Проблема оксида азота в неврологии

Система оксида азота у человека обладает широким спектром биорегуляторного действия [33]. Сейчас трудно назвать функцию организма, в регуляции которой NO не принимал бы участия. Он является уникальным медиатором межклеточного взаимодействия, участвующим в поддержке гомеостатических параметров организма в формировании базального тонуса сосудов, улучшения реологических свойств крови путем регуляции процессов агрегации ее форменных элементов, стабилизации проницаемости сосудистой стенки, обладает свободнорадикальными свойствами [3, 5]. Благодаря малым размерам и отсутствию заряда NO легко преодолевает клеточные мембраны органов и тканей организма.

NO - короткоживущая молекула, время полужизни которой не превышает 30 секунд, после чего она преобразуется в нитриты [10]. NO вырабатывается различными типами клеток организма (эндотелиоцитами, эпителиоцитами, мезангиоцитами, миоцитами, лимфоцитами, нейтрофилами, тромбоцитами, макрофагами, фибробластами, нейронами, гепатоцитами, тучными и другими клетками) и контролирует в них многие биохимические процессы и функции [33, 1006].

Суточная продукция NO одним только эндотелием составляет 1,7 ммоль, а базальная концентрация газа в плазме приближается к 3 нмоль (уровень NO для клеток эндотелия оценивается в 4 пмоль/мин на 1 мг белка) [16]. Вследствие быстрого перехода в нитраты и нитриты свободный радикал NO имеет короткий период полужизни (5-30 секунд), что объясняет трудности его выявления в биологических жидкостях [20].

Сумму конечных продуктов NO (нитритов/нитратов) в биологических жидкостях определяют с помощью реактива Грейса (1 % сульфаниламида, 0,1 % нафтилендиамина, 2,5 % фосфорной кислоты), а абсорбцию раствора измеряют при длине волны 546 нм [6]. Содержание только нитритов (нитрит-аниона) в биологических жидкостях также определяют с помощью реактива Грейса путем восстановления нитратов до нитритов, используя кадмиевые колонки размером 60 х 5 мм [27]. Параметры концентрации нитрат-аниона исследуют по методу N.R. Bank and H.S. Aynedjian [24].

Среднее содержание нитритов/нитратов в крови у здоровых людей составляет около 10 мкмоль, а в моче - 50 мкмоль [8]. У детей нормальный уровень метаболитов NO в крови достигает ~ 25 (20-28) мкмоль. Необходимо отметить, что у новорожденных в дневные часы концентрация нитритов/нитратов в моче составляет всего 2-3 нмоль/мл, тогда как в ночное время она повышается до 14-16 нмоль/мл [2]. Показатели нитритов/нитратов в моче здоровых людей равномерно распределяются в течение суток и не зависят от их пола и возраста. Параметры с поправкой на экскрецию креатинина (кр) и выраженные в логарифмической шкале составляют для нитритов 17-22 пмоль/г/кр, а для нитратов - 1-3 пмоль/г/кр [30]. С возрастом в большинстве клеток организма происходит угнетение синтеза NO вследствие подавления активности оксидазотной синтетазы (NOS), и у лиц старше 75 лет NO-емия в 3-4 раза ниже, чем у 25-30-летних людей [23]. Уменьшение процессов синтеза NO является одним из физиологических механизмов старения организма.

Необходимо отметить, что концентрация в крови нитритов/нитратов, повышается при увеличении уровня эстрогенемии. Так, у женщин в позднюю секреторную фазу менструального цикла содержание NO выше, чем в пролиферативную, а при нормально протекающей беременности показатели NO больше, чем у небеременных [36].

Метаболиты NO могут ложно повышаться из-за диеты и медикаментов, содержащих азотистые продукты, а также вариабельно уменьшаться под действием плазменных тиолов. Это делает менее надежным определение нитритов/нитратов в крови. Косвенным показателем NO-опосредованных белковых модификаций служит концентрация 3-нитротирозина, который не зависит от поступления экзогенных метаболитов NO и эффектов плазменных тиолов. В качестве маркеров уровня метаболитов NO в крови придаются особое значение спектрофотометрическому определению азота и цитруллина. У здоровых людей эти параметры соответственно составляют 203 нмоль/мл и 217 нмоль/мл [39].

Выявлена обратная корреляционная связь между концентрациями метаболитов NO и такими биогенными аминами, как гистамин и серотонин. В тромбоцитах содержание NO оценивают спектрофотометрическим методом (длина волны 520 нм) по изучению тех же стабильных метаболитов газа - нитритов и нитратов [17]. Биосинтез NO отмытыми тромбоцитами из эндогенного субстрата проводят при t° = 37°C в течение 60 минут в растворе Хенкса (рН = 7,4) в среде 4 % карбогена. Реакцию останавливают центрифугированием образца, а определение уровня нитритов/нитратов проводят в клеточном супернатанте после установления рН = 7,4 пробы.

В эритроцитах под влиянием ингибитора синтеза NO N-нитро-L-аргининметилэфира активность Na+-К+-АТФазы быстро изменяется и не зависит от содержания ионов кальция в плазме крови. Уровень L-аргинина в крови достаточно стабилен и составляет 11 мкмоль. Раствор N-нитро-L-аргининметилэфира, приготовленный непосредственно перед употреблением на деионизированной воде, добавляют к суспензии эритроцитов в буфере, проводят преинкубацию при t° = 37 °C, затем после добавления аденозинтрифосфата - инкубацию (реакцию останавливают внесением ледяной трихлоруксусной кислоты) [4].

Уровень NO в тканях мозга изучается с помощью микродиализа [37], а метаболитов NO в спинномозговой жидкости - путем капиллярного электрофореза [25]. По данным изучения нитритов/нитратов в тканях матки обнаружено, что согласно увеличению срока беременности продукция NO прогрессивно повышается, а затем существенно уменьшается в начале родовой деятельности [40]. При этом в некоторых периодах гестации активность децидуальной индуцибельной NOS превышает активность миометральной индуцибельной NOS. Активность эндотелиальной NOS в матке сначала не изменяется, а во время появления родовой деятельности вдвое снижается. Любопытно, что нейрональная NOS присутствует в матке вне беременности, но перестает выявляться во время беременности и родов.

Активность NOS в плазме крови определяют с помощью биохимического (колориметрического) метода [23]. Активность NOS в клетках крови здоровых людей очень низка, но ряд веществ индуцируют высокие уровни фермента [20]. Ее оценивают с помощью моноклональных антител [8]. Распределение NOS в тканях легких, почек и суставов (синовиальной оболочке, хряще) изучают с помощью иммуноцитохимического исследования с применением антител к NOS [88]. Иммунохимическим методом с использованием антисывороток к NOS, гистохимическим методом по НАДФН2-диафоразе, по продукции цитруллина и NO-сенсорами (точность которых достигает 1 нмоль) определяют активность NOS в тканях желудочно-кишечного тракта [18].

НАДФН2-диафораза является маркером NOS и гистохимическое определение этого фермента используется для локализации мест синтеза «новой» сигнальной молекулы NO [14]. Активности НАДФН2-диафоразы и NOS меняются синхронно и однонаправленно в соответствии уровню секреции NO. Поэтому по активности НАДФН2-диафоразы судят об активности NOS и NO-образующей функции клетки. После выделения и очистки нейрональной НАДФН2-диафоразы доказано, что очищенный белок является кальций-кальмодулинзависимой нейрональной NOS. Расшифровка строения протеина и молекулярное клонирование позволили получить специфические антитела, с помощью которых показано, что в большинстве случаев NOS локализуется с НАДФН2-диафоразой, а несовпадение локализации связано с изменением условий реакции. Гистохимически выделение НАДФН2-диафоразы проводят тетразолиевым методом [21].

В тканях сердца (его гомогенатах) NOS обычно изучают колориметрическим методом [5, 13].

Колориметрическим способом исследуют также уровень цитруллина [34]. Аликвоту надосадочной инкубационной смеси, в которой определяют активность NOS, смешивают с реагентом (диацетилмоноксим+антипирин+сульфат железа+серная кислота), кипятят, а после охлаждения определяют значения экстинции при 465 нм. Содержание цитруллина оценивают по калибровочной кривой. Активность NOS представляют в нмоль NO (эквимолярное количество с цитруллином), образовавшегося за 1 минуту на 1 мг общего белка гомогената тканей. Содержание NO определяют по концентрации стабильного метаболита нитрит аниона (NO2) с помощью реактива Грейса в колориметрической реакции [27].

Нормальная концентрация NO в бронхах составляет 7 (от 3 до 11) ppb (part per billion - молекул на 1 млрд. молекул воды), а содержание NO в полости носа и носоглотке достигает 1000 ppb [10]. Это связано с тем, что в норме образование эндогенного NO преимущественно происходит именно в верхних дыхательных путях (в полости носа вырабатывается более 90 % NO). Свыше половины данного количества газа аутоингалируется и попадает в легкие, составляя 0,07-0,13 частей на биллион в 1 минуту [15]. NO, произведенный в физиологических количествах конститутивной NOS, направлен на поддержание определенного тканевого равновесия в синтезе и преобразовании NO, в то время как NO, являющийся продуктом индуцибельной NOS, усиливает воспалительные изменения в дыхательных путях. В выдыхаемом воздухе содержание NO составляет 90 частей на биллион и зависит от активности NOS в легочных макрофагах. Концентрация NO в выдыхаемом воздухе у здоровых людей при физической нагрузке снижается, тогда как количество газа, выдыхаемого за 1 минуту, повышается и находится в прямой зависимости от сердечного выброса и уровня вентиляции [15].

NO может быть обнаружен в выдыхаемом воздухе в концентрации от одного до нескольких сотен ppb. Впервые его содержание исследовано L.Gustafsson. et al. [298]. Эти измерения были выполнены с помощью хемолюминесцентного анализа, который позволяет регистрировать концентрации NO порядка нескольких десятков на 1 млн. (ppm). По мнению А.Ф. Ванина [3], этот метод достаточно дорог и более перспективным представляется разработка лазерных методов определения NO в выдыхаемом воздухе. В последующем уровень NO в выдыхаемом воздухе изучен методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии [31]. Для стандартизации измерений содержания NO приняты единые рекомендации (1996г.) по исследованию выдыхаемого NO ("Exhalec and nasal nitric oxide measurement: recomendations"). Как считается, неинвазивный метод определения NO в выдыхаемом воздухе можно использовать для диагностики и мониторинга активности респираторных заболеваний [29]. Методы измерения NO в выдыхаемом воздухе могут быть разными, но большинство приборов основано на принципе хемилюминесценции: в результате реакции NO с озоном, генерируемым анализатором, образуется молекула диоксида азота (NO2) с высокоэнергетичным электроном, впоследствии испускающая фотон, регистрируемый датчиком.

В конденсате влаги выдыхаемого воздуха (КВВВ) как правило определяют суммарное содержание метаболитов NO (нитритов/нитратов). С этой целью используют реактив Грейса, который восстанавливает нитрат-ион с помощью металлического кадмия, импрегнированного медью, до нитрит-иона. У здоровых людей имеются возрастные особенности уровня метаболитов NO в КВВВ. Так, у детей концентрация нитритов/нитратов на 89 % выше и составляет около 2,8 мкмоль/л (у взрослых - примерно 1,5 мкмоль/л).

Прямой количественный метод электронно-парамагнитного резонанса (ЭПР) позволяет определить в тканях скорость генерации NO по включению в комплексы с двухвалентным железом и диэтилдитиокарбаматом (ДЭТК) и дальнейшим образованием парамагнитных мононитрозильных комплексов железа (МНКЖ) с ДЭТК [19]. В качестве конкурентного ингибитора NOS используют Nщ-нитро-L-аргинин в дозе 250 мг/кг [11]. Регистрацию сигнала ЭПР образцов тканей проводят на радиоспектрометре при 77К в Х-диапазоне (мощность сверхвысокой частоты составляет 5 мВт и амплитуда модуляции магнитного поля 0,5 мТ). Для количественной оценки содержания МНКЖ-ДЭТК, присутствующих в тканях (тем самым уровнем NO, включенного в эти комплексы), сигналы ЭПР сопоставляют с сигналами тех же комплексов с известной концентрацией, синтезированных в растворе диметилсульфоксида.

ЭПР изучается продукция NO в организме при различных типах адаптации. Адаптация к стрессу вызывает генерализованное увеличение синтеза NO по его связыванию со специфической «ловушкой». Количество таких комплексов увеличивается в сердце, печени, почках, селезенке, тонкой кишке. Тем же ЭПР-методом показано, что стимулирующее действие на синтез NO в различных органах оказывает адаптация к физической нагрузке [22]. В сердечнососудистой системе возрастание синтеза NO при этом типе адаптации выявляется по усилению эндотелийзависимых вазодилататорных реакций и экспрессии гена эндотелиальной NOS. При адаптации к стрессу и к физической нагрузке увеличивается как базальный, так и стимулированный синтез NO.

При адаптации к гипобарической гипоксии ЭПР-анализ не выявляет усиления продукции NO. Напротив, отмечается ее снижение. Вместе с тем, косвенные данные свидетельствуют о том, что такая адаптация должна стимулировать синтез NO. Было показано, что адаптация к гипоксии усиливает NO-зависимые реакции сосудов [12], тормозит развитие NO-дефицитных состояний (например, таких, как артериальная гипертензия) [32], увеличивает экспрессию гена NOS. Защитные эффекты адаптации к гипоксии можно устранить ингибиторами NOS и воспроизвести с помощью доноров NO. Это противоречие с данными ЭПР-анализа разрешилось после того, когда было обнаружено, что адаптация к гипоксии способна усиливать депонирование NO в форме NO-содержащих комплексов в стенке сосудов. Депонированный NO не захватывается «ловушкой» и не выявляется методом ЭПР. Реальное увеличение синтеза NO при адаптации к гипоксии доказывается путем измерения концентрации в плазме крови стабильных метаболитов NO - нитритов и нитратов [32].

В последнее время разработан метод, позволяющий выявлять депо NO, сформировавшиеся в стенках кровеносных сосудов [22]. Такие депо образуются в результате повышения уровня NO в организме вследствие усиления синтеза эндогенного газа и введения экзогенных донаторов NO. У животных блокаду NOS производят путем инъекции невазоактивной дозы ингибитора активности фермента Nщ-нитро-L-аргинина. В качестве донора NO используют динитрозильный комплекс железа с цистеином, а определение функционального состояния эндотелия и объема депо NO осуществляют на изолированной аорте. Для измерения величины NO препарат инкубируют с Nщ-нитро-L-аргинином, после чего в камеру добавляют диэтилдитиокарбомат и оценивают величину вызванного им расслабления.

Депо NO выявляют методами гистохимического окрашивания по двухвалентному железу и фоторелаксации с использованием N-ацетилцистеина и диэтилдитиокарбамата, которые разрушают депо NO с образованием вазоактивных продуктов. Этими методами показано, что депонирование NO в стенке сосудов начинается при любом повышении уровня NO в организме. В сосудах NO депонируется главным образом в эндотелии и очень слабо - в прилегающих к нему участках гладкой мышцы [12].

Уровень нитритов/нитратов (метаболитов NO) в настоящее время исследуют в среде культивирования лейкоцитов в периферической крови (чаще мононуклеаров), синтезирующих индуцибельную NOS [8]. Для работы используют реактор-восстановитель ("Nitrate reductor"), стенки которого покрыты реагентным слоем, содержащим кадмий и обработаны медью. При соприкосновении с пробой этот слой восстанавливает нитраты до нитритов в щелочной среде. С целью количественной оценки нитритов спектрофотометрическим методом строят калибровочную кривую для оптической плотности стандартных растворов NаNO2 в диапазоне концентраций от 0 до 150 мкмоль. По этой калибровочной кривой определяют концентрацию иона нитрита по данным оптической плотности. У здоровых людей средний уровень нитритов/нитратов в супернатанте составляет 29 мкмоль.

Оценку NO-деактивирующей способности полиморфноядерных лейкоцитов проводят по измерению степени повышения уровня циклического гуанозинмонофосфата в клетках культуры RFL-6 под действием NO, растворенного в дистиллированной воде [26]. Стандартную культуру клеток RFL-6 (содержат значительные количества растворимой гуанилатциклазы, являющейся специфической мишенью для NO) отмывают раствором Локка и заливают им же в присутствии ингибитора циклооксигеназы индометацина (чтобы предотвратить образование простагландинов) и супероксиддисмутазы (с целью пролонгирования эффекта добавляемых аликвот с NO). Раствор NO в дистиллированной воде получают эквилибрацией воды NO. После инкубации культуры клеток в присутствии NO этот раствор удаляют, добавляют раствор соляной кислоты, а экстрагированный cGMP определяют радиоиммунным методом. После оценки фонового эффекта NO измерения повторяют в присутствии полиморфноядерных лейкоцитов до и после активации формилметионин-лейцил-фенилаланином [1, 1023].

В отсутствие нейтрофилов NO дозозависимо повышает уровень cGMP в культуре клеток. В присутствии неактивированных полиморфноядерных лейкоцитов здоровых лиц способность NO повышать уровень cGMP практически остается прежней. Активированные нейтрофилы подавляют свойство NO увеличивать концентрацию cGMP в клетках. Воздействие полиморфноядерных лейкоцитов связывается именно с инактивацией NO, а не с влиянием на культуру клеток, поскольку эффект донаторов NO в присутствии этих лейкоцитов не меняется. При васкулярной патологии усиление NO-деактивирующей способности отражает локальную гиперактивацию нейтрофилов после их прохождения стенозированного участка сосудов, в котором гемодинамические условия способствуют активации этих лейкоцитов. Инактивация NO определяется воздействием супероксиданиона и других свободных радикалов, в значительном количестве секретируемых активированными полиморфноядерными лейкоцитами. Известно, что супероксиданион эффективно разрушает NO.

Таким образом, NO оказался поистине вездесущей молекулой с широчайшим спектром биорегуляторного действия и в небольших концентрациях представляет собой уникальный вторичный мессенджер в большинстве клеток организма. Трудно назвать функцию организма, в регуляции которой NO не принимал бы участия. Обладая высокой реакционной способностью, NO может как активировать цепные свободнорадикальные реакции, так и ингибировать их, взаимодействовать с белками и низкомолекулярными соединениями, содержащими в активном центре ионы металлов с переменной валентностью, участвовать в образовании многочисленных азотсодержащих соединений, которые в определенных условиях способны вновь превращаться в NO. В настоящее время фундаментальная и прикладная медицина имеет большое число методов оценки метаболизма NO.

Эндотелиальная дисфункция и оксид азота

Сосудистый эндотелий представляет собой орган весом 1,5-1,8 кг (сопоставимо с весом, например, печени) или непрерывный монослой эндотелиальных клеток длиной 7 км, или занимающий площадь футбольного поля, либо шести теннисных кортов. Без этих пространственных аналогий было бы трудно представить, что тонкая полупроницаемая мембрана, отделяющая кровоток от глубинных cтруктур сосуда, непрерывно вырабатывает огромное количество важнейших биологически активных веществ, являясь таким образом гигантским паракринным органом, распределенным по всей территории человеческого организма.

Основная барьерная роль эндотелия определяет поддержание гомеостаза путем сложной активной регуляции равновесного состояния противоположных процессов:

тонуса сосудов (вазодилятация или вазоконстрикция);

анатомической архитектоники сосудов (синтез или ингибирование факторов повреждения или пролиферации);

гомеостаза (синтез или ингибирование факторов фибринолиза и агрегации тромбоцитов);

местного (выработка про- или противовоспалительных факторов).

Конец XX века ознаменовался не только интенсивным развитием фундаментальных понятий патогенеза артериальной гипертонии (АГ), но и критическим пересмотром многих представлений о причинах, механизмах развития и лечении этого заболевания.

В настоящее время АГ рассматривается как сложнейший комплекс нейро-гуморальных, гемодинамических и метаболических факторов, взаимоотношение которых трансформируется во времени, что определяет не только возможность перехода одного варианта течения АГ в другой у одного и того же больного, но и заведомую упрощенность представлений о монотерапевтическом подходе, и даже о применении как минимум двух лекарственных препаратов с конкретным механизмом действия.

К началу наступившего века отчетливо выкристаллизовалось направление, которое во многом включило в себя накопленный опыт фундаментальных разработок с одной стороны, и сосредоточило внимание клиницистов на новом объекте - эндотелии - как органе-мишени АГ, первым подвергающимся контакту с биологически активными веществами и наиболее рано повреждающимся при АГ [21].

С другой же стороны, эндотелий реализует многие звенья патогенеза АГ, непосредственно участвуя в повышении АД.

Необходимо заметить, что каждая из четырех функций эндотелия, определяющая тромбогенность сосудистой стенки, воспалительные изменения, вазореактивность и стабильность атеросклеротической бляшки, напрямую или косвенно связана с развитием, прогрессированием атеросклероза, АГ и ее осложнений [88, 110, 307]. Действительно недавние исследования показали, что надрывы бляшек, приводящих к инфаркту миокарда, отнюдь не всегда происходят в зоне максимального стенозирования коронарной артерии, напротив, зачастую случаются в местах небольших сужений - менее 50 % по данным ангиографии [11, 43, 88, 715].

Таким образом, изучение роли эндотелия в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) привело к пониманию, что эндотелий регулирует не только периферический кровоток, но и другие важные функции. Именно поэтому объединяющей стала концепция об эндотелии как о мишени для профилактики и лечения патологических процессов, приводящих или реализующих ССЗ.

Понимание многоплановой роли эндотелия уже на качественно новом уровне вновь приводит к достаточно известной, но хорошо забытой формуле «здоровье человека определяется здоровьем его сосудов».

Считается, что медикаментозное или немедикаментозное воздействие на ранних стадиях (предболезнь или ранние стадии болезни) способно отсрочить ее наступление или предотвратить прогрессирование и осложнения. Ведущая концепция превентивной кардиологии основана на оценке и коррекции так называемых факторов сердечно-сосудистого риска. Объединяющим началом для всех таких факторов является то, что рано или поздно, прямо или косвенно, все они вызывают повреждение сосудистой стенки, и прежде всего, в ее эндотелиальном слое.

Поэтому можно полагать, что одновременно они же являются факторами риска дисфункции эндотелия (ДЭ) как наиболее ранней фазы повреждения сосудистой стенки, атеросклероза и АГ, в частности.

ДЭ - это, прежде всего, дисбаланс между продукцией вазодилатирующих, ангиопротективных, антипролиферативных факторов с одной стороны (NO, простациклин, тканевой активатор плазминогена, С-тип натрийуретического пептида, эндотелиального гиперполяризующего фактора) и вазоконстриктивных, протромботических, пролиферативных факторов, с другой стороны (эндотелин, супероксид-анион, тромбоксан А2, ингибитор тканевого активатора плазминогена). При этом, механизм их окончательной реализации неясен.

Очевидно одно - рано или поздно, факторы сердечно-сосудистого риска нарушают тонкий баланс между важнейшими функциями эндотелия, что в конечном итоге, реализуется в прогрессировании атеросклероза и сердечно-сосудистых инцидентах. Поэтому основой одного из нового клинического направлений стал тезис о необходимости коррекции дисфункции эндотелия (т.е. нормализации функции эндотелия) как показателе адекватности антигипертензивной терапии. Эволюция задач гипотензивной терапии конкретизировалась не только до необходимости нормализации уровня АД, но и нормализации функции эндотелия. Фактически это означает, что снижение АД без коррекции дисфункции эндотелия (ДЭ) не может считаться успешно решенной клинической задачей [21].

Данный вывод является принципиальным, еще и потому, что главные факторы риска атеросклероза, такие как, гиперхолестеринемия, АГ, сахарный диабет, курение, гипергомоцистеинемия сопровождаются нарушением эндотелий-зависимой вазодилатации - как в коронарном, так и в периферическом кровотоке. И хотя вклад каждого из этих факторов в развитие атеросклероза до конца не определен, это пока не меняет сложившихся представлений.

Среди изобилия биологически активных веществ, вырабатываемых эндотелием, важнейшим является оксид азота - NO. Сегодня - это самая изучаемая молекула, вовлеченная в патогенез АГ и ССЗ в целом. Нарушенное взаимоотношение ангиотензина-II и NO вполне способно определять развитие АГ.

Нормально функционирующий эндотелий отличает непрерывная базальная выработка NO с помощью эндотелиальной NO-синтетазы (eNOS) из L-аргинина. Это необходимо для поддержания нормального базального тонуса сосудов. В то же время, NO обладает ангиопротективными свойствами, подавляя пролиферацию гладкой мускулатуры сосудов и моноцитов, и предотвращая тем самым патологическую перестройку сосудистой стенки (ремоделирование), прогрессирование атеросклероза.

NO обладает антиоксидантным действием, ингибирует агрегацию и адгезию тромбоцитов, эндотелиально-лейкоцитарные взаимодействия и миграцию моноцитов [39]. Таким образом, NO является универсальным ключевым ангиопротективным фактором.

При хронических ССЗ, как правило, наблюдается снижение синтеза NO. Причин тому достаточно много. Если суммировать все, то очевидно - снижение синтеза NO обычно связано с нарушением экспрессии или транскрипции eNOS, в том числе метаболического происхождения, снижением доступности запасов L-аргинина для эндотелиальной NOS, ускоренным метаболизмом NO (при повышенном образовании свободных радикалов) или их комбинацией.

При всей многогранности эффектов NO Dzau et Gibbons удалось схематически сформулировать основные клинические последствия хронического дефицита NO в эндотелии сосудов показав тем самым, на модели ишемичeской болезни сердца реальные следствия ДЭ и обратив внимание на исключительную важность ее коррекции на возможно ранних этапах.

Нарушенная NO - зависимая вазодилатация и парадоксальная вазоконстрикция эпикардиальных сосудов приобретает особое клиническое значение для развития ишемии миокарда в условиях умственного и физического стресса, или холодовой нагрузки. А учитывая, что перфузия миокарда регулируется резистивными коронарными артериями, тонус которых зависит от вазодилататорной способности коронарного эндотелия, даже при отсутствии атеросклеротическнх бляшек, дефицит NO в коронарном эндотелии способен привести к миокардиальной ишемии.

NO играет ключевую ангиопротекторную роль еще на ранних стадиях атеросклероза (рис. 2) [21].

Дефицит NO имеет место при разных формах артериальной гипертонии [23, 29], в патогенезе которой он играет весьма существенную роль [3, 26, 28, 47, 108].

Сниженный уровень NO в ЭК ослабляет его сосудорасширяющее действие, в том числе эндотелий (NO-зависимых вазодилататоров (эффект которых при достаточно низком уровне NO может становиться сосудосуживающим), усиливает вазоконстрикторные влияния эндотелина-1, ангиотензина, тромбоксана А2, норадреналина, способствует ремоделированию (структурной адаптации, гипертрофии) сосудистой стенки [1, 4].

Вопрос о первичном или вторичном характере дефицита NO при АГ пока остается открытым. Следует отметить выявленные особенности (полиморфизм) eNOS-гена у больных эссенциальной гипертонией японцев [29], а также снижение синтеза NO в сосудах и эндотелийзависимой реакции на ацетилхолин у детей и подростков с наследственной отягощенностью по этой болезни. Последнее имеет место задолго до начала развития у них АГ [30]. В любом случае стойкое повышение АД должно усугублять дисфункцию эндотелия, вести к замыканию «порочного круга».

Методы изучения метаболизма оксида азота

Снижение синтеза NO является главным в развитии ДЭ. Поэтому, казалось бы, нет ничего более простого, чем измерение NO в качестве маркера функции эндотелия. Однако, нестабильность и короткий период жизни молекулы резко ограничивают применение этого подхода. Изучение же стабильных метаболитов NO в плазме или моче (нитратов и нитритов) не может рутинно применяться в клинике в связи с чрезвычайно высокими требованиями к подготовке больного к исследованию.

Кроме того, изучение одних метаболитов оксида азота вряд ли позволит получить ценную информацию о состоянии нитрат-продуцирующих систем. Поэтому, при невозможности одновременного изучения активности NO-синтетаз, наряду с тщательно контролируемым процессом подготовки пациента, наиболее реальным способом оценки состояния эндотелия in vivo является исследование эндотелийзависимой вазодилатации плечевой артерии с помощью инфузии ацетилхолина или серотонина, либо с использованием венозно-окклюзионной плетизмографии, а также с помощью новейших методик - пробы с реактивной гиперемией и применением ультразвука высокого разрешения.

Нарушения сосудистого тонуса и сосудистое ремоделирование приводят к поражению органов - мишеней и осложнениям АГ. Становится очевидным, что биологически активные субстанции, регулирующие сосудистый тонус, одновременно модулируют и ряд важнейших клеточных процессов, таких как пролиферация и рост гладкой мускулатуры сосудов, рост мезангинальных структур, состояние экстрацеллюлярного матрикса, определяя тем самым скорость прогрессирования АГ и ее осложнений. Дисфункция эндотелия, как наиболее ранняя фаза повреждения сосуда, связана прежде всегo с дефицитом синтеза NO - важнейшего фактора-регулятора сосудистого тонуса, но еще более важного фактора, от которого зависят структурные изменения сосудистой стенки.

Поэтому коррекция ДЭ при АГ и атеросклерозе должна быть рутинной и обязательной частью терапевтических и профилактических программ, а также жестким критерием оценки их эффективности.

К методам исследования эндотелиальной вазорегуляции относятся инвазивные и неинвазивные 13.

Инвазивные методы на сегодняшний день представляют больше экспериментальный интерес и редко находят применение в клинической практике в силу ряда ограничений:

невозможно применить на большой выборке пациентов;

трудности при повторном исследовании эндотелиальной функции;

не выявляют начальные, доклинические изменения эндотелия;

трудности в определении эффективности медикаментозной коррекции эндотелиальной дисфункции.

Ранее описан 2 инвазивный метод ангиографической оценки сосудистого тонуса коронарных артерий на внутрикоронарное введение вазоактивных веществ (в частности, ацетилхолина). При этом изменение просвета коронарных артерий принимается как эндотелийзависимая релаксация. Проба с ацетилхолином при коронарографии проводится после катетеризации венечных артерий, оценки исходных ангиограмм. Затем в артерию вводится раствор ацетилхолина в последовательно возрастающих дозах - необходимо до создания локальных концетраций от 10-9 до 10-6 моль/л - со скоростью 0,8-1,0 мл\мин 7, 87. После введения каждой дозы измеряется диаметр сосуда в выбранных сегментах и определённых проекциях. При этом введенный ацетилхолин не вызывает активацию вегетативной нервной системы с увеличением частоты сердечных сокращений и изменением кровотока 2. Один из вариантов пробы заключается в измерении скорости/объёма кровотока в венечных артериях с применением допплеровского датчика на кончике интракоронарного катетера 9. Это позволяет выявить начальные признаки атеросклероза в виде утолщения интимы ещё до появления ангиографически значимых стенозов. Модификации пробы при коронарографии для более широкой оценки эндотелиальной вазорегулирующей функции заключается в провокации психоэмоционального стресса 7, быстрой предсердной стимуляции 10, либо введении папаверина или ацетилхолина дистальнее исследуемого сегмента 9. В ответ на проводимые манипуляции происходит потокзависимое изменение диаметра сосуда как реакция на нагрузку или стресс, что подтверждается ангиографически.

Неинвазивные методы оценки функционального состояния эндотелиальной системы должны отвечать следующим требованиям клинической и лабораторной практики 1:

быть точными и воспроизводимыми;

быть эндотелийзависимыми;

чётко выявлять и дифференцировать эндотелиальную дисфункцию;

возможность изучать вариации эндотелиальной реактивности в динамике по времени.

Неинвазивные методы исследования эндотелиальной вазорегуляции имеют явные преимущества и развиваются параллельно совершенствованию ультразвуковых методов. Так, в 1992 году предложен метод ультразвуковой оценки состояния коронарного кровообращения в ответ на различные стимулы (эндотелийзависимые и эндотелийнезависимые) 3. Известно, что эндотелий вырабатывает оксид азота, вызывающий расслабление гладкомышечных сосудистых клеток с расширением просвета сосуда 20. К эндотелийзависимым вазодилататорам относят физиологически активные вещества, которые действуют на эндотелий с выделением оксида азота и опосредованно вызывают релаксацию гладких миоцитов медии. К этим веществам, наиболее часто применяемым в исследованиях, относят ацетилхолин 21, 322. Эндотелийнезависимые агенты явяляются донорами NO, т.е. воздействуют на гладкомышечные клетки сосудов, минуя эндотелий. К таким веществам относятся нитроглицерин, нитропруссид натрия и др. 13, 24.

В дальнейшем этот метод получил широкое распространение в различных вариациях как проба с реактивной гиперемией, при этом чаще ультразвуком высокого разрешения исследуются вазомоторные реакции плечевой артерии у взрослых, а у детей изменения поверхностной бедренной артерии 3. Неинвазивная оценка сосудистого тонуса основана на измерении диаметра сосуда (ультразвуковые методики) и периферического сосудистого сопротивления (венозная окклюзионная плетизмография). Однако, при всех преимуществах, данный метод имеет и ряд ограничений 1:

трудности в получении оптимального изображения изучаемой артерии;

необходимая аппаратура высокого разрешения, достаточный опыт исследователя;

сохранение определённого положения датчика во все фазы исследования;

сложность визуальной оценки, элемент субъективизма;

широкий спектр вазодилатации даже у здоровых лиц на фоне ряда экзо-/эндогенных факторов, модифицирующих эндотелийзависимые вазомоторные реакции;

не используется для постановки клинического диагноза и количественной оценки выраженности атеросклеротического поражения сосудов у конкретного больного;

оценивает лишь вазомоторные аспекты эндотелиальной дисфункции. Хотя это можно объяснить видом метода и отнести к его диагностическим возможностям.

Выполнено большое количество работ по изучению коррелятивных связей между выраженностью атеросклеротических нарушений в различных сосудистых бассейнах, в том числе плечевой и коронарной артериях, при этом были получены позитивные результаты, позволяющие достоверно (до 95 %) прогнозировать коронарную эндотелиальную дисфункцию по нарушению вазодилатации плечевой артерии 1.

При исследовании сосудистого тонуса необходимо принимать во внимание факторы, влияющие на динамику вазомоторных реакций изучаемых сосудов:

размер сосуда - до начала исследования учитывается размер сосуда, т.к. существует обратная зависимость между размером артерии и выраженностью вазодилатирующих свойств. Это вызывает необходимость определять значимые изменения эндотелийзависимой вазодилатации у большого числа лиц в группах с относительно большими артериями 43;

гормональный фон - отмечено увеличение опосредованной кровотоком вазодилатации у женщин в фолликулярную и лютеиновую фазы менструального цикла на фоне стабильных показателей калибра сосуда 75, что необходимо учитывать при проведении обследования;

алиментарная триглицеридемия является одним из факторов, влияющих на эндотелийзависимые тонусные сосудистые реакции. Есть указания на то, что более чем на 50 % происходит транзиторное нарушение эндотелийзависимой вазодилатации плечевой артерии после приёма жирной пищи 61;

физическая активность влияет на процессы эндотелийзависимой вазодилатации, что обусловливает необходимость ограничения физических упражнений в течение 30 минут и более до начала обследования 13;

курение - выявлена эндотелиальная дисфункция как у активных, так и у пассивных курильщиков, при этом выявлено снижение дилатирующих свойств плечевой артерии при введении ацетилхолина и нитроглицерина 17, 148;

возраст - установлено, что у практически здоровых людей после 60 лет реакция на ацетилхолин значительно меньше, чем у более молодых обследуемых 19.

Данная проба нашла применение в практике для изучения эндотелиальной дисфункции в динамике коррекции при различных патологических состояниях: артериальная гипертензия, сахарный диабет, дислипидемии, атеросклероз, интоксикации, гипоксемии 11, 102. Известно, что при данных состояниях снижается уровень физиологической продукции оксида азота. Снижение активности оксида азота, связанное с подавлением его синтеза либо усиленной его инактивацией, является одним из механизмов изменения эндотелийзависимой вазорегуляции при патологических состояниях. Это происходит на фоне вазоконстрикторных эффектов нарастающих концентраций эндотелина.

Проба с реактивной гиперемией предусматривает оценку объёмных скоростей кровотока на фоне создания сосудистой компрессии/декомпрессии без/с применением вазодилатирующих фармакологических агентов (эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых) 13. Исследование начинают после 10-15-ти минутного пребывания пациента в горизонтальном положении. В качестве стимула расширения плечевой артерии, опосредованного эндотелием, используется реактивная гиперемия. Для этого в манжете дистальнее изучаемого участка в течение 4-10 минут создаётся давление 200-300 мм рт.ст. (фаза компрессии), затем давление устраняется (фаза декомпрессии). При этом в проксимальном сегменте плечевой артерии происходит увеличение кровенаполнения и скорости кровотока («реактивная гиперемия») 114, 315. Через 30-90 сек. после декомпрессии плечевой артерии (это время максимальной её дилатации) измеряется её диаметр 16. Для измерения диаметра сосуда допплеровский датчик располагают продольно на фиксированном участке верхней (чаще на 2-15 см выше локтевой ямки) или нижней конечности при измерении у детей (сразу после бифуркации общей бедренной артерии на поверхностную бедренную артерию) 13. Измерение производится:

в покое до развития реактивной гиперемии;

через 30-90 сек. после декомпрессии артерии;

снова в покое;

на фоне действия эндотелийнезависимых стимулов (через 15 минут покоя).

Одновременно с этим измеряется артериальное давление, регистрируется электрокардиограмма (ЭКГ). Реакцию эндотелия плечевой артерии оценивают как разницу между её диаметром в покое и при гиперемии, соотнесённую к диаметру в покое, и выражают в процентах 25.

Система оксида азота при патологии нервной системы

Эксайтотоксичность

Впервые J. Olney выдвинул гипотезу «эксайтотоксической смерти нейронов», установив в эксперименте, что возбуждающим аминоацидергическим медиаторам (глутамату и, возможно, аспартату) свойственна цитотоксичность 1006, 1024. Основой феномена эксайтотоксичности (от англ. еxcite - возбуждать) является нарушение проницаемости ионотропных рецепторов, регулирующих содержание калия, натрия, хлора и кальция во вне- и внутриклеточном пространстве в результате воздействия возбуждающих нейротрансмиттеров - аминокислот аспартата и глутамата. Наиболее часто происходит активация рецепторов к N-метил-D-аспартату (NMDA-рецепторы) 17, 48, 777. Им отводится особая роль в регуляции нейрональной возбудимости, синаптической пластичности [263], а также в патогенезе эпилепсии и судорог 288, 295.

NMDA-рецепторы представляют собой тетрамерный комплекс, формируемый комбинацией двух субъединиц: NR1 и NR2 612. Каждая из субъединиц NMDA-рецептора представлена рядом изоформ, возникающих в результате альтеранивного сплайсинга. Различные их комбинации формируют рецепторы, различающиеся по фармакологическому профилю, чувствительности к Mg2+ и свойствам каналов 837.

Ионный канал, образованный субъединицами, высоко проницаем для K+, Na+, Ca2+ и заблокирован ионом Mg2+ 678 потенциалзависимым способом 717. Деполяризация постсинаптической мембраны (от -50 до -30 мВ), вызванная активацией других глутаматных ионотропных рецепторов, устраняет «магниевый блок» и приводит к открытию канала. Ионофор NMDA-рецепторов является участком связывания так называемых «канальных» блокаторов (фенциклидина, кетамина, мемантина, МК-801) 332, 657.

Применение радиолигандного анализа показало наибольшую плотность NMDA-рецепторов в конечном мозге, прежде всего в гиппокампе, коре больших полушарий, миндалине и стриатуме 652, 677. Следует отметить, что именно эти структуры прежде всего ответственны за память и обучение в традиционном понимании этих слов и ассоциированы с сенсорной функцией, осуществление которой требует повышенного ресурса синаптической пластичности 17. Представляет также интерес то, что указанные структуры обладают низким порогом эпилептизации и высокой степенью возбудимости.

Во всех слоях гиппокампа выявлен высокий уровень NMDA-рецепторов, за исключением тел нейронов пирамидного и гранулярного слоев, а также striatum lucidum (терминальная зона мшистых волокон гиппокампа). Среди кортикальных областей ассоциативные зоны коры часто имеют большую плотность рецепторов, чем проекционные зоны. Фронтальная, инсулярная, пириформная, периринальная и передняя поясная кора также содержат больше количество рецепторов в отличие от височной, затылочной, париетальной и задней поясной участков коры. Гранулярные корковые области имеют выраженную ламинарность распределения NMDA-рецепторов. Так, во внешних слоях I-III и слое Vа париетальной коры показана бoльшая плотность рецепторов, чем в других корковых слоях.

NMDA-рецепторы опосредуют возбуждающее действие глутамата, однако, оно не распространяется на все виды активации нейрона. Они не участвуют в возникновении быстрого и кратковременного возбуждения, с которым связаны физиологические реакции (например, защитный рефлекс одергивания и др.). Быстрые возбуждающие постсинаптические потенциалы, характерные для подобных реакций, формируются при участии ионотропных не-NMDA-рецепторов. Роль же NMDA-рецепторов велика в патологии нейронов, их гиперактивации и эпилептизации, так как обеспечивают усиленную и длительную активацию нейронов. Показано, что селективный антагонист NMDA-рецепторов - амино-5-фосфовалериановая кислота - предупреждает и ослабляет гиперактивацию нейронов и судорожные реакции, но существенно не влияет на физиологические двигательные реакции 71.

В физиологических условиях NMDA-рецепторы активируются миллимолярными концентрациями глутамата, который присутствует в синаптической щели в течение нескольких миллисекунд 687. При патологической импульсации рецепторы активируются микромолярными концентрациями, но в течение значительно большего времени 49. В результате этого происходит увеличение концентрации Са2+ в клетках и накопление ионов К+ во внеклеточном пространстве. «Кальциевая перегрузка» нейронов и активация Са2+-зависимых процессов (повышение активности протеаз, киназ, эндонуклеаз, липооксигеназ, фосфолипазы А2 и др. ферментов) ведет к значительным изменениям в метаболизме и генетическом аппарате клетки, неконтролируемому действию свободных радикалов и может привести к необратимой клеточной гибели 287. В настоящее время считается, что поступление ионов Са2+ внутрь клетки через каналы NMDA-рецепторов является ключевым событием в реализации токсических эффектов глутамата 199. Дополнительным результатом активации NMDA-рецепторов является внутриклеточная продукция активных форм кислорода, прежде всего супероксид-аниона и гидроксид-радикала. Гиперактивация NMDA-рецепторов, вносит определенный вклад в судорожную активность и связанную с ней гибель нейронов, что также подтверждается большим количеством экспериментальных данных о выраженном противосудорожном эффекте антагонистов NMDA-рецепторов, проявляющемся на различных моделях судорог. Так, существуют указания на усиление антагонистами NMDA-рецепторов лечебного эффекта бензодиазепинов и барбитуратов при данных состояниях 148. Глутамат играет важную роль в процессах дифференцировки, миграции и жизнеспособности нейронов, в основном, через усиление входящего тока Ca++ 470, 941.

В условиях избыточного образования различных радикалов возможно взаимодействие вторичного мессенджера - оксида азота и супероксида с образованием пероксинитрита, обладающего исключительно высоким окислительным потенциалом 463. В настоящее время не существует однозначного мнения о роли окиси азота в механизме токсического действия глутамата 56. По мнению одних авторов, NO участвует в повреждении нейронов при воздействии глутамата 139, являясь свободнорадикальным соединением, окись азота цитотоксична и инициирует ряд цепных реакций 60. Комплекс NO с супероксид-анионом - пероксинитрит способен блокировать тирозинкиназу, входящую в активный центр нейротрофических факторов 560. Другие авторы 533, 830 полагают, что NO, активируя растворимую гемсодержащую гуанилатциклазу и повышая синтез циклического ГМФ, может защищать нейроны при токсическом воздействии глутамата; формирование нитрозониума иона NO, связывающего регуляторный центр NMDA-рецептора, уменьшает его возбудимость и эксайтотоксические явления, снижает чувствительность к действию агонистов.

Проводятся исследования 111 по изучению зависимости структуры нейронной сети мозжечка от дисбаланса основных медиаторов мозжечка (L-глутамата и NO). Проведено электронно-микроскопическое изучение влияния избытка L-глутамата в экстраклеточной среде. Показано, что это приводит к повреждению структуры и нарушению взаимодействия зернистых клеток и функции генома. В настоящее время известно, что патоморфологические изменения, вызванные избытком L-глутамата, лежат в основе таких заболеваний как эпилепсия, болезни Паркинсона и Альцгеймера. Известно, что NO может синтезироваться в нейронах на одной из стадий глутаматного каскада и, являясь свободным радикалом, быть очень токсичным веществом. Выявлено, что наиболее чувствительными к воздействию NO являются мембраны нейронов и глиальных клеток. При этом оксид азота преимущественно «перфорирует» клеточные мембраны, а глутамат способствует увеличению их текучести и расслоению.

Наряду с патологическими изменениями в нейронной системе мозжечка, как в глутамате, так и в NO, были отмечены изменения, которые расцениваются как компенсаторные. Появляются многорядные спиральные структуры вокруг синапсов, образованные отростками глиальных клеток, а также шипиковая инкапсуляция бутонов с обкруткой шипиков под влиянием глутамата и бутонная инкапсуляция шипиков с обкруткой бутонов под влиянием NO. Эти результаты неожиданны, т.к. основные нейроны мозжечка дают противоположные реакции на раздельное применение веществ, которые в норме работают в едином глутаматном каскаде.

Показано, что NO выполняет модулирующую функцию, направленную на адаптацию мозга к функционированию в условиях дефицита кровоснабжения при мозговом инсульте. При гипоксии действие NO приводит к вазодилатации и улучшению кровоснабжения, одновременно подавляя активность NMDA-рецепторов и снижая эксайтотоксический эффект глутамата, а при реперфузии преобладает повреждающий эффект NO, провоцирующий процессы разрушения нейронов 299. Так проявляется присущая многим природным модуляторам двойственная природа окиси азота.

Хронические церебральные ишемии

Одним из наиболее часто встречаемых патологических состояний в неврологической практике является поражение головного мозга сосудистой этиологии, к которым относятся инсульт и хроническая недостаточность кровоснабжения головного мозга. Цереброваскулярные нарушения являются одной из актуальных проблем неврологии. Особую важность они приобретают у пациентов пожилого и старческого возраста. Значительная распространенность хронических форм сосудистой мозговой недостаточности или, в соответствии с существующей классификацией, дисциркуляторной энцефалопатии (ДЭ), особенно у пациентов старших возрастных групп, обусловливает практическую значимость данной проблемы. В настоящее время примерно 12-15 % населения составляют лица старше 65 лет, причем к 2020 г. их численность возрастет, по меньшей мере, в два раза.

ДЭ - состояние, проявляющееся прогрессирующими многоочаговыми расстройствами функций головного мозга, в основе которых лежит недостаточность церебрального кровообращения. Одним из наиболее тяжелых проявлений ДЭ является сосудистая деменция. Возникновение неврологических, нейропсихологических и психических нарушений при ДЭ может быть вызвано хронической недостаточностью мозгового кровообращения и (или) повторными эпизодами дисциркуляции, которые протекают с явной клинической симптоматикой (в виде инсульта или транзиторной ишемической атаки) или субклинически. Выделяют атеросклеротическую, гипертоническую, смешанную и венозную ДЭ, хотя возможны и иные ее причины (васкулиты, системные гемодинамические расстройства, заболевания крови и др.).

Инсульт и хроническая ишемия головного мозга вызываются общими причинами, самыми распространенными из которых являются атеросклероз церебральных артерий и артериальная гипертония. Вследствие этиологической общности оба патологических процесса, как правило, присутствуют одновременно: у пациентов с хронической недостаточностью кровоснабжения мозга имеются анамнестические или нейровизуализационные признаки перенесенных инсультов, а у пациентов с инсультом - признаки хронической ишемии мозга. В настоящее время под дисциркуляторной энцефалопатией (ДЭ) принято понимать клинический синдром поражения головного мозга сосудистой этиологии, в основе которого могут лежать как повторные инсульты, так и хроническая недостаточность кровоснабжения головного мозга или их сочетание [3, 5]. В зависимости от выраженности нарушений принято выделять три стадии ДЭ.

На I стадии симптоматика носит преимущественно субъективный характер. Больные жалуются на головную боль, несистемное головокружение, шум в ушах или тяжесть в голове, нарушение сна, повышенную утомляемость при физических и умственных нагрузках, забывчивость, трудности концентрации внимания. Очевидно, что указанные выше симптомы носят неспецифический характер. Предполагается, что в их основе лежит легкое или умеренное снижение фона настроения. Эмоциональные расстройства при хронической недостаточности кровоснабжения мозга имеют органическую природу и являются результатом вторичной дисфункции лобных долей головного мозга вследствие нарушения фронто-стриарных связей [3].

Наряду с эмоциональными расстройствами на I стадии ДЭ могут выявляться также нарушения когнитивных функций, чаще всего в виде замедленности высшей нервной деятельности, уменьшения объема оперативной памяти, инертности интеллектуальных процессов. Данные нейропсихологические симптомы отражают заинтересованность глубинных отделов головного мозга с вторичной дисфункцией лобных долей. Как правило, на I стадии ДЭ когнитивные нарушения не формируют клинически очерченного синдрома и поэтому классифицируются как легкие [3, 88, 92].