10. МУ 1.3.2411-08. 1.3. Эпидемиология. Биологическая безопасность при глубинном аппаратном культивировании микроорганизмов I - II групп патогенности. Методические указания"

В настоящих указаниях предложен комплекс мероприятий по биологической безопасности при проведении глубинного аппаратного культивирования микроорганизмов I-II групп патогенности с целью изучения процессов кинетики и стехиометрии микроорганизмов, а также получения биомассы бактерий и микробных метаболитов, необходимых при конструировании и производстве иммунобиологических препаратов. Приводятся меры биологической безопасности при культивировании микроорганизмов I-II групп патогенности на лабораторных установках с целью получения ограниченного объема материала в процессе выполнения экспериментальной работы.

Методические указания предназначены для специалистов федеральных государственных учреждений науки и здравоохранения Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, работающих с микроорганизмами I-II групп патогенности, а также могут быть использованы специалистами других заинтересованных организаций.

11. МУ 1.3.2569-09. 1.3. Эпидемиология. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности.

Методические указания определяют принципы организации лаборатории и этапы проведения анализа с использованием методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК): взятие проб, первичная обработка, хранение, условия перевозки, обеззараживание материала, выделение нуклеиновых кислот, проведение обратной транскрипции и (или) амплификации, секвенирование продуктов амплификации, учет и регистрация результатов исследования биологического материала, пищевых продуктов, материала из объектов окружающей среды.

Методические указания регламентируют деятельность персонала лабораторий при выполнении исследований с помощью МАНК, проводимых с использованием зарегистрированных в установленном порядке наборов реагентов и оборудования.



11. Основные методы лабораторной работы

11.1 Микробиологическая лаборатория и правила работы в ней

В учебных заведениях не разрешается работать с живыми патогенными микроорганизмами. Необходимо помнить, что при посеве сапрофитных микроорганизмов из окружающей среды случайно может быть внесена и патогенная микрофлора. Кроме того, работа с сапрофитными бактериями в ряде случаев требует абсолютной стерильности для получения надежных результатов опыта. В микробиологической практике используют главным образом чистые культуры микроорганизмов. Культуру, содержащую микроорганизмы одного вида, называют чистой. Если в культуре содержится более одного вида микроорганизмов, она носит название смешанной.

Микробиологическая лаборатория включает ряд помещений, где проводят работу с микроорганизмами или подготовку к ней. Поверхность столов и пол всех лабораторных помещений покрывают легко моющимся материалом. В основном рабочем помещении находятся аппаратура, посу-да и реактивы. Столы имеют подводку электроэнергии и снабжены газо-выми горелками. Кроме основного рабочего помещения лаборатория имеет стерилизационную, где размещены автоклавы и сушильные шкафы, бокс, моечную, холодильную комнату, термостаты или термостатированные комнаты для выращивания микроорганизмов, помещение для хранения культур и т.д.

Подготовка микробиологической лаборатории к работе

Для того чтобы снизить количество микроорганизмов в воздухе и на различных поверхностях, в лабораторных помещениях применяют различные способы дезинфекции. Слово «дезинфекция» означает обеззараживание, то есть уничтожение возбудителей инфекционных болезней на объектах внешней среды.

Пол, стены и мебель в микробиологической лаборатории протирают растворами различных дезинфицирующих веществ, в качестве которых чаще всего используют 2 - 3%-ный раствор соды (бикарбоната натрия), 3 - 5%-ный раствор фенола (карболовой кислоты) или лизола (препарат фенола с добавлением зеленого мыла), 0,5 - 3%-ный водный раствор хлорамина и некоторые другие дезинфектанты.

Воздух в лаборатории наиболее просто дезинфицировать проветриванием. Продолжительная вентиляция помещения через форточку (не менее 30-60 мин) приводит к резкому снижению количества микроорганизмов в воздухе, особенно при значительной разнице в температуре между наружным воздухом и воздухом помещения. Более эффективный и наиболее часто применяемый способ дезинфекции воздуха - облучение ультрафиолетовыми лучами с длиной волны от 200 до 400 нм. Ультрафиолетовые лучи обладают слабой проникающей способностью, поэтому в зависимости от степени загрязненности воздуха для его стерилизации требуется облучение от 30 мин до нескольких часов. Необходимо иметь в виду, что ультрафиолетовые лучи могут вызвать тяжелые поражения глаз. Поэтому при работе с бактерицидными лампами нужно строго следить за тем, чтобы ни прямые, ни отраженные ультрафиолетовые лучи не попадали в глаза. В небольших помещениях при включенной бактерицидной лампе находиться нельзя.

Рабочее место, где непосредственно проводится работа с культурами микроорганизмов, требует особенно тщательной обработки. Рабочий стол следует дезинфицировать не только до начала работы, но и после ее окончания. Для протирания поверхности стола можно использовать растворы лизола и хлорамина, а также 70%-ные (по объему) растворы изопропилового или этилового спиртов. В лаборатории не разрешается курить, хранить и употреблять еду, напитки, жевательную резинку. Работать следует в халатах.

Правила работы с культурами микроорганизмов

В лаборатории микроорганизмы выращивают в питательных средах, которые разливают в пробирки, колбы, матрацы и чашки Петри. Внесение микроорганизмов в стерильную среду называется посевом, или инокуляцией. Перед посевом следует тщательно надписать на пробирке (колбе или чашке Петри) название микроорганизма и дату посева. Надпись делают маркером на стекле или на наклеенной этикетке. Клетки микроорганизмов для посева или приготовления препаратов берут бактериологической петлей, если микроорганизмы выращены на плотной среде. В том случае, когда пересевают культуры микроорганизмов, выросшие в жидкой питательной среде, пользуются стерильной пипеткой. Использованную пипетку следует немедленно перенести в дезинфицирующий раствор, например 3 - 5%-ный водный раствор фенола или 2%-ный раствор хлорамина, не касаясь ею окружающих предметов.

Все манипуляции при посеве следует проводить около пламени горелки (но не в пламени). Нельзя делать резкие движения и ходить около лица, работающего с чистой культурой, так как движение воздуха увеличивает вероятность случайного ее загрязнения.

Методы стерилизации питательных сред и посуды

Стерилизация является одним из важнейших и необходимых приемов в микробиологической практике. Слово «стерилизация» в переводе с латинского означает обеспложивание. В практической работе под стерилизацией понимают методы, применяемые для уничтожения всех форм жизни как на поверхности, так и внутри стерилизуемых объектов. Различают термическую и холодную стерилизацию. Способы термической стерилизации: прокаливание в пламени и обжигание, сухожаровая стерилизация (горячим воздухом), стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование), дробная стерилизация (тиндализация), кипячение. Методы холодной стерилизации: стерилизация фильтрованием, газообразными средствами, ультрафиолетовыми лучами и другими видами излучений.

Возможность и целесообразность применения того или иного способа определяется в первую очередь физико-химическими свойствами материала, подлежащего стерилизации, а иногда и целью исследования.

Стерилизация питательных сред насыщенным паром под давле-ием (автоклавирование)

Совместное действие высокой температуры и давления пара обеспечивает особую эффективность данного способа (табл. 3).

Таблица 3

Температура насыщенного пара при разных давлениях

Давление	Температура,
	°С
нормальное, атм		кПа
1,0		101,32	100
1,5		151,98	111
2,0		202,65	121
2,5		251,20	128
3,0		299,75	134

При этом погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Установлено, что споры большинства микроорганизмов не выдерживают и 5-минутную экспозицию в насыщенном паре при 121 °С. Стерилизацию текучим паром под давлением осуществляют в автоклавах. Автоклав представляет собой металлический двустенный резервуар, способный выдерживать высокое давление, в который помещают стерилизуемый материал на специальную подставку. Предметы следует размещать не слишком плотно, так как пар должен проходить между ними, иначе они не нагреваются до нужной температуры и могут остаться нестерильными. По окончании времени стерилизации автоклав открывают, когда давление в нем сравняется с атмосферным. Преждевременное открывание крана автоклава недопустимо, так как перегретые среды при резком снижении давления сразу же бурно закипают, смачивают и даже иногда выталкивают ватные пробки, что нарушает впоследствии стерильность материала.

К работе с автоклавом допускаются только подготовленные лица!

Подготовка сред к стерилизации. При автоклавировании 3 - 5 % жидкости теряются в результате испарения, поэтому рекомендуется в приготавливаемые среды добавлять сверх объема примерно 5% дистиллированной воды. Тогда после стерилизации среда (раствор) будет иметь требуемую концентрацию. Среды обычно стерилизуют в пробирках, колбах, бутылях. Емкости заполняют средой не более чем на половину их высоты, чтобы предотвратить смачивание пробок. Сосуды со средами закрывают ватными пробками с бумажными колпачками. Стеклянные, резиновые, корковые и другие пробки завертывают в двойной слой оберточной бумаги и стерилизуют привязанными к склянке, закрытой ватной пробкой.

Выбор режима автоклавирования. В микробиологической практике стерилизацию в автоклавах осуществляют при температуре в пределах 111-138 °С, т.е. от 0,5 до 2,5 атм. Температура ниже 111 °С не может считаться надежной; а выше 138 0С, как правило, не является необходимой, к тому же, чем выше давление пара, тем сложнее условия эксплуатации автоклава. Микробиологи чаще всего стерилизуют среды при 0,5 и 1 атм.

Температура и длительность автоклавирования питательных сред определяются, прежде всего, их составом, термоустойчивостью или термолабильностью компонентов. Такие легко разрушающиеся субстраты, как молоко или желатиновые среды, а также субстраты, содержащие сахара, витамины (пивное сусло, соки, дрожжевой автолизат и др.) обычно стерилизуют при 0,5 атм в течение 1 5 - 3 0 мин. Мясопептонные среды можно стерилизовать при 1,0 атм 20 мин. С трудом поддаются стерилизации в автоклаве различные порошки (например, тальк) и вязкие жидкости (глицерин, вазелиновое масло), поэтому их лучше стерилизовать в сушильных шкафах при 160 °С в течение 2 или 1 ч при 170 °С. В этом случае слой масла или порошка в сосуде не должен превышать 1,5 см. После автоклавирования среды для проверки стерильности выдерживают 2 - 3 сут в термостате при 30 0С. Если в средах обнаруживается рост микроорганизмов, их готовят заново.

Дробная стерилизация (тиндализация) и пастеризация

Тиндализация, дробная стерилизация, была предложена в 1877 г. Тиндалем. Она применяется для сред, портящихся под действием температур выше 100 °С. Тиндализацию осуществляют текучим паром, а автоклаве снезавинченной крышкой или в аппарате Коха. Среды прогревают несколько раз по 10 - 15 мин. Между прогреваниями среды ставят в термостат при температуре 3 0 0 С н а 8 - 1 2 ч для прорастания жизнеспособных спор. Среды, не выдерживающие нагревания при 100 °С, прогревают более осторожно при 60 - 80 °С через каждые 8 - 1 2 ч 4 - 5 дней подряд.

Однократный прогрев материала при температуре ниже 100 0С известен под названием пастеризация. Этот метод, предложенный Пастером, предназначен для уничтожения только бесспоровых форм микроорганизмов. Следовательно, в подавляющем большинстве случаев он не обеспечивает стерильности. Пастеризацию проводят при 60-80 0С 10 - 30 мин. Этот процесс используют в пищевой промышленности для обработки молока, фруктовых соков, вина, пива и др.

Стерилизация фильтрованием

Фильтрованием стерилизуют синтетические среды строго определенного состава, которые содержат легкоразрушающиеся или летучие компоненты - витамины, аминокислоты (цистеин и цистин), белки, углеводы, антибиотики и др. Фильтрование жидкостей осуществляют через мелкопористые материалы, легко адсорбирующие клетки микроорганизмов: асбест, целлюлозу, фарфор, каолин и др.

Стерилизующими фильтрами теоретически считают такие, размер пор которых не превышает 0,20 мкм. Наиболее широкое распространение в микробиологической практике получили мембранные фильтры, которые в зависимости от величины пор применяют для фильтрования и стерилизации. Для стерилизации используют отечественные фильтры фирм «Влади-пор», «Владисарт» с диаметром пор 0,20 мкм.

Плотные диски, изготовленные из смеси асбеста с целлюлозой, называются фильтрами Зейтца. В зависимости от диаметра пор они обозначаются разными индексами. Стерилизующими являются СФ-3 и СФ-4.

Мембранные фильтры стерилизуют автоклавированием при 1 атм 15 мин или длительным кипячением.

Стерилизация стеклянной посуды. Основным способом стерилизации стеклянной посуды является обработка ее сухим горячим воздухом при температуре не выше 180 ° в течение 1 - 3 ч (табл. 4). При этом погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов.

Стерилизацию осуществляют в специальных суховоздушных (сухо-жаровых) стерилизаторах и сушильных шкафах, приспособленных для стерилизации и обеспечивающих автоматическое поддержание необходимой температуры.

Таблица 4

Время, необходимое для стерилизации стеклянной посуды сухим жаром

Температура, °С	Время, мин
140	180
150	150
160	120
170	60

Посуда перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта и завернута в бумагу для сохранения стерильности после прогревания. После этого е? загружают в стерилизатор (или в сушильный шкаф) не слишком плотно, чтобы обеспечить циркуляцию воздуха и равномерный надежный прогрев стерилизуемого материала. По окончании стерилизации шкаф не открывают до тех пор, пока температура в нем не упадет до 80 °С, так как при резком охлаждении иногда нарушается стерильность материала, а сильно нагретое стекло может растрескаться.

Стерилизация инструментов и приборов. Мелкие металлические инструменты - петли, иглы, пинцеты, ножницы, шпатели - стерилизуют прокаливанием в пламени (т.е. нагреванием докрасна) непосредственно перед использованием. На пламени кратковременно обжигают предметные и покровные стекла, стеклянные шпатели и палочки, фарфоровые ступки и пестики, горлышки колб, пробирок, бутылок, а также ватные пробки при посевах культур и разливе сред. В пламени погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов.

Шприцы лучше всего стерилизовать сухим жаром при 160 0С либо в собранном, либо в разобранном виде. В первом случае длительность стерилизации 75, во втором - 60 мин. Собранные шприцы вместе с иглой стерилизуют в пробирке, закрытой ватной пробкой, разобранные заворачивают в бумагу или ткань. Можно стерилизовать шприцы и в автоклаве при 1 атм в течение 15-20 мин. Автоклавируют их только в разобранном виде, иначе они повреждаются.

Стерилизация газообразными веществами. Аппаратуру, имеющую зеркальное, оптическое и радиоэлектронное оборудование, а также изделия из термолабильных пластмасс, например центрифужные пробирки, стерилизуют газовым методом. Для газовой стерилизации применяются только те соединения, которые обладают спороцидными свойствами. Это оксид этилена, метилбромид, оксид пропилена, формальдегид, глютаральдегид, бета-пропиолактон, озон и др. Газовую стерилизацию проводят в специальных герметически закрывающихся аппаратах. Стерилизуемые объекты, помещаемые в камеру, упаковывают как при стерилизации в автоклаве или сушильном шкафу. При проведении газовой стерилизации строго соблюдают правила работы с ядовитыми газообразными веществами.

Стерилизация облучением

Для стерилизации помещений, оборудования, некоторых медицинских принадлежностей, пищевых продуктов используют различные виды излучений: инфракрасное, ультрафиолетовое, рентгеновские лучи, а-, Р- и у-лучи радиоактивных элементов. Чаще других в микробиологической практике используют ультрафиолетовое облучение. Мощность ультрафиолета измеряется в бактах. Доза УФ-излучения, губительная для различных видов микроорганизмов (кроме спор), составляет 5 мкб/см2.

11.2 Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций подразделяются на несколько больших групп.

Прямые методы, состоящие в выявлении непосредственно в биологическом материале самого вируса или антител к нему.

Непрямые методы-заключаются в искусственной наработке вируса в значительных количествах, и его дальнейшем анализе.

К наиболее актуальным в повседневной практике методам диагностики относятся:

Серологические методы диагностики - выявление в сыворотке крови пациента определенных антител или антигенов в результате реакции антиген-антитело (АГ-АТ). То есть, при поиске у пациента определенного антигена используется соответствующее искусственно синтезированное антитело, и, соответственно, наоборот-при выявлении антител используют синтезированные антигены.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) изображена на рисунке 12.



Рисунок 12 Схема реакции иммунофлюоресценции

Основана на использовании меченых красителями антител. При наличии вирусного антигена он связывается с мечеными антителами, и под микроскопом наблюдается специфическая окраска, которая говорит о положительном результате. При этом методе, к сожалению, невозможна количественная интерпретация результата, а только лишь качественная.

Возможность количественного определения дает иммуноферментный анализ(ИФА). Он похож на РИФ, однако в качестве маркеров используют не красители, а ферменты, превращающие бесцветные субстраты в окрашенные продукты, что и дает возможность количественной оценки содержания как антигенов, так и антител (рис.13).

Рисунок 13 Иммуноферментный анализ

Отмывают не связавшиеся антитела и антигены.

Добавляют бесцветный субстрат, и в лунках с антигеном, который мы определяем, произойдет окрашивание, т.к. там будет связанный с антигеном фермент, после чего на специальном приборе оценивают интенсивность свечения окрашенного продукта.

По похожей схеме происходит и выявление антител (рис.14).

Рисунок 14 Прямой твердофазный ИФА

Реакция непрямой(пассивной) гемаглютинации (РПГА) (рис.15).

Метод основан на способности вирусов связывать эритроциты. В норме эритроциты падают на дно планшета, образуя так называемую пуговку. Однако если в исследуемом биологическом материале находится вирус, он свяжет эритроциты в так называемый зонтик, который не упадет на дно лунки.

Рисунок 15 Реакция непрямой(пассивной) гемаглютинации

Если стоит задача выявления антител, то сделать это возможно при помощи реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В лунку с вирусом и эритроцитами закапывают различные пробы. При наличии антител они свяжут вирус, и эритроциты упадут на дно с образованием «пуговки» (рис.16).

Рисунок 16 Выявление антител, то сделать это возможно при помощи реакции торможения гемагглютинации

Теперь остановимся на методах диагностики непосредственно нуклеиновых кислот исследуемых вирусов, и прежде всего о ПЦР ( Полимеразная Цепная Реакция).

Суть этого метода заключается в обнаружении специфического фрагмента ДНК или РНК вируса путём его многократного копирования в искусственных условиях. ПЦР можно проводить только с ДНК, то есть для РНК-вирусов предварительно необходимо произвести реакцию обратной транскрипции.

Непосредственно ПЦР проводят в специальном приборе, под названием амплификатор, или термоциклер, который поддерживает необходимый температурный режим. ПЦР-смесь состоит из добавленной ДНК, которая содержит интересующий нас фрагмент, праймеров (короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, комплиментарный ДНК-мишени, служит затравкой для синтеза комплиментарной цепи), ДНК-полимеразы и нуклеотидов.

Стадии цикла ПЦР:

Деннатурация-первая стадия. Температура повышается до 95 градусов, цепочки ДНК расходятся друг относительно друга.

Отжиг праймеров. Температуру понижают до 50-60 градусов. Праймеры находят комплиментарный участок цепи и связываются с ним.

Синтез. Температуру вновь повышают до 72, это рабочая температура для ДНК-полимеразы, которая, отталкиваясь от праймеров, строит дочерние цепи (рис.17).

Рисунок 17 Полимеразная цепная реакция

Цикл многократно повторяется. Через 40 циклов из одной молекулы ДНК получается 10*12 степени копий искомого фрагмента (рис.18).



Рисунок 18 Получение 10*12 степени копий искомого фрагмента ДНК

При проведении ПЦР в режиме реального времени синтезируемые копии фрагмента ДНК метятся красителем. Прибор регистрирует интенсивность свечения и по ходу реакции строит графики накопления искомого фрагмента.

Современные методы лабораторной диагностики с высокой достоверностью позволяют выявить присутствие вируса - возбудителя в организме, нередко, задолго до появления первых симптомов заболевания.

11.3 Основные методы лабораторной работы при работе с бактериями

Бактериоскопический (микроскопический) метод - совокупность способов обнаружения и изучения морфологических и тинкториальных свойств бактерий (микробов) в лабораторной культуре, патологическом материале или пробах из внешней среды с помощью микроскопии. Применяют для установления диагноза инфекционного заболевания или иного вызванного микробами процесса, а также при идентификации выделенной чистойкультуры. Метод бактериоскопического исследования приобретает особое значение, если микроб имеет морфологические и тинкториальные особенности или особую локализацию в тканях, клетках организма. Только при некоторых инфекциях для постановки диагноза достаточно морфологического исследования.

Для диагностики большинства инфекций микроскопия, как первый этап микробиологического исследования, имеет лишь вспомогательное, ориентировочное значение.

Ценность бактериоскопического метода состоит в простоте, доступности методик и быстроте получения результатов (30-60 минут и менее). Однако специфичность его в связи с близостью морфологии разных видов мала, а чувствительность ограничена -разрешающая способность метода составляет в среднем 100 000 клеток в мл.

Микроскопические методы заключаются в приготовлении микроскопических препаратов для микроскопирования (нативных или окрашенных простыми и сложными способами) из исследуемого материала и их микроскопирование с применениемразличных видов микроскопической техники (световая, темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная. электронная). В большинстве случаев результатымикроскопических исследований носят ориентировочный характер. Тем не менее, микроскопией материала можно определить некоторые морфологические признаки возбудителей (наличие ядер, жгутиков, внутриклеточных включений и т.д.), а также установить факт наличия или отсутствия микроорганизмов в присланных образцах.

Классическое бактериологическое (вирусологическое, микологическое) исследование (называемое «золотым стандартом» микробиологической диагностики). Его целью является выделение и идентификация возбудителя.

Алгоритм бактериологического (вирусологического, микологического) исследования складывается из следующих основных этапов:

1) первичная микроскопия (необязательный);

2) первичный посев для выделения чистой культуры;

3) накопление чистой культуры;

4) изучение комплекса биологических свойств выделенной культуры и ее идентификация. Идентификацию чистых культур (до вида микроорганизма) проводят с учётом морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, токсигенных и антигенных свойств микроорганизма. Большинство исследований включает определение чувствительности к антимикробным препаратам у выделенного возбудителя. Для эпидемиологической оценки роли микроорганизма проводят внутривидовую идентификацию определением фаговаров, биоваров, резистентваров и т.д.

Классическое микробиологическое исследование имеет ряд недостатков. Прежде всего, это достаточно длительный процесс. Его минимальный срок 3-4 дня, но могут пройти многие дни и даже недели, прежде чем выделенный возбудитель будет точно идентифицирован. Для некоторых патогенных бактерий (холерного вибриона, дифтерийных бактерий) разработаны ускоренные методы выделения и идентификации, но и они позволяют получить ответ не ранее 36-48 часов.

Задача микробиологических исследований -- выделить из исследуемого материала микроорганизмы и идентифицировать, то есть определить их видовую принадлежность.

Основой микробиологических исследований является бактериологический метод диагностики, суть которого - выделение микроорганизмов в чистой культуре и их идентификация.

Для идентификации микроорганизмов изучают следующие свойства:

1. Морфологические

2. Тинкториальные

3. Культуральные

4. Биохимические

5. Патогенные: ферменты патогенности - лецитиназа, плазмакоагулаза и пр.; токсигенность - способность продуцировать экзотоксины (дифтерийная палочка, золотистый стафилококк) (подробно вопрос был рассмотрен в предыдущем семестре, см. тему «Инфекция. Патогенность и вирулентность микроорганизмов»)

6. Антигенные (серологические) (подробно вопрос был рассмотрен в темах раздела «Иммунтет», см. предыдущий семестр)

7. Фаголизабельность - способность лизироваться бактериофагами (вирусами бактерий): чувствительность к лечебным фагам (для лечения инфе ционного заболевания) и чувствительность к диагностическим фагам (в довым, типовым); фаготипирование - определение чувствительности к типовым фагам, проводится с целью определения источника и путей распространения микроорганизмов в окружающей среде или среди коллектива(подробно вопрос был рассмотрен в теме «Бактериофагия», см. соответствующую тему)

8. Бактерициночувствительность и бактериоциногения: проводиться с целью определения источника и путей распространения микроорганизмов вокружающей среде или среди коллектива (см. тему «Генетика бактерий»)

9. Чувствительность к антимикробным препаратам: антибиотикам, химиотерапевтическим препаратам и антисептикам (для лечения инфекционного заболевания, тема «Антибиотики»), дезинфектантам (для выбора режима дезинфекции, см. тему «Асептика, антисептика. Дезинфекция, стерилизация»).

Основной недостаток бактериологического метода -- длительность исследования -- от 3 до 5 суток, а в отдельных случаях и более.

Результаты многих диагностических исследований на предмет обнаружения возбудителей в значительной степени зависят от их вида, а также от времени и способа взятия патологического материала. Характер материала определяется клиническими особенностями заболевания: это должны быть те субстраты или биологические жидкости, в которых на данной стадии заболевания наиболее вероятно присутствие возбудителей. Успех проведения бактериологического метода во многом зависит от предварительного этапа, включающего забор исследуемого материала и его транспортировку, оформление направления в бактериологическую лабораторию.

Биологические методы

Биологические методы направлены на определение наличия токсинов возбудителя в исследуемом материале и на обнаружение возбудителя (особенно при незначительном исходном содержании в исследуемом образце или когда возбудитель не может быть обнаружен методом посева, - например, при вирусных и риккетсиозных заболедваниях).

Животных заражают для выделения чистой культуры возбудителя в тех случаях, когда нельзя получить ее другими способами (например, при загрязнении исследуемых объектов посторонней микрофлорой, подавляющей рост возбудителя; при незначительном содержании микроорганизмов или переходе их в фильтрующиеся формы).

Методы включают заражение чувствительных лабораторных животных (чувствительных к предполагаемому возбудителю) исследуемым материалом споследующим выделением чистой культуры патогена либо установлением фактаприсутствия микробного токсина и его природы, либо воспроизводят характернуюклиническую картину.

Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных животных -- важный инструмент изучения патогенеза заболевания и характера взаимодействий внутрисистемы микроорганизм--макроорганизм. Для проведения биологических пробиспользуют только здоровых животных определённых массы тела и возраста.

Инфекционный материал вводят внутрь, в дыхательные пути, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно и подкожно, в переднюю камеру глаза, черезтрепанационное отверстие черепа, субокципитально (в большую цистерну головногомозга). У животных прижизненно забирают кровь, экссудат из брюшины, после гибели --кровь, кусочки различных органов, СМЖ, экссудат из различных полостей.

Недостатки:

а) необходимость содержания вивария;

б) длительность проведенияисследования.

Кроме того, даже при лабораторном заражении далеко не всегда удается выделить возбудителя, что особенно характерно для вирусных инфекций.

СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ метод заключается в определении титра специфических антител в сыворотке больного. Для его реализации используют различные реакции иммунитета, как простые (агглютинация и ее разновидности), так и сложные (РСК, ИФА и др.).

Классическая серодиагностика основана на:

1). Определении антител к возбудителю в диагностическом титре;

2). Обнаружение в исследуемой сыворотке крови антител к возбудителю ряда инфекционных болезней недостаточно для постановки диагноза, поскольку оно может отражать наличие постинфекционного или поствакцинального иммунитета. Именно поэтому исследуют парные сыворотки больного, взятые в первые дни болезни и через 7-10 дней (иногда этот интервал может быть более длительным). В этом случае оценивают нарастание титра антител. Нарастание титра антител в 4 раза и более свидетельствуетоб инфекционной природе антител.

3). При экзотических инфекционных болезнях, а также при гепатитах, ВИЧ- инфекции и при некоторых других заболеваниях сам факт определения антител свидетельствует об инфицированности пациента и имеет диагностическое значение.

Серологический метод диагностики применяют с конца первой-начала второй недели заболевания.

Для обнаружения антитела к исследуемой сыворотке прибавляют известный антиген. Эти препараты, называемые диагностикумами, представлят собой взвесь убитых микроорганизмов (их отдельных антигенов) или эритроцитов (частиц латекса), на которых адсорбированы микроорганизмы или их антигены.

Собственно иммунный метод диагностики

Собственно-иммунный метод (экспресс)

Цель: поиск антигенов микробов в патологическом материале с помощью серологических иммунных реакций (см. реакции в приложении 6 в разделе 4).

Реакции иммунитета

Серологическими называют реакции иммунитета между антигенами (АГ) и антителами (AT). Детерминанта АГ связывается с активным центром AT. Соединение АГ и AT осуществляется посредством водородных и гидрофобных связей, взаимодействия ионов, кулоновских и ван-дер-вальсовых сил. Прочность соединения АГ с AT обеспечивается не только силами связывания, но и оптимальной адаптацией активного центра AT к АГ-детерминанте. Серологические реакции протекают в две фазы. Первая -- специфическая невидимая -- заключается во взаимодействии АГ с AT. Вторая фаза -- видимая -- проявляется в зависимости от типа реакции, который определяется свойствами АГ, AT и другими ингредиентами реакций. Различают несколько типов реакций: агглютинация, преципитация (иммунная диффузия), лизис, нейтрализация и др.

Реакция агглютинации

В реакции агглютинации (РА) антиген участвует в виде корпускулярной частицы. Это могут быть суспензии микроорганизмов, клеток организма, например эритроцитов.

При смешивании со специфической антисывороткой происходит склеивание и оседание визуально различимых хлопьев -- иммунных комплексов.

Реакцию агглютинации можно ставить качественно -- на стекле и количественно -- в пробирках, где готовятся разведения сыворотки.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) является своеобразной модификацией РА.

Сущность ее состоит в том, что молекулы антигена адсорбируются на поверхности эритроцитов (после обработки эритроцитов танином или формалином). Такие «нагруженные» АГ эритроциты приобретают способность агглютинироваться иммунной сывороткой, специфичной для данного АГ.

Образование комплекса АГ--AT влечет за собой и склеивание эритроцитов (на дне лунки или пробирки образуется гемагглютинат в виде «перевернутого зонтика»), что легко учитывать. Таким образом, эритроциты не участвуют непосредственно в образовании комплекса АГ--AT, но служат его индикаторами.

РНГА более чувствительна, чем РА.

Реакция Кумбса

Это тест на выявление неполных антител, которые сами не могут агглютинировать антигены, но способны к ним присоединяться. Реакцию проводят поэтапно: к сыворотке крови обследуемого добавляют эритроцитарный диагностикум -- известные антигены, адсорбированные на эритроцитах. После инкубации эритроциты отмывают и добавляют кроличьи AT против человеческих глобулинов. В результате антиглобулиновая сыворотка склеивает эритроциты через образовавшиеся на них комплексы АГ--AT.

Существуют две разновидности реакции Кумбса: прямой и непрямой:

* Прямой метод: выявление антирезусных антител, адсорбированных на эритроцитах новорождённого.

Кровь берут у новорождённого, отмывают эритроциты, добавляют к ним антиглобулиновые антитела: реализуется феномен «решётки» - происходит видимая глазом агглютинация эритроцитов

Непрямой метод: выявление антирезусных анител в сыворотке матери.

1. В пробирку с материнской сывороткой вносят стандартные резус-положительные эритроциты. На эритроцитах адсорбируются антирезусные антитела сыворотки матери.

2.Вносят в пробирку антиглобулиновую сыворотку (антиглобулиновые антитела): реализуется феномен «решётки» - происходит видимая глазом агглютинация эритроцитов

Реакция преципитации

В реакции преципитации (РП) участвует мелкодисперсный (растворимый антиген). При контакте с антителами -- преципитинами образуется осадок.

Реакцию преципитации можно проводить в жидкой среде (в узких пробирках) и в геле (в чашках Петри). При постановке РП в узких пробирках жидкость, содержащую один из реагентов, например, прозрачный экстракт из микробных клеток (0,2 мл), наслаивают на прозрачную преципитирующую сыворотку (0,2 мл). В положительных случаях на границе соприкосновения жидкостей через 1--5 минут образуется серо-белое кольцо. РП, как и РА, идет в электролите, но отличается более высокой чувствительностью.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Прямая (метод Кунса). Микроорганизмы, обработанные антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в люминесцентном микроскопе.

Непрямая. На первом этапе микроорганизмы взаимодействуют со специф ческой сывороткой. Далее воздействуют на образовавшийся иммунный комплекс антиглобулиновой сывороткой, меченной флюорохромом. Иммунный комплекс с помощью этого конъюгата светится в люминесцентном микроскопе.

Реакция связывания комплемента (РСК)

Это реакция лизиса антигена (например, цитолиза, бактериолиза) под действием антител с участием комплемента. Если антиген - это бактериальная клетка или вирус, то лизис не сопровождается видимыми проявлениями. Поэтому, чтобы обнаружить наличие комплекса АГ + AT + комплемент в опытной системе, где неизвестен один из компонентов (АГ или AT), используют индикаторную систему АГ + AT, где оба компонента известны и лизис антигена хорошо проявляется, так как в качестве АГ берут эритроциты. Реакция основана на способности комплемента -- комплексной системы белков нормальной сыворотки позвоночных -- фиксироваться на комплексе АГ--AT и последующем лизисе антигена. В РСК участвуют пять компонентов: АГ--AT опытной системы, в которой один из реагентов неизвестен, комплемента и индикаторной системы.

Индикаторная -- гемолитическая система состоит из взвеси эритроцитов барана и гемолитической сыворотки кролика, полученной путем его иммунизации эритроцитами барана. Если АГ и AT в опытной системе соответствуют друг другу, то результатом этого взаимодействия является связывание комплемента. Индикаторная система выявляет свободный, несвязавшийся комплемент. Если комплемент остался свободным, то он свяжется с комплексом эритроциты -- гемолитическая сыворотка и будет лизировать эритроциты. Таким образом, наличие гемолиза означает отрицательный результат РСК, а отсутствие гемолиза -- положительный результат.

Иммуноферментный метод

Высокочувствительный метод выявления АГ или AT на основе реакции АГ--AT с применением меченных ферментами АГ или AT.

Принципиальная схема иммуноферментного анализа для выявления AT следующая. Известный АГ (вирус, белок) -- диагностикум -- фиксируется на твердой фазе. К нему добавляют сыворотку обследуемого с неизвестными AT. После инкубации и промывки на антигене остаются специфичные к нему AT, если таковые имелись в сыворотке обследуемого. Для обнаружения комплекса АГ--AT к нему добавляют кроличью антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом (АГС-Ф). Для получения данной сыворотки иммунизируют кролика глобулинами человека. Полученную от кролика сыворотку метят каким-либо ферментом, например, пероксидазой хрена. Если в исследуемой сыворотке есть AT к АГ (диагностикум), то они будут служить антигеном для антиглобулиновой сыворотки. После второй промывки образовавшийся комплекс АГ + AT + АГС-Ф можно обнаружить, добавив субстрат к ферменту и индикатор на продукты расщепления субстрата. Изменение цвета индикатора свидетельствует о наличии искомых AT в сыворотке обследуемого.

Аллергический метод диагностики

При многихинфекционных заболеваниях развивается состояние повышенной чувствительностик повторному введению возбудителя или продуктов его жизнедеятельности. Такое состояние, называемое инфекционной аллергией, характерно для туберкулеза,туляремии, бруцеллеза, сапа, сифилиса, сибирской язвы, токсоплазмоза, паротита, простого герпеса и ряда других инфекций.

Для выявления инфекционной аллергии применяют аллергическиедиагностические пробы, для чего строго внутрикожно вводят соответствующий аллерген. Наличие гиперемии и инфильтрата указывает на положительный результат реакции, т. е. на наличие инфекционной аллергии.

Аллергический метод диагностики основан на аллергической реакции - реакциигиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).

В основе формирования реакции ГЗТ лежит не гуморальный, а клеточныйиммунный ответ организма на первый (сенсибилизирующий) контакт с определеннымантигеном. Сенсибилизация связана с преимущественной пролиферацией Т-лимфоцитов,несущих специфические для данного аллергена рецепторы. После этого в организменадолго сохраняется размножившийся клон сенсибилизированных Т-лимфоцитов,который вступает в реакцию с конкретным аллергеном при его повторном попадании ворганизм.

Выявление клеточного иммунного ответа - гиперчувствительности замедленноготипа (ГЗТ), схема

* Введение внутрикожно Аг бактерий

* Через 48 - 72 часа появляется воспаление

* Измеряют величину покраснения и папулы

* Аг Тх выделяют лимфокиныактивация Тцтл активация фагоцитоввоспаление

В реакциях ГЗТ участвуют: Т-хелперы (стимулируют образование Т-эффекторовчерез ИЛ-2) > Т-эффекторы (продуцируют лимфокины - хемоаттрактанты и привлекаютмакрофаги в очаг воспаления) > макрофаги (продуцируют медиаторы-монокины) >мононуклеарный инфильтрат на месте введения аллергена > величина инфильтратазависит от степени сенсибилизации организма и достигает максимума через 24-48 ч

Аллергические диагностические пробы позволяют диагностировать туберкулез (реакция Манту), бруцеллез (проба Бюрне), туляремию (проба с тулярином), сибирскую язву (проба с антраксином), мягкий шанкр (реакция Дюкрея), проказу (реакция Мицуды), а последняя - даже дифференцировать туберкулоидную (лепромин-положительную) форму от лепроматозной (лепромин-отрицательной).

Положительная кожная аллергическая проба указывает, что введение аллергена при постановке пробы является повторным, т. е. индивидуум в прошлом имел контакт с микробным агентом. Здесь сказывается основной недостаток диагностической ценности кожно-аллергических проб, так как они могут быть положительными не только у инфицированных, но и у привитых против этих болезней, а также у лиц, переболевших много лет назад, в том числе и у носителей, т. е. положительный тест у здоровых лиц указывает только на контакт с микробным антигеном.

При определении природы заболевания истинное диагностическое значение имеет только переход от отрицательной кожной пробы к положительной, который наблюдается в течение болезни. Кроме того, вираж реакции, т. е. увеличение выраженности ее проявления при повторном исследовании, также служит основанием для более детального обследования на инфицированность данным возбудителем.

При приеме некоторых препаратов кортикостероидных гормонов, иммунодепрессантов, а также при некоторых заболеваниях (саркоидозе, болезниХоджкина и отдельных опухолях) учет результатов постановки аллергических проб затруднен, потому что в этих случаях наблюдается так называемая анергия, т. е. значительное снижение общей кожной реактивности.

Более того, при появлении сыпи у детей, когда ребенок переносит одно из таких заболеваний, как корь, ветряная оспа, также может иметь место анергия, и в этот период при постановке пробы Манту туберкулиноположительный ребенок может стать временно туберкулиноотрицательным, т. е. получается ложноотрицательный результат.



12. Особо опасные и вирусные инфекции

Особо опасные инфекции (ООИ) или инфекционные заболевания -- болезни, которым свойственна высокая степень заражаемости. Они внезапно появляются и быстро распространяются, отличаются тяжелой клинической картиной и высокой степенью летальности.

К особо опасным инфекциям относят условную группу острых заразных болезней человека, которые соответствуют двум характеристикам:

- могут появиться внезапно, быстро и массово распространиться;

- тяжело протекают и предполагают высокую летальность.

Список ООИ впервые был представлен на 22-й сессии Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) 26 июля 1969 года. Помимо перечня, ассамблея также установила Международные медико-санитарные правила (ММСП). Они были обновлены в 2005 году на 58-й сессии ВОЗ. Согласно новым поправкам, ассамблея имеет права делать выводы о состоянии с теми или иными болезнями в стране и по официальным отчетам государства, и по сообщениям из СМИ.

31 декабря 2019 года власти Китая проинформировали Всемирную организацию здравоохранения о вспышке неизвестной пневмонии в городе Ухань в центральной части страны (провинция Хубэй). Специалисты установили, что возбудителем болезни стал новый коронавирус, позже заболевание получило официальное название COVID-19. ВОЗ 11 марта объявила пандемию нового коронавируса в мире.

Коронавирусная инфекция COVID-19 - потенциально тяжёлая острая респираторная инфекция, вызываемая коронавирусом SARS-CoV. Представляет собой опасное заболевание, которое может протекать как в форме острой респираторной вирусной инфекции лёгкого течения, так и в тяжёлой форме, специфические осложнения которой могут включать вирусную пневмонию, влекущую за собой острый респираторный дистресс-синдром или дыхательную недостаточность с риском смерти.

Против болезни пока отсутствуют какие-либо специфические противовирусные средства лечения или профилактики. В большинстве случаев (примерно в 80 %) какое-либо специфическое лечение не требуется, а выздоровление происходит само по себе. Тяжёлые формы болезни с большей вероятностью могут развиться у пожилых людей и у людей с определёнными заболеваниями, включающими астму, диабет и сердечные заболевания. В тяжёлых случаях применяются средства для поддержания функций жизненно важных органов.

Заболевание вызывается новым вирусом, у людей к нему нет приобретённого иммунитета, поэтому к инфекции восприимчивы люди всех возрастных категорий. Распространяется вирус воздушно-капельным путём через вдыхание распылённых в воздухе в процессе кашля или чихания капель с вирусом, а также через попадание вируса на поверхности с последующим занесением в глаза, нос или рот. К числу эффективных мер профилактики относится частое мытьё рук и соблюдение правил респираторной гигиены.

В январе 2020 года коронавирус COVID-19 внесен в перечень опасных заболеваний (Постановление Правительства РФ от 01.12.2004 N 715 (ред. от 31.01.2020) "Об утверждении перечня социально значимых заболеваний и перечня заболеваний, представляющих опасность для окружающих" (в редакции от 31.01.2020).

12.1 Особо опасные инфекции

Перечень особо опасных инфекций для России:

- Чума

- Холера

- Натуральная оспа

- Желтая лихорадка

- Сибирская язва

- Туляремия

Общие признаки особо опасных инфекций:

- Повышение температуры тела до 40 С и выше

- Озноб, резкая головная боль

- Покраснение лица

- Тошнота, рвота, боли в животе

- Сыпь, кровоизлияния

- Кровотечения из внутренних органов

- Увеличение лимфоузлов.

Чума - острое заразное заболевание

Заражение происходит через кожу либо в результате укуса блохи, либо при попадании палочек чумы в ранку при нарушении кожных покровов (разделка туш инфицированного животного, снятие шкуры). Наиболее частая форма чумы при заражении через кожу - бубонная. В этом случае возбудитель задерживается в ближайшем от места укуса лимфатическом узле, этот узел воспаляется, становится заметным, болезненным. Припухлость лимфатического узла называется бубоном.

Для предохранения себя от заражения чумой необходимо:

- Не располагаться на отдых вблизи нор грызунов

- Избегать контакта с больными, особенно остролихорадящими людьми

- При повышении температуры тела или увеличении лимфатических узлов немедленно обратиться к врачу.

Туляремия - основные источники инфекции для человека - водяные крысы, ондатры, зайцы, полевки, домовая мышь.

Заражение происходит при контакте с инфицированными грызунами (отлов, разделка туш, снятие шкурок) и водой, загрязненной выделениями грызунов. Возбудитель попадает в кровь человека через незащищенную кожу рук. На сельскохозяйственных работах - во время уборки урожая, при употреблении продуктов питания, к которым прикасались больные туляремией мыши, при употреблении в пищу недожаренного мяса. При употреблении загрязненной воды из открытых водоемов (например, в колодец могли попасть больные животные). При укусах кровососущими членистоногими (комары, слепни, клещи).

Как защититься?

1 - вакцинация. Проводится по эпидемическим показаниям.

2 - борьба с грызунами; защита продуктов питания при хранении; использование защитной одежды.

Источник инфекции - больные животные. Больные люди не заразны.

Сибирская язва - острое инфекционное заболевание с преимущественно контактным механизмом передачи возбудителя инфекции, сопровождающееся лихорадкой и развитием специфического поражения кожи в виде серозно-геморрагического воспаления с некрозом, отека.

Заболеваемость носит преимущественно профессиональный характер, единичные и групповые случаи регистрируются в сельской местности в летне-осенний период, но возможны в любое время года.

Источник инфекции - больные или павшие от сибирской язвы сельскохозяйственные животные. Инфекция передается через микротравмы, употребление продуктов, не прошедших термическую обработку, воздушно-пылевым путем, а также при укусах насекомыми (слепни).

Как защититься?

1. Специфическая профилактика по эпидемическим показаниям.

2. Вакцинация домашних животных.

3. Соблюдение правил захоронения павших животных и устройства скотомогильников;

4. Соблюдение правил техники безопасности при работе со скотом и животноводческим сырьем.

5. Мясо, молоко больных животных подлежат уничтожению, а шкуры, шерсть, щетины обеззараживаются.

6. Лица, подвергшиеся риску заражения, подлежат медицинскому наблюдению в течение 2 недель. Им проводится экстренная химиопрофилактика.

7. При подозрении на заболевание - экстренная госпитализация.

8. В помещении, где находился больной, проводится заключительная дезинфекция.

Холера - острое инфекционное заболевание, сопровождающееся поражением тонкого кишечника, с развитием поноса и рвоты. В результате развивается сильнейшее обезвоживание, влекущее за собой нарушение работы сердца, почек, печени. В случае неоказания медицинской помощи больному, смерть наступает в течение нескольких часов.

Заражение происходит через воду, пищевые продукты, предметы, руки, загрязненные холерными вибрионами.

Для предохранения себя и окружающих от заражения холерой необходимо:

- Перед выездом в страны, неблагополучные по холере пройти вакцинацию.

- Строго должны соблюдаться правила личной гигиены - мытье рук.

- Пищевые продукты должны быть защищены от мух.

- При появлении диареи - своевременно обратиться к врачу.

Натуральная оспа. Несмотря на прекращение передачи вируса от оспы от человека человеку и незначительную вероятность возврата оспы за счет инфицирования, например, в лаборатории, или в случае биотерроризма, информация об этой инфекции должна циркулировать в обществе.

Возбудитель инфекции передается контактным, воздушно-капельным путем, от здоровых носителей, способен сохранять жизнеспособность на одежде и постельном белье.

Симптомы: общая интоксикация, характерные высыпания, покрывающие кожу и слизистые. Больные, перенесшие оспу частичную или полную потерю зрения и практически во всех случаях оставшимися после язв рубцами.

1. Вакцинация против оспы

2. Не посещать места массового скопления людей, не заходить в помещения, где находятся остролихорадящие люди.

3. Немедленно обратиться к врачу при появлении недомогания, общей слабости, болей в горле, при повышении температуры.

Желтая лихорадка - это острое вирусное заболевание, передающееся комарами и характеризующееся тяжелыми изменениями со стороны крови, высокой температурой тела, поражением печени и почек.

При молниеносно протекающей форме болезни больной умирает через 3--4 дня.

Осложнения заболевания - гангрена конечностей, мягких тканей; сепсис (в случае присоединения вторичной инфекции).

Как защититься?

1. При выезде в страны, неблагополучные по заболеваниям желтой лихорадкой, сделать прививку, защищающую от заболевания в течение 10 лет. Вакцинация проводится за 30 дней до планируемой поездки

2. Предохранять себя от укусов комаров, защищать места отдыха сетками, плотной закрывать окна и двери.

Выезжая в страны, потенциально опасные по вероятности инфицирования особо опасными инфекциями, заранее уточняйте у туроператоров, в территориальных отделах Роспотребнадзора об эпидемической ситуации в месте, куда планируется поездка, обратитесь к врачу с целью проведения вакцинации перед выездом.

...