), фосфатидилхоліну та кардіоліпіну (в 1,4-2,0 раза) при введенні ОЕНФ у дозі 1/100 ДЛ50 на тлі зниження вмісту сфінгомієліну, фосфатидилсерину та фосфатидилінозитолу. Зниження на 45-ту добу перорального введення ОЕНФ6, 10, 12 у дозі 1/100 ДЛ50 плинності мембран лімфоцитів та еритроцитів щурів підтверджується зниженням коефіцієнта ексимерізації пірену (у зоні білок-ліпідних контактів - у середньому в 2,1 раза, у зоні ліпідного бішару - в 1,9 раза), а підвищення проникності мембран еритроцитів - збільшенням швидкості мимовільного виходу іонів калію з цих клітин, а також індукованого антибіотиком валіноміцином, який специфічно їх зв'язує та транспортує через мембрани завдяки ліпофільній природі.