Управління продукційним процесом вирощування стевії медової



Таблиця 4.6 Продуктивність сомаклональних варіантів стевії (польовий дослід, 2005-2010 рр.)

Серед сомаклональних ліній були також окремі тетраплоїдні рослини, які перевищували вихідну форму за загальною сумою глікозидів.

Крім стевіозиду та ребаудиозиду з допомогою тонкошарової хроматографії з денситометруванням виявлена незначна кількість глікозида стевіолбіозида та двох не ідентифікованих глікозидів, які знаходилися у сомаклональних варіантах в різній кількості.

Таким чином, методом індукованого морфогенезу одержано нові сомаклональні лінії, які відрізняються між собою і порівняно з вихідними формами не тільки за морфологічними ознаками, а й за біохімічним складом глікозидів, тому можуть бути вихідним матеріалом для селекційної роботи зі стевією.

З метою розширення генофонду стевії і отримання цінних для селекції і генетики форм у роботі зі стевією в Інституті біоенергетичних культур і цукрових буряків використано метод експериментального мутагенезу, який суттєво підвищує спадкову мінливість. Перш за все, проведено дослідження з добору найбільш ефективних мутагенів, їх концентрацій і специфіки застосування в культурі in vitro.

Редько B.I., використовуючи для обробки меристем стевії 0,04% водний розчин нітрозометилсечовини, отримала мутанти стевії. Із оброблених мутагеном і висаджених на поживне середовище меристем вижило 42,2 %, а 11,9 % із них дали химерні пагони. Ростові процеси у меристем, які вижили, були значно пригнічені, зменшувалась їх здатність утворювати кореневу систему. Оцінку активності нітрозометилсечовини на утворення хлорофіл дефектних мутантів проводили за показником частоти їх виникнення у другому пасажі. Цитологічні дослідження рослин у культурі
in vitro виявили такі аномалії в процесі мітозу: утворення мостів і хроматинових тяжів, відставання хромосом і нерівномірний розподіл їх до полюсів в анафазах, викидання хромосом у цитоплазму, злипання хроматину, порушення веретена ділення, асинхронність ділень. На стадіях метафази і анафази мітозу утворювалися згустки аглютинованого хроматину, які виникали в результаті злипання хромосом. В окремих випадках спостерігали дуже великі клітини з гіпертрофованими ядрами. Автором отримано такі типи мутацій: альбіна, альбідовірідіс, макулата та лютесценс [17].

Від меристем, що вижили після обробки їх мутагеном, отримано мікроклональні лінії, що відрізнялись між собою морфологічними ознаками та силою росту; виявлено не полеглі форми з міцними стеблами, а також рослини із зміною форми листків, виділено форму з відновленим ростом центрального стебла.

Таким чином, методом експериментального мутагенезу при використанні біотехнологічних методів можна отримати цінні для селекції вихідні форми стевії.

Перспективним методом нетрадиційної селекції є метод виділення і культивування протопластів та регенерація із них рослин. За допомогою хімічних речовин та електричного струму можливе злиття клітин без клітинних оболонок різних видів рослин, несумісних при статевому розмноженні. Це дає можливість мати високий коефіцієнт розмноження та отримувати соматичні гібриди із зміненим генотипом. В Інституті біоенергетичних культур і цукрових буряків В.І. Редько розроблено методику виділення і культивування протопластів стевії, для чого випробовували різні ферментні розчини і умови інкубації протопластів. Для визначення оптимальних умов культивування протопластів випробовували різні поживні середовища. Відпрацьовано техніку виділення і очистки протопластів. Кращим виявився варіант сівби протопластів у рідкому поживному середовищі над шаром середовища агар-агару. Спостерігали не тільки регенерацію клітинної оболонки протопластами, але й поодиноке первинне ділення клітин.

В результаті досліджень було зазначено, що ефективність отримання протопластів залежить від генотипу вихідного матеріалу і його фізіологічного стану.

Стевія належить до групи рослин, які використовуються не тільки з метою одержання органічних і мінеральних речовин, а й хімічних сполук, вторинних метаболітів, які не є ні джерелом енергії, ні запасними речовинами. До таких вторинних хімічних сполук і належить комплекс солодких низькокалорійних глікозидів, які синтезуються стевією. Вихідними речовинами для біосинтезу вторинних спо-лук є різні проміжні органічні продукти обміну речовин.

Деякі автори вказують на те, що субклітинними центрами синтезу стевіола (аглінона гликозидів стевії) є пластиди. Із ізольованих хлоропластів виділено комплекс ферментів, які здійснюють синтез попередника стевіола - каурена. Очевидно, що в листках стевії проходить не тільки накопичення глікозидів, але й здійснюється їх синтез.

Створення нових сортів та гібридів стевії неможливе без постійного вивчення динаміки кількісного та якісного складу дитерпенових глікозидів.

За даними авторів [21, 22, 23, 24], у листках стевії від сухої маси накопичується в середньому біля 6-7 % глікози-дів, але залежно від умов вирощування, різноманітності форми, сорту чи гібриду стевії кількість їх може коливатися від 2-3 до 20 %. Найбільше накопичення солодких речовин у листках стевії спостерігається в період бутонізації, перед цвітінням. За умов затримки із збиранням стевії частина врожаю може бути втрачена, тому що під час цвітіння кількість глікозидів зменшується. За вмістом глікозидів найбільш продуктивною є середня частина рослини - на висоті від 40 до 60 см від землі.

Найбільше глікозидів містять середні за розмірами, функціонально дозрілі листки; у молодих та старих листках солодких речовин менше. Здерев'янілі стебла й пагони та кореня містять дуже мало солодких речовин.

У рослин стевії, які вирощували у культурі in vitro в колбах Ерленмейєра на 250 мл, глікозиди виявлено в 20-денних за віком рослин. Найбільше глікозидів містили рослин у 30-35 денний вік; у двомісячний вік рослини стевії глікозиди були практично відсутні. Можна припустити, що вони були використані рослинами в процесі життєдіяльності як енергетичний матеріал.

Солодкий смак стевії обумовлений наявністю дитерпенових глікозидів, що мають аглікон стевіол, але різняться за вуглеводною частиною, кількістю молекул глюкози чи рамнози. Вільний стевіол у рослин стевії, як правило, відсутній.

З метою визначення вмісту глікозидів у стевії в ІБКіЦБ УААН Т.К. Яворською випробувано ряд методів:

Тонкошарова хроматографія з денситометруванням плями ізостевіолу після кислотного гідролізу.

Тонкошарова хроматографія з денситометруванням індивідуальних компонентів глікозидного комплексу.

Тонкошарова хроматографія з колориметричним визначенням індивідуальних плям глікозидів за допомогою фарбування їх антроном.

Потенціометричне титрування сумарного зразка гідролізованих глікозидів.

Рідинна хроматографія високого тиску індивідуальних компонентів глікозидного комплексу.

Для проведення серійних масових аналізів з випробуваних методів найбільш швидким та досить точним виявився метод високоефективної рідинної хроматографії та тонкошарової хроматографії комплексу глікозидів з денситометруванням.

Розроблено також методику підготовки та очищення зразків і відпрацьовано режим та параметри хроматографування на рідинному хроматографі високого тиску Ультрохром та Міліхром-2.

Проведено дослідження з напрацювання чистих зразків індивідуальних глікозидів.

Виділені зразки чистих глікозидів мали ступінь чистоти 90-95 % і їх використовували як "мітки" при хроматографуванні для побудови калібровочних графіків.

В результаті цих досліджень Т.К. Яворською та ін. співробітниками ІЦБ УААН розроблено методику кількісного та якісного визначення дитерпенових глікозидів стевії.

Хімічна структура:

Стевіола R₂R₂H С₂₀Н₃₂О₁₀ Стевіозида R₂b-D - глюкопіранозил, R₂-b-D - софорозил - С₃₈Н₆₀О₁₈.

Крім глікозидів, у органах стевії виявлено й інші речовини, значення яких у метаболізмі рослин поки невідоме. Хімічний склад органів стевії за даними різних авторів наведено в табл. 4.7.

Багато речовин в стевії знаходяться в низьких концентраціях - лабданові глікозиди, стероли. Деякі речовини, а саме: таніни, ефірні масла, можуть мати практичне використання, що необхідно передбачити при безвідходній переробці листків стевії.

Таблиця 4.7 Хімічний склад стевії

Клас сполуки	Назва	Частина рослини	Кількість, %	Автор
Дитерпеновий глікозид	Стевіозид	Листки	4,5	Brigel & Lavieille (1931a)
		Листки	7,0	Wood and Fletcher (1956)
	Стевіолбіозид	Листки	0,04	Kohda etal. (1976b)
	Ребаудиозид	Листки	1,43	Kohda et al. (1976b)
	Ребаудиозид С = дулькозид	Листки	0,4	Sakamoto et al. (1977a)
	Ребаудиозид В	Листки	0,44	Kohda etal. (1976b)
	Ребаудиозид Д	Листки	0,03	Sakamotoet al. (1977a)
	Ребаудиозид С	Листки	0,03	Sakamotoet al. (1977a)
	Дулькозид А	Листки	0,029	Kohda etal. (1976b)
Лабданові глікозиди	Янол	Листки	0,0063	Sholichin etal. (1980)
	Аустроінулін	Листки	0,6	Sholichin etal. (1980)
	6-0-ацетил-аустро інулін	Листки	0,15	Sholichin etal. (1980)
Тритерпени	Амірил ацетат	Листки	-	Sholichin etal. (1980)
	Лупеол	Листки	-	Sholichin etal. (1980)
Стерол	Сітостерол	Листки		Sholichin etal. (1980)
	Стітмастерол	Листки	-	Sholichin etal. (1980)
	Стітмастерол	Калус	0,00091	Nobeta et al.(1976)
Флаваноїдні глікозиди	Рутин	Калус	0,0073	Suzuki etal. (1976)
Таніни		Листки	7,8	Chung and Lee (1979)
Стерол		Трава	0,12	Fujita et al. (1977)
		Трава	0,16	Fujita etal. (1977)
		Трава	0,43	Fujita et al. (1977)

Дитерпенові глікозиди заслуговують особливої уваги з точки зору біохімії синтезу і перетворення речовин у рослинах. Механізм синтезу їх у стевії досі невідомий. Можна припустити, що глікозиди виконують роль запасних речовин, які частково витрачаються в процесі росту й метаболізму стевії. В лабораторії встановлено кількісну і якісну різницю в складі фенолів і флавоноїдів; за вмістом і складом фенольних речовин у листках стевії вони різняться залежно від регіону вирощування. У культурі in vitro різний склад їх був у калусі і в рослинах. Залежно від умов вирощування відміни були у мінеральному складі листків і стебел.

Стевія характеризується значним вмістом калію і низьким вмістом натрію, що свідчить про її низьку солестійкість.

Як відзначалося вище, глікозидний комплекс стевії містить 8 компонентів, що відрізняються вуглеводними частинами при наявності спільного циклічного аглікону-стевіолу (табл. 4.8).

Таблиця 4.8 Хімічний склад компонентів глікозидного комплексу стевії

Переважна більшість генотипів стевії мають співвідношення стевіозиду до ребаудиозиду А в межах 3:1; в цьому випадку середня ступінь солодкості препарату з таких листків становить приблизно 300. У нашій колекції генотипів виявлено різні типи співвідношень глікозидів, про що наведено в табл. 4.9.

1^-й тип - вміст стевіозиду переважає над ребаудиозидом А з низьким вмістом інших глікозидів;

2^-й тип - приблизно однаковий вміст стевіозиду і ребаудиозиду;

3^-й тип - високий вміст стевіозиду і дуже низький вміст ребаудиозиду;

4^-й тип - наявність стевіозиду, незначний вміст стевіолбіозиду і повна відсутність ребаудиозиду А;

5^-й тип - характеризується переважаючим вмістом дулькозидів А і В.



Таблиця 4.9 Вміст та співвідношення дитерпенових глікозидів у листках гібридів стевії, одержаних за методом ембріокультури

Для визначення вмісту дитерпенових глікозидів у тетраплоїдних номерів стевії різного походження зразки для аналізу брали двічі: в серпні перед цвітінням і в кінці вересня після цвітіння (табл. 4.10).

Порівняно з контролем 2n, майже у всіх тетраплоїдних номерів спостерігався високий вміст глікозидів, особливо перед цвітінням. Десять тетраплоїдних номерів із 13 перевищували диплоїдний стандарт 2n за показником загальної суми глікозидів (стевіозиду та ребаудиозиду), яка коливалась від 8,40 до 9,70 %, а шість номерів перевищували контроль 2n за вмістом ребаудиозиду, кіль-кість якого коливалась від 5,45 до 7,18 % (контроль - 4,67 %). У вересні вміст солодких глікозидів у більшості номерів, крім стандарту 2n, значно знизився, що можна пояснити використанням їх під час цвітіння на створення генеративних органів.

Таблиця 4.10 Вміст дитерпенових глікозидів у листках тетраплоїдних номерів

Вміст дитерпенових глікозидів у тетраплоїдних і гібридних номерів стевії розподілявся таким чином: 25 номерів перевищували стандарт 2n за сумою глікозидів: ребаудиозиду та стевіозиду, а 22 номери - за вмістом ребаудиозиду (табл. 4.11).



Таблиця 4.11 Вміст глікозидів у селекційних номерах стевії, 2006 р.

походження	показник по графіку	концентрація, %	сума r+st
	r	st	r	st
1	2	3	4	5	6
контроль-2n	1,4	3,9	0,6	1,6	2,2
берегиня	12,4	9,8	2,5	1,9	4,4
4n	19,3	23,9	3,9	4,8	8,7
4n	2,9	7,2	0,6	1,4	2,0
4n	11,8	12,5	2,4	2,5	4,9
1	2	3	4	5	6
2n	2,6	5,3	0,5	1,1	1,6
2n	2,8	7,1	0,6	1,4	2,0
кс	5,4	14,1	1,1	2,8	3,9
4n	8,4	13,4	1,7	2,7	4,4
4n	8,6	13,8	1,7	2,8	4,5
4n	10,6	19,6	2,1	3,9	6,0
4n	10,9	29,9	2,2	4,2	6,4
гібрид	3,7	5,9	0,7	1,2	1,9
гібрид	5,1	10,0	1,1	2,0	3,1
гібрид	16,5	17,7	3,3	3,6	6,9
гібрид	2,3	9,0	0,5	1,8	2,7
гібрид	13,0	11,5	2,6	2,3	4,9
гібрид	15,2	15,5	3,1	3,1	6,2
гібрид	16,9	13,8	3,4	2,8	6,2
2n	10,5	21,5	2,1	4,3	6,4
гібрид	5,3	18,3	1,4	3,7	4,8
2n	14,3	21,3	2,8	4,3	7,1
гібрид	18,8	15,8	3,8	3,2	7,0
гібрид	7,4	17,9	1,5	3,6	5,1
гібрид	3,8	14,5	0,8	2,9	3,7
2n	9,0	13,5	1,9	2,7	4,5
2n-з	4,0	14,4	0,8	2,9	3,7
гібрид	2,8	9,2	0,6	2,0	2,6
гібрид	5,4	19,1	1,1	2,0	3,1
гібрид	1,5	3,3	0,3	0,7	1,0
славутич	1,9	3,2	0,4	0,8	1,2



Найвищі показники суми глікозидів мали три тетраплоїдні номери: від 6,0 до 8,7 % та п'ять гібридів - від 6,0 до 7,0 %.

Найвищим вмістом ребаудиозиду відзначився один тетраплоїдний номер - 3,9 % та три гібриди - від 3,1 до 3,8 %.

4.2 Продуктивність номерів, сортів та гібридів стевії

На сьогоднішній день в Україні є п'ять сортів стевії, які створено в Інституті біоенергетичних культур і цукрових буряків НААН. Це сорти Берегиня (авторське свідоцтво № 1232 від 1999 р.), Славутич (авторське свідоцтво № 1233 від 1999 р.), Галина (авторське свідоцтво № 170873 від 2017 р.), Марина (авторське свідоцтво № 170874 від 2017 р.), Катерина (авторське свідоцтво № 170875 від 2017 р.).

Екологічні випробування номерів, сортів та гібридів стевії проводяться у різних кліматичних зонах: у Центральному Лісостепу України, в Закарпатті, Степу і в Криму. Вміст дитерпенових глікозидів залежав насамперед від різних номерів і сортів стевії. Так, у 2005 році найбільша сума стевіозиду і ребаудиозиду було у сорту Берегиня - 15,4 % та в тетраплоїда (N5) - 15,5 %; найменша - у тетраплоїда (N7) - 9,2 % та в гібрида (N16) - 9,5 % (табл. 4.12).

Для проведення польових селекційних випробувань щорічно вирощується розсада кращих номерів стевії в культурі in vitro та методом зеленого живцювання з наступним дорощуванням її на стелажах у пристосованих для цього приміщеннях.

Всі номери випробовуються порівняно з контролем St 2n інтродукованим в Інституті цукрових буряків з 1985 р., а також із сортами "Берегиня" і "Славутич". Крім диплоїдних номерів щорічно випробовували тетраплоїдні та гібридні номери, а також кілька генотипів, отриманих з рослин in vitro, що піддавалися дії космічних факторів - "космічні" номери.

Розсаду висаджували у відкритий ґрунт, коли минала загроза заморозків - в кінці травня або на початку червня за схемою 20 х 50 см або 20 х 45 см у чотирьох повтореннях.

Таблиця 4.12 Вміст дитерпенових глікозидів різних номерів і сортів стевії (Центральний Лісостеп, 2005 р.)

№ п/п	Походження генотипів	Стевіозид St	Ребаудиозид R	Сума St + R
1	Контроль - 2 n	6,2	6,3	12,5
2	Сорт "Берегиня"	7,2	8,2	15,4
3	Сорт "Славутич"	6,6	5,0	11,6
4	4n	6,3	8,5	14,8
5	4n	5,5	10,0	15,5
6	4n	5,9	7,5	13,4
7	4n	6,4	2,8	9,2
8	4n	8,0	5,6	13,6
9	4n	4,6	5,2	9,8
10	4n	6,4	8,0	14,4
11	4n	5,6	9,0	14,6
12	4n	5,6	6,2	11,8
13	Космічний	6,4	3,2	9,6
14	Космічний	6,5	4,0	10,5
15	Космічний	6,6	6,4	13,0
16	Гібрид	4,7	4,8	9,5
17	Гібрид	5,4	4,8	10,2
18	Гібрид	8,0	4,9	12,9
19	Гібрид	8,2	5,2	13,4
20	2n	8,2	4,8	13,0
21	2n	7,2	7,3	14,5
22	2n	4,8	5,4	11,2
23	2n	8,1	6,0	14,1

У дослідах проводили фенологічні спостереження за фазами росту й розвитку, біометричні обстеження, обліки маси сирої рослини, урожайність сирих та сухих листків, вміст в листках сухої речовини, накопичення дитерпенових глікозидів, їх якісний склад, обліковували стійкість рослин до захворювань.

Окремі роки, особливо 2005 рік, не були сприятливими для росту й розвитку стевії. Холодне та дощове літо не сприяло нормальному росту й розвитку рослин, тому висота рослині їх продуктивність були невисокими. Висота рослин у Київській області становила 45-60 см, у Закарпатті - 60-65 см. У 2004 р. висота окремих гібридів досягала 73 см. Високими темпами росту виділялися "космічні" і тетраплоїдні номери, а також сорт "Славутич", окремі гібриди. У 2006 році висота рослин у Київській області була дещо більшою, ніж у минулі роки, а на ділянках ІБКіЦБ НААН (Київ) - досягала 78,0 см.

Накопичення в листках абсолютно сухої речовини залежить від активності фотосинтезу та збалансованості біохімічних процесів. Вміст абсолютно сухої речовини коливався від 19,5 до 30,4 %; найбільшим вмістом сухої речовини відзначилися гібриди та "космічний" номер - відповідно 30,1 та 30,4 % (на контролі St 2n - 24,3 %). У тетраплоїдів вміст сухої речовини коливався від 24,2 до 26,9 % (табл. 4.13).

У 2006 р. коливання за показниками вмісту абсолютно сухої речовини становили від 22,9 до 28,3%. Під час збирання врожаю серед досліджуваних номерів виявилися значні різниці врожайності сирих і сухих листків (табл. 4.13). Найвища маса сирої рослини, сирих і сухих листків були у сорту "Берегиня", тетраплоїдних та гібридних номерів, а також "космічного" номера. Маса сухих листків у окремих тетраплоїдних номерів та двох гіб-ридів більше, ніж у 1,5 рази перевищувала контроль, а "космічний" номер 13 - майже у два рази перевищував контроль.

За вмістом глікозидів номери й сортів стевії мали такі відміни: відносно високий вміст був у 2009 році - сума їх коливалась від 9,2 до
15,5 %; у п'яти тетраплоїдних номерів із дев'яти сума глікозидів становила від 13,6 до 15,5 % (на контролі 2n - 12,5 %), а вміст ребаудиозиду в них перевищував вміст стевіозиду і коливався від 7,5 до 10,0 %.

Сорт "Берегиня" також відзначився високими показниками: сума глікозидів становила 15,4 %, а вміст ребаудиозиду досягав 8,2 %. У одного із тетраплоїдних номерів 05 (рис. 4.5) кількість ребаудиозиду майже у два рази перевищувала кількість стевіозиду і досягала 10,0 %. У "Космічних" номерів сума глікозидів коливалась від 9,6 до 13,0 %, у гібридів - від 9,5 до 13,0 %, а вміст ребаудиозиду не перевищував вмісту стевіозиду (рис. 4.6). У диплоїдних номерів сума глікозидів коливалась від 11,2 до 14,5 %. У одного із диплоїдних номерів вміст ребаудиозиду дещо перевищував вміст стевіозиду і становив 7,3 %, а сума глікозидів досягала 14,5 % (табл. 4.13).

Таблиця 4.13 Висота й морфологічна структура рослин та вміст сухої речовин за номерами й сортами стевії (Центральний Лісостеп, 2005-2008 рр.)

Необхідно зазначити, що в різних екологічних зонах продуктивність стевії значно різнилася (табл. 4.14).



Таблиця 4.14 Продуктивність номерів і сортів стевії (Центральний Лісостеп, 2005-2009 рр.)

рослина медовий екологічний

В Західному Лісостепу середня маса однієї рослини була досить високою і варіювала за номерами від 270 до 330 г, маса сирих листків з однієї рослини - від 120 до 155 г (табл. 4.15).



Таблиця 4.15 Продуктивність різних генотипів стевії в західному Лісостепу, 2009 р.

Походження генотипу	Ви-сота рослин, см	Частка сухих листків від маси сирої рослини,%	Сира маса, г	Частка листків у сирій масі рос-лини, %	Маса сухих листків однієї рослини, г
			рос- лини	листків з рослини
Контроль 2n	65	12,5	280	120	42,9	35
4n	60	15,6	320	145	45,3	50
4n	65	18,5	270	115	42,6	50
Сорт "Берегиня"	65	11,1	270	120	44,4	30
4n	66	15,8	285	135	47,4	45
Гібрид	66	16,9	295	135	45,8	50
Гібрид	66	13,6	315	150	47,6	43
2n	66	15,2	330	155	46,9	50
2n	60	13,6	330	160	48,5	45
Гібрид	66	16,4	305	145	47,5	50
Гібрид	66	14,1	320	155	48,4	45
Гібрид	60	13,6	295	135	45,8	40
Гібрид	66	12,1	290	130	44,8	35

В Центральному Лісостепу більш сприятливим для росту й розвитку стевії був 2009 рік. У Київській області в тому році маса однієї рослини стевії не перевищувала 117 г, а маса сирих листків однієї рослини - від 19,1 до 68,6 г (табл. 4.16).



Таблиця 4.16 Продуктивності різних генотипів стевії в Центральному Лісостепу (2009 р.)

№ генотипів, їх походження	Висо-та рос-лин, см	Частка сухих листків в масі си-рої рос-лини%	Вміст абсо-лютної сухої речови-ни, %	Маса однієї сирої росли-ни, г	Маса сирих листків однієї рослини, г	Врожай-ність сухих листків, т/га
Контроль 2n	75,0	15,6	25,3	198	113	1,6
4n	60,7	15,8	27,5	157	90	1,9
2n	43,3	13,7	26,0	291	145	2,4
Сорт "Берегиня"	63,6	14,5	25,6	234	124	2,7
4n	71,7	13,6	25,8	265	129	3,2
Гібрид	63,3	13,5	25,9	301	147	3,5
Сорт "Славутич"	65,0	14,8	23,8	204	122	3,2
Гібрид	46,3	15,4	26,8	150	83,4	1,2
4n	53,3	15,9	28,3	282	155	2,2
Сорт "Космічний"	57,7	14,1	27,2	393	200	4,4
4n	66,0	12,8	22,9	219	115	2,2
Сорт "Космічний"	56,0	14,8	25,7	170	91,7	2,6
Гібрид	58,1	14,1	26,8	260	128	1,3
НІР05	3,5	0,8	1,5	65	15,4	0,6

Середня маса однієї рослини окремих номерів у Київській області досягала 393 г, найменша маса однієї рослини коливалась від 83,4 до 200 г. Врожайність сухих листків номерів і сортів стевії коливалась від 1,2 до 4,4 т/га; у тетраплоїдних номерів - від 1,9 до 3,2 т/га, у гібридів - від 1,2 до 3,5 т/га, одного із "космічних" номерів - 4,4 т/га, а контрольного варіанта 2n - 16 т/га, сорту "Берегиня" - 2,7 т/га, "Славутич" - 3,2 т/га (табл. 4.17).

За більшістю досліджених показників чотири тетраплоїдні, три гібридні номери та один диплоїдний "космічний" номер ряд заслуговують подальшої уваги і продовження з ними селекційної роботи. Вони значно перевищують контроль за врожайністю сирих і сухих листків, вмістом дитерпенових глікозидів і стійкістю до захворювань.

1. В Україні стевія відносно нова культура, яку інтродуковано в 1985 році. В результаті інтродукції стевії в Україну було завезено вузькогенетичний вихідний матеріал цієї культури.

2. Впровадження у виробництво нових форм, сортів і гібридів стевії є найбільш ефективним елементом технології її вирощування. Основною результатуючою ознакою, що визначає продуктивність стевії, є висока врожайність сирого і сухого листя та високий вміст у листках сухої речовини, накопичення в ній якісних дитерпенових глікозидів та стійкість до шкідників і хвороб.

3. З метою розширення генофонду стевії і отримання цінних для селекції і генетики вихідних форм за структурними елементами врожаю (висота рослин, кількість продуктивних пагонів, площа листкової поверхні) використовували методи: поліплоїдії, гібридизації, експериментального мутагенезу, виділення і культивування протопластів у культурі in vitro, індивідуального добору.

4. Селекційні номери, одержані з одного і того ж генотипу, суттєво різнилися за морфологічною будовою і рівнем урожайності, електрофоретичними характеристиками лізоформ пероксидази, вмістом і якісним складом дитерпенових глікозидів. За продуктивністю виділено 7 кращих тетраплоїдних номерів, які переважали вихідні диплоїдні форми за загальною масою листків на 30-41 %.

5. В Інституті біоенергетичних культур і цукрових буряків станом на 2017 рік створено п'ять сортів стевії: Берегиня, Славутич (свідоцтва №№ 1232 і 1233, 1999 рік, автори Зубенко В.Ф., Ільєнко І.І.), Галина, Марина і Катерина (свідоцтва №№ 170873, 170874 і 170875, 2017 рік, автори МАНДЮК Й.В., Ендружіевська Л.П., Саганова Т.П.).



5.Методи розмноження та продуктивність стевії медової

Стевія медова походить із центральної частини субтропічного Парагваю - Амамбей з великими перепадами температур, туманами, вітрами, зливами та високим рівнем залягання ґрунтових вод. Цим і зумовлена коротка коренева система стевії медової, її стійкість до перезволоження. Стевія медова особливо вимоглива до вологи на почтку та в середині вегетації - після посадки в полі та в період росту й розвитку.

Стевія медова не стійка до низьких температур. Тому за температури нижче +12⁰С майже не росте і не розвивається; вона чутлива до заморозків. Саме тому в Україні в природних умовах її вирощують як однорічну культуру в регіонах помірного клімату, оскільки у зимовий період її кореневища вимерзають.

Стевія медова - рослина короткого світлового дня. Із його скороченням вона переходить до генеративного розвитку. Саме тому в різних географічних зонах вона розвивається по різному: чим ближче до екватору, тим коротшим у стевії буде період вегетативної маси, і, навпаки, при віддаленні від нього на північ чи південь рослини можуть довше розвиватися, період цвітіння у них затримується, і вони накопичують більшу вегетативну масу.

Стевію медову розмножують двома способами: вегетативним та насінням.

5.1 Вегетативне розмноження стевії

5.1.1 Розмноження стевії методом культури тканин

Мікроклональне розмноження стевії дозволяє одержати від однієї вихідної рослини до одного мільона ідентичних рослин за півроку та розмножувати в потрібній кількості селекційні матеріали.

Дослідження проводили впродовж 2005-2016 рр. згідно схеми досліду.

Для введення стевії в стерильну культуру використовували верхівки інтенсивно зростаючих пагонів розміром 2-4см. Для їх стерилізації використовували 0,1% розчин сулеми з тривалістю експозиції 25-40 хв., потім 3-4 рази промивали стерильною дистильованою водою. Робота проводиться в стерилізованому боксі з ламінарним горизонтальним потоком повітря (вар.1). Стерильні експлантати висаджували у колби ємністю 200-300 мл зі стерильним агаром і утримували у приміщенні з відносною вологістю 70%, температурою повітря 24-26°С, освітленням 5-6 тис. люкс тривалістю 12-14 годин (рис. 5.1) (вар.2).

В колбі ємністю 200-300 мл можна розмістити 10-12 рослин, з яких через 20-25 днів одержували 40-60 нових експлантатів, які знову висаджують на свіже живильне середовище.

Нижню частину рослин з розвинутою кореневою системою й 4 бічними листочками з пазушними бруньками висаджували в горщики або ящики з живильним субстратом у закритий ґрунт для одержання розсади або дорослих рослин. Стерильні рослини розділяли на кілька частин з двома міжвузлями й парою листів із пазушних бруньок або з верхівковою апікальною меристемою. Введені в стерильну культуру експлантати на 4-5 день від посадки починають відростати. У місці прикріплення експлантатів до живильного середовища утворюється коріння. Протягом 18-20 днів кількість рослин збільшувалась в 10 разів. До кінця культивування рослини утворюють потужну кореневу систему й надземну масу з 6-8 парами листів (рис. 5.2). Культивування експлантатів стевії проводили на стерильних живильних середовищах Гамбурга або Мурасиге й Скуга, що містять комплекс мінеральних макро й мікроелементів, вітамінів, амінокислот, гормонів. В якості джерела вуглецю й енергетичного матеріалу використовується сахароза. Для одержання твердого живильного середовища застосовується різної концентрації агар; рН середовища підтримується в межах 5,6-5,8.



Перед посадкою стевії, вирощеної за методом культури тканини, готували оптимальні за площею посадкові ємності з достатньою товщею субстрату - не менш 8см і площею живлення, яка забезпечує нормальний ріст і розвиток рослин протягом 55-60 днів. Від поверхні субстрату до верхнього краю ємності повинне бути 10-15см (рис. 5.3).

Для посадки стевії готували суміш із однієї частини піску й трьох частин перліту, в яку вносили елементи живлення у формі розчинів солей і кислот.

Перліт - мінерал вулканічного походження; він містить до 70-75 % кремнезему, біля 10-15 % глинозему, 1,5-2 % окислів заліза й невелику кількість окисів кальцію й магнію. Під час термічної обробки мінерал перетворюється в однорідний пористий матеріал, що використовується в якості субстрату для вирощування рослин на гідропоніці, при живцюванні, а також для поліпшення структури важких ґрунтів.

Так як окремі компоненти елементів живлення стевії під час розчинення вступають між собою у хімічну реакцію, формували п'ять нейтральних між собою наважок, розчиняючи їх в п'яти колбах з теплою водою. На суміш з одного відра піску й трьох відер перліту вносили наступні сполуки:

Після внесення з кожної колби розчину субстрат ретельно перемішують. За вирощування розсади стевії з пасерованого матеріалу елементи живлення можна вносити у формі простих добрив у формах карбаміду, суперфосфату простого чи гранульованого і калійної солі. На обсяг субстрату, що складає із трьох відер перліту й одного відра піску, вноситься 46%-ного карбаміду - 3,1 г, 20%-ного суперфосфату простого чи гранульованого - 10,0г, 40%-ної калійної солі - 5,0г і ретельно перемішуються із субстратом.

Для висадки й вирощування стевії можна застосовувати й ґрунт, але у зв'язку з тим, що приживаність рослин, висаджених безпосередньо в нього низька, поверх нього насипали чистий перліт шаром 1-2см. Корінці стевії добре ростуть і розвиваються в шарі перліту і надалі проникають у ґрунт.

Система удобрення субстрату з ґрунту аналогічна з піском і перлітом. Так як субстрат з ґрунту на відміну від пухкого субстрату з піску й перліту ущільнюється і коренева система під час пересадження розсади обривається, розсаду відразу формували у касети й торфоперегнійні горщики.

Перед посадкою рослини, що вирощені in vitro ретельно переглядали. Вибраковували інфіковані рослини, з відсутньою або не розвинутою кореневою системою, з ушкодженими стеблами, почорнілими пазушними бруньками, однією нижньою парою листів; такі рослини після зазвичай гинуть. Для кращої приживаності стебло обрізали від коріння вище другого міжвузля, так щоб на рослині залишилося дві пари листів. Листові пластинки усікали на ?, що сприяло зниженню транспірації й покращенню приживаності рослини.

Пасерований матеріал має добре розвинену кореневу систему. Під час посадки її розташовували вертикально без загинань, для чого довгі корінці підрізали. Посадку рослин з колб у субстрат проводити якнайшвидше, тому що вони швидко втрачають тургор, в'януть і гинуть. Щоб цього не відбулося, підготовлений до посадки матеріал погружали у 0,1 % розчин MnS0₄, в якому рослина може перебувати до трьох годин. Під час посадки субстрат навколо кореневої системи рослин добре ущільнювали, а після посадки - добре поливали. За вирощування розсади вологість субстрату пісок-перліт підтримувалася на рівні 50% повної вологоємності; температура поливної води - не нижче 20°С.

Після посадки розсади ящики або стелажі накривали поліетиленовою прозорою плівкою або склом, що дозволяє підтримувати в ящику високу вологість повітря і сприяє кращій приживаності рослин.

Через 7-10 днів після посадки рослини починали поступово загартовувати, для чого на короткий строк (до декількох хвилин) знімалися плівка або скло. Поступовий час загартовування збільшувався, а через 4-5 днів покриття знімали зовсім, але не допускали сильного зів'янення й скручування листків, тому загартовування проводилися поступово й обережно. Перед висадженням розсади в ґрунт у польових умовах проводили загартовування протягом 2-5 днів. Готовність розсади для висаджування у відкритий ґрунт з висотою рослин 8-12 см настає через 55-60 діб (вар.5).

Якщо розсада вчасно не висаджена, необхідно проводити підживлення рослин. Перше підживлення проводиться через 30 днів після висадки рослин, наступні - через кожні два тижні. Для першого підживлення використовують 0,3% розчин нітроамофоски з вмістом N:P:K=17,5:17,5:17,5 - 3 г/л води, для наступних 0,5% - 5 г/л води; витрати розчину - 1 мл /рослину в середину
міжрядь. Під час першого підживлення в середині міжрядь робляться борозенки, які після дозованого внесення добрив піпеткою закриваються. За внесення добрив лійкою, концентрацію розчину знижують до 0,1 % (1 г/л води), а витрати розчину збільшують до 5г /рослину. Підживлення не можна проводити за інтенсивного сонячного або штучного освітлення.

Освітленість розсади повинна бути 6-7 кЛюксів, тривалість світлового періоду - 16 годин. Для освітлення використовуються лампи типу ДРИ-2000, ДРЛ-400, ДРЮ-400 й інші, що здатні забезпечити потрібну освітленість.

5.1.2. Метод зелених живців

Дослідження проводили впродовж 2005-2015 рр. в лабораторії природних цукрозамінників Інституту біоенергетичних культур і цукрових буряків згідно схеми досліду, яка включала 4 варіанти.

Розмноження стевії зеленими черешками виявилося одним з найбільш ефективних. За однолітнього циклу вирощуванні стевії особливе місце приділяється якості зберігання кореневищ, які використовуються для вегетативного розмноження черешками.

За такої технології, у період зберігання рослини проходять стадію спокою, тому умови зовнішнього середовища повинні сприяти її нормальному протіканню. Підготовка до зберігання кореневищ починалася за 10-15 днів до збирання стевії шляхом вибраковки й видалення хворих і слабких рослин.

Викопування й укладання кореневищ стевії на зимове зберігання приступали за умов припинення вегетації (стійких температур +5°С). Висота зрізу рослин перед викопуванням становила в межах 5 см. На малих площах кореневища викопували вручну, а в умовах виробництва - механізованим способом.

Підкопані кореневища, обережно, не пошкоджуючи кореневої системи, вибирали і укладали в дерев'яні або пластмасові ящики, на дно яких насипали шар ґрунту товщиною 3-5см. Кореневища укладали в один шар і присипали ґрунтом.

Під час зберігання кореневищ не допускали як пересихання ґрунту, особливо її верхнього шару, так і перезволоження. Оптимальними умовами є відносна вологість повітря 80-85 %, вологість ґрунту - в межах
20 %, температура повітря - 5-8 °С

З наближенням строків живцювання, з місць зберігання ящики з кореневищами переносили у теплицю, де перебирали і вибраковували загиблі. На життєздатних кореневищах зрізували залишки торішніх основних стебел. Суміш ґрунту з додаванням піску або перліту невеликим шаром насипали на дно ємкостей, зверху укладали кореневища і засипали цією ж сумішшю, ущільнювали і поливали.

В теплиці температуру підтримували +20-25 °С, освітленість -
6-7 кЛюксів. Кореневища періодично поливали, щоб вологість суміші від повної вологоємності становила 50-60 %. За таких умов відростання кореневищ пагонів, придатних для живцювання, відбувається через
10-15 днів. В якості живців використовують верхівки пагонів розміром не менше 6-7 см, з двома, трьома міжвузлями і апікальні живці без пазушних бруньок з двома, трьома і чотирма парами листків.



Таблиця 5.1 Вплив строків живцювання на різогенез і ріст розсади стевії (середнє за 2005-2010 рр.)

За живцювання в лютому краще вкорінення, ріст і розвиток мала розсада апікальних живців з трьома парами листків, задовільною ? за використання живців з двома парами листків. Використання апікально-пазушних живців в цей період малоефективне із-за їх слабкої приживаності (33 %) і уповільненого різогенезу. Апікально-пазушні живці без п'ятки приживаються краще (71 %), ніж з п'яткою, але утворюють дуже малу кількість корінців на одній рослині. Живцювання в лютому мають пазушні бруньки біля основи, відрізняються кращою приживаністю, підвищеною інтенсивністю різогенезу, росту й розвитку, ніж живці, що не мають бруньок біля основи. За дефіциту в зимові місяці в рослинах фізіологічно-активних речовин, пазушні бруньки біля основи живця стимулювали пересування фітогормонів до ураженої тканини, що сприяло прискореному утворенню калюсу і різогенезу.

В квітні за інтенсивністю різогенезу живці з пазушними бруньками не мали переваг над живцями без пазушних бруньок. Розсада, яка вирощена з живців без пазушних бруньок, за кількістю й довжиною корінців, довжиною стебла переважала або дорівнювала розсаді, отриманій з живців з пазушними бруньками, хоча в наступні періоди розсада з живців без пазушних бруньок була кращою за облистяністю, висотою й інтенсивністю утворення пагонів.

Якщо за використання живців з пазушними бруньками ініціація кореневих зачатків і розвиток коренів відмічається у нижній частині стебла на межі утворенню калюсу, то за використанні живців без пазушних бруньок корінці, як правило, утворюються на всій довжині нижньої частини стебла в субстраті. Середня кількість корінців на одній рослині в таких умовах збільшується на 30-40 %, що пов'язано достатньою кількістю фітогормонів у пазушній бруньці, які стримують процес різогенезу і локалізують процес утворення корінців переважно в нижній частині стебла.

Ступінь облистяності живців мало впливала на інтенсивність різогенезу. Кількість корінців на рослині і їх довжина мало залежали від кількості листків на живці, але останній показник істотно впливав на подальший ріст і розвиток розсади, а саме ? зі збільшенням початкової кількості листків на живці підвищувалися як інтенсивність росту і утворенні пагонів, так і кількість листків на рослині стевії.

Для одержання повноцінної, добре розвиненої розсади стевії необхідно створювати відповідний фон живлення з використанням оптимальних доз мінеральних добрив з відповідним співвідношенням в них елементів, оскільки найкращий субстрат для приживаності й укорінення зелених живців рослин, одержаних in vitro, є мінеральна суміш перліту з піском у співвідношенні 3:1, яка не містить в собі відповідних поживних речовин.

Складність такої технології полягає в тому, що живці стевії, а особливо рослини, що одержані через культуру тканин, негативно реагують як на підвищену концентрацію, так і нестачу елементів живлення. Якщо за підвищеної концентрації істотно знижується приживаність рослин, то за нестачі елементів живлення важко одержати розсаду необхідних параметрів, хоча приживаність і укорінення живців не знижуються.

Схеми дослідів наведені в табл. 5.2 і 5.3. Досліди проводилися в пластмасових ящиках. Площа одного ящика ? 0,53м²; об'єм субстрату в ящику ? 0,4 м³; маса абсолютно сухого субстрату у ящику 3,56кг. Густота посадки розсади становила 225 рослин/м². Оптимальний водний режим ґрунту утримували шляхом поливів з утворенням запасів вологи на рівні 80-90% повної польової вологоємності (ППВ).

З простих форм мінеральних добрив використовували карбамід, суперфосфат гранульований і калійну сіль; з комплексних ? нітроамофоску.

За дози добрив N₃₀P₃₀K₃₀ кожного елементу живлення на один ящик припадало 0,25 г. Наважки добрив окремо вносили в кожен ящик і ретельно перемішували з субстратом.

Про вплив фону живлення на приживаність і продуктивність розсади стевії з рослин, одержаних методом культури тканин, наведені табл. 5.2.

За внесення добрив дозами N₁₅P₁₅K₁₅ і N₃₀P₃₀K₃₀ приживаність рослин залишалась на рівні контрольного варіанту, але ріст і розвиток рослин порівняно з контролем був значно кращий, а коренева система ? більш розвинута. Із зміною співвідношення елементів живлення або дози добрив ? відповідно N₃₀P₆₀K₆₀ і N₆₀P₆₀K₆₀ ? приживаність рослин знижувалася на 2,0-2,5%, але біометричні показники, що характеризують ріст і розвиток розсади, були істотно вищими, ніж у попередніх варіантах. Порівняно з контролем, із збільшенням дози добрив до N₇₅P₇₅K₇₅ і особливо N₉₀P₉₀K₉₀ приживаність розсади стевії з рослин, одержаних методом культури тканин, знижувалася відповідно на 27,6 і 41,4%.



Таблиця 5.2 Вплив фону живлення на приживаність і продуктивність розсади стевії з рослин, одержаних методом культури тканин (середнє за 2005-2008 рр.)

Розсада стевії із зелених живців без зниження приживаності витримує збільшення концентрації добрив до N₉₀P₉₀K₉₀. Порівняно з контролем, в цьому варіанті рослини були значно вищими, мали більше листків і добре розвинену кореневу систему (табл. 5.3).

Збільшення доз добрив до N₇₅P₇₅K₇₅ і N₉₀P₉₀K₉₀ призводило до істотного зниження приживаності рослин на 20^-й день від посадки ? відповідно до 49,3 86,0%.

Отже, при вирощуванні розсади стевії за методом культури тканин на субстраті з перліту й піску у співвідношенні за об'ємом 3:1(загальний об'єм субстрату 0,4м³) з розміщенням рослин 225 шт./м² оптимальними дозами мінеральних добрив є N₃₀P₆₀K₆₀ і N₆₀P₆₀K₆₀; за вирощування розсади із зелених живців кращими фонами живлення для розсади є відповідно N₆₀P₆₀K₆₀ і N₇₅P₇₅K₇₅. За внесення оптимальних доз добрив в субстрат перед посадкою зелених живців та рослин із культури тканин суттєво прискорюються строки отримання стандартної розсади, що дозволяє зменшити затрати праці й електроенергії для її вирощування.

Таблиця 5.3 Вплив фону живлення на приживаність розсади та продуктивність стевії з живців (середнє за 2005-2010 рр.)

У випадку затримання з висадкою розсади в поле внаслідок не-сприятливих погодних умов, виникає необхідність у її підживленні, для чого були проведені досліди з підживленням розсади нітроамофоскою з вмістом елементів живлення відповідно 17,5%. Встановлено, що для підживлення рослин у міжряддя можна використовувати 0,6% розчин цього добрива, а для поливу зверху - 0,3%. За товщі шару субстрату 8 см. норма поливу на 1 за схеми посадки 4x5 см становила 2,5л/м²; а 5х5 см - 2,0л/м².

Розсада стевії, яка одержана методом культури тканин та із зелених живців, на час садіння у полі повинна мати наступні параметри: висота не <7 і не > 14 см., кількість міжвузлів ? 5-7 і листків - 4-14 шт., стебел - 1-4 шт., товщина стебел знизу - 1-2мм.

Як для культури тканин, так і розсади живців визначені кореляційні зв'язки, які характеризують вплив доз і співвідношень в них елементів живлення на окремі елементи продуктивності розсади у вигляді зеленої і сухої маси (табл. 5.4).

Таблиця 5.4 Кореляційна матриця залежностей окремих елементів продуктивності розсади стевії від фону живлення субстрату (культура тканин) (середнє за 2005-2008 рр.)

Що стосується культури тканин, то зелена й суха маси пов'язані з дозами мінеральних добрив і співвідношеннями в них елементами живлення і впливом їх на окремі елементи структури розсади таким чином. За коефіцієнтами кореляції, вони позитивно й тісно пов'язані з дозами добрив ? відповідно r = 99. Добрива майже функціонально впливали на такі елементи структури розсади як висота рослин (r = 0,90 і 0,91), кільк...