Микробиология и вирусология

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения темы студент должен знать морфологию и структуру грибов, актиномицетов, спирохет, микоплазм, риккетсий и хламидий, методы изучения этих групп микроорганизмов, уметь написать по-латыни названия патогенных представителей перечисленных групп микробов.

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала данной темы необходимо знать:

- структуру бактерий (для сравнения) - из предыдущих занятий;

- морфологию простейших (для сравнения) - из курса биологии.

Цель занятия

1. Отметить особенности строения и морфологии грибов, актиномицетов, спирохет, микоплазм, риккетсий и хламидий.

2. Познакомиться с методами изучения морфологии этих микроорганизмов.

План изучения темы

1. Морфология грибов, классификация, значение в медицине.

2. Морфология актиномицетов, патогенные представители.

3. Морфология спирохет, классификация, структура, патогенные представители.

4. Морфология микоплазм, риккетсий, хламидий; патогенные представители.

После изучения темы студент должен уметь

1. Дифференцировать основные группы изучаемых микроорганизмов по особенностям их строения в готовых микропрепаратах.

Контрольные вопросы

Положение грибов среди микроорганизмов. Особенности строения. Способы размножения. Сравните биологическую роль спор грибов и спор бактерий. Структура клеток. Классификация грибов. Патогенные представители. Морфология нитчатых грибов. Значение их в патологии человека. Морфологические особенности дрожжей. Значение дрожжей в природе и в производстве. Морфологические особенности дрожжеподобных грибов. К какому роду относятся? Сходство их с дрожжами и отличия. Виды дрожжеподобных грибов, их роль в патологии человека. Какой вид чаще всего вызывает заболевания? Способы изучения морфологии дрожжеподобных грибов. Дерматомицеты, их морфологические особенности; какие заболевания вызывают? Методы изучения морфологии. Опишите морфологию основных видов дерматомицетов в поражённом волосе. Актиномицеты - положение среди других микроорганизмов. Структура клетки, сходство с бактериями и отличия; способы размножения. Что образуют актиномицеты в пораженном органе? Каково строение этого образования? Значение актиномицетов в медицинской практике. Как называются заболевания, вызываемые актиномицетами? Патогенные представители. Морфология спирохет: положение спирохет среди микроорганизмов, их форма, структурные элементы, патогенные представители и нормальные обитатели организма человека. Методы изучения морфологии спирохет. Окраска по Романовскому-Гимза, её сущность, преимущества перед другими способами. Различия между тремя родами патогенных спирохет по морфологии и окраске по Романовскому-Гимза. Микоплазмы: их положение среди микроорганизмов, к какому классу относится, особенности морфологии и структуры, значение в патологии. Риккетсии: положение среди микроорганизмов; сходство с бактериями и вирусами. Морфологические типы риккетсий; способы окраски. Названия заболеваний, вызываемых риккетсиями, патогенные для человека представители. Хламидии: положение среди микроорганизмов, морфология, цикл размножения, патогенные представители.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Напишите по-латыни названия патогенных представителей микроскопических грибов, актиномицетов, спирохет, микоплазм, риккетсий, хламидий.

Работа студента на практическом занятии

1. Изучение морфологии микроскопических грибов. Приготовьте препарат из культуры дрожжеподобного гриба рода Candida, промикроскопируйте, найдите псевдомицелий, зарисуйте. Промикроскопируйте и зарисуйте препарат из культуры дрожжей в люминесцентном и фазово-контрастном микроскопах. Изучите по таблицам и зарисуйте морфологию нитчатых грибов.

2. Изучение морфологии актиномицетов. Промикроскопируйте и зарисуйте препарат из чистой культуры актиномицета. Промикроскопируйте и зарисуйте препарат друзы в поражённом органе; опишите в дневнике, чем отличается строение актиномицета в чистой культуре и в органе, чем объясняются эти различия.

3. Изучение морфологии спирохет. Промикроскопируйте и зарисуйте препарат - мазок крови больного возвратным тифом, окрашенный по Романовскому-Гимза. Промикроскопируйте и зарисуйте препарат - бледная трепонема в отделяемом твёрдого шанкра и в чистой культуре; опишите в дневнике форму спирохеты и цвет при окраске по Романовскому-Гимза. Промикроскопируйте препарат живых лептоспир в тёмном поле зрения; опишите в дневнике характер завитков и характер движения лептоспир.

4. Изучение морфологии микоплазм. Посмотрите микроскопический препарат и таблицу, опишите в дневнике отличия в структуре клетки бактерий и микоплазм.

5. Изучение морфологии риккетсий. Промикроскопируйте и зарисуйте препарат из культуры Rickettsia provazekii. Сравните с таблицей, определите морфологические типы в мазке.

6. Изучение морфологии хламидий. Промикроскопируйте и зарисуйте препарат хламидий в клетке эпителия конъюнктивы, укажите стрелками элементарные и ретикулярные тельца.

Занятие 5. Итог по разделу «история микробиологии. Морфология микробов»

На данном занятии предстоит подвести итог по пройденному материалу. Хорошие и прочные знания по этому разделу не только обеспечат вам высокую оценку, но и будут полезны и необходимы для изучения следующих разделов курса микробиологии.

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения темы студент должен знать структуру, морфологию и названия патогенных представителей всех изученных групп микробов, историю развития микробиологии, вирусологии, иммунологии.

Исходный уровень знаний

Знать морфологию и структуру изученных ранее групп микробов.

Цель занятия

Систематизировать знания по истории микробиологии и морфологии микробов.

Продемонстрировать овладение умениями, полученными при изучении морфологии микробов.

План изучения темы

Повторение всего пройденного материала.

После изучения раздела студент должен уметь

1. Готовить фиксированные препараты из культур микроорганизмов, растущих на плотных и жидких питательных средах.

2. Окрашивать препараты простыми методами, а также по Граму (в модификации Синёва) и Цилю-Нильсену.

3. Дифференцировать микроорганизмы по морфологическим, тинкториальным свойствам и интерпретировать полученные результаты.

4. Выявлять структурные элементы бактериальной клетки, дифференцировать микроорганизмы в зависимости от наличия или отсутствия структурных элементов.

5. Дифференцировать основные группы изучаемых микроорганизмов по особенностям их строения в готовых микропрепаратах.

Контрольные практические задания по разделу «История микробиологии. Морфология микробов»

Приготовьте фиксированный препарат из чистой культуры микроорганизмов, окрасьте его водным фуксином и дайте характеристику.

Приготовьте фиксированный препарат из чистой культуры микроорганизмов, окрасьте его метиленовым синим и дайте характеристику.

Приготовьте фиксированный препарат из чистой культуры микроорганизмов, окрасьте его по Граму в модификации Синёва и дайте характеристику.

Окрасьте готовый препарат водным фуксином и дайте его характеристику.

Окрасьте готовый препарат метиленовым синим и дайте его характеристику.

Окрасьте готовый препарат по Граму в модификации Синёва и дайте его характеристику.

Окрасьте готовый препарат по Цилю-Нильсену и дайте его характеристику.

Микроскопируйте препарат с использованием иммерсионной системы светового микроскопа. Дайте характеристику бактериям в мазке по форме и окраске.

Приготовьте препарат «раздавленной» капли для определения подвижности микробов, микроскопируйте, продемонстрируйте преподавателю.

Контрольные вопросы по разделу (подробную расшифровку вопросов смотрите в соответствующих занятиях 1-4)

Работы А. Левенгука, Э. Дженнера, Л. Пастера, Р. Коха. Работы русских ученых: Д.С. Самойловича, И.И. Мечникова, Н.Ф. Гамалея, П.В. Циклинской, С.Н. Виноградского, Д.И. Ивановского, З.В. Ермольевой, Л.А. Зильбера, В.Д. Тимакова. Место микроорганизмов среди других живых существ, их классификация. Методы микроскопии: световой микроскоп с иммерсионным объективом, микроскопия в тёмном поле зрения, фазово-контрастная микроскопия, люминесцентная микроскопия, электронная микроскопия. Морфология бактерий. Место их среди микробов, размеры, основные формы. Приготовление и окраска препаратов-мазков. Простые методы окраски. Принцип и техника окраски по Граму в модификации Синёва. Отношение бактерий к окраске по Граму. Принцип и техника окраски по Цилю-Нильсену. Характеристика прокариотов, отличия их от эукариотов. Структура бактериальной клетки. Морфология микроскопических грибов. Морфология актиномицетов. Морфология спирохет. Морфология микоплазм. Морфология риккетсий. Морфология хламидий.

Работа студента на практическом занятии

Подведение итога по разделу «История микробиологии. Морфология микробов». Выполнение контрольных заданий. Ответы на контрольные вопросы.

Раздел 2. Физиология микробов. Экология микробов (микроэкология). Симбиоз человека с микробами

Темы практических занятий раздела «Физиология микробов. Экология микробов (микроэкология). Симбиоз человека с микробами».

1. Физиология микробов. Питательные среды. Культивирование бактерий аэробов и анаэробов. Методы выделения чистых культур бактерий.

2. Выделение чистых культур бактерий (продолжение). Методы стерилизации.

3. Выделение чистых культур бактерий (окончание). Изучение ферментативных свойств бактерий. Санитарно-бактериологическое исследование воды и воздуха. Нормальная микрофлора организма человека.

4. Санитарно-бактериологическое исследование воды и воздуха (окончание). Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы. Нормальная микрофлора организма человека.

5. Итог по разделу «Физиология микробов».

микроскопический бактериологический вирусологический санитарный

Содержание компетенций и планируемый пороговый уровень развития компетенций в результате изучения раздела «Физиология микробов. Экология микробов (микроэкология). Симбиоз человека с микробами».

№	Код компетенции	Содержание компетенции (или её части)	В результате изучения дисциплины обучающиеся должны:
			Знать	Уметь	Владеть
1.	ПК-7	Способность и готовность применять методы асептики и антисептики, проводить санитарную обработку лечебных и диагностических помещений медицинских организаций	классификацию, морфологию и физиологию микроорганизмов и вирусов, их влияние на здоровье человека, методы микробиологической диагностики, применение основных антибактериальных и противовирусных препаратов, методы асептики и антисептики	пользоваться физическим, химическим и биологическим оборудованием для проведения санитарной обработки помещений медицинских организаций	алгоритмом применения методов асептики и антисептики
	ПК-11	Способность и готовность использовать методы оценки природных и медико-социальных факторов среды в развитии болезней у взрослого населения и подростков, осуществлять профилактические мероприятия по предупреждению инфекционных болезней	основные понятия и проблемы биосферы и экологии, феномен паразитизма и биоэкологические заболевания; функциональные системы организма человека, их регуляцию и саморегуляцию при воздействии с внешней средой в норме и патологии	работать с увеличительной техникой (микроскопами, оптическими и простыми лупами); проводить микробиологическую и иммунологическую диагностику	алгоритмом проведения профилактических мероприятий по предупреждению инфекционных болезней
	ПК-20	Способность и готовность осуществлять алгоритм выбора медикаментозной терапии больным с инфекционными заболеваниями	структурные и функциональные основы болезней и патологических процессов, причины, основные механизмы развития и исходов типовых патологических процессов, нарушений функций органов и систем	применять основные антибактериальные, противовирусные и биологические препараты; анализировать вопросы общей патологии и современные теоретические концепции и направления в медицине	принципы патогенетической терапии больных инфекционными заболеваниями
	ПК-31	Способность и готовность изучать научно-медицинскую информацию, отечественный и зарубежный опыт по тематике исследования	методы сбора, хранения и обработки научно-медицинской информации	производить расчёты по результатам эксперимента, проводить элементарную статистическую обработку экспериментальных данных, анализировать отчёты	базовыми технологиями преобразования информации: текстовые, табличные редакторы, поиск в сети Интернет

Занятие 6. Физиология микробов. Питательные среды. Культивирование бактерий аэробов и анаэробов. Методы выделения чистых культур бактерий

На предыдущих занятиях вы познакомились с морфологией и тинкториальными свойствами микроорганизмов. Изучение этих свойств необходимо, но, как правило, недостаточно для идентификации возбудителя, то есть определения вида микроба. Поэтому на практике наряду с микроскопическим методом применяется микробиологический метод - культивирование, выделение чистой культуры возбудителя и изучение его физиологических свойств.

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения темы студент должен знать:

- химический состав бактериальной клетки; типы, механизм питания, питательные среды, их состав и назначение;

- типы биологического окисления у микроорганизмов;

- методы культивирования и выделения чистой культуры аэробов и анаэробов;

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала необходимо знать:

- основные группы веществ: белки, жиры, углеводы, нуклеиновые кислоты, минеральные вещества, их функции;

- из курса биохимии вспомнить механизмы биологического окисления, окислительно-восстановительный потенциал;

- приготовление мазка, окраска по Граму в модификации Синёва.

Цель занятия

Уяснить особенности метаболизма микроорганизмов, принципы их культивирования в лабораторных условиях.

Изучить наборы питательных сред. Классифицировать среды по происхождению, консистенции, составу, назначению.

Познакомиться с характером роста бактерий на жидких и плотных питательных средах, с различными типами колоний.

Освоить технику посева для выделения чистых культур бактерий.

План изучения темы

1. Химический состав бактериальной клетки.

2. Механизмы и типы питания бактерий.

3. Питательные среды, требования к ним, классификация.

4. Рост и размножение микробов.

5. Биологическое окисление у бактерий. Биологическое окисление у микроорганизмов обязательно изучить, в основном, по конспекту лекций, выделение чистых культур - по практическому руководству.

6. Методы выделения чистых культур бактерий - аэробов и анаэробов.

После изучения темы студент должен уметь

Владеть техникой посева бактерий на жидкие и плотные среды.

Охарактеризовать предложенные питательные среды, применяемые в микробиологической практике.

Дополнительный материал к занятию

Питательные среды

По происхождению среды подразделяют на естественные, искусственные и синтетические. К естественным питательным средам относятся натуральные продукты животного или растительного происхождения - молоко, яйца, овощи, животные ткани, желчь, сыворотка крови. Искусственные среды готовятся по определённым рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ. Синтетические среды содержат определённые химические соединения в точно указанных концентрациях.

По составу среды делятся на простые и сложные. К простым средам относятся такие, как мясо-пептонный агар (МПА), мясо-пептонный бульон (МПБ). Сложные среды в своём составе содержат различные дополнительные компоненты, необходимые для роста микроорганизмов.

По консистенции среды подразделяют на жидкие, полужидкие, плотные, сыпучие. Жидкие среды чаще применяют для изучения физико-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы и продуктов обмена в микробиологической промышленности. Полужидкие среды обычно используют для длительного хранения культур. Они содержат в своём составе 0,5-0,7% агар-агара, который в настоящее время используют в качестве уплотнителей для питательных сред. Агар-агар представляет собой полисахарид, выделенный из морских водорослей. Он способен образовывать в воде гель, плавящийся при 1000С и уплотняющийся при 450С и ниже. Большинство микроорганизмов не используют его в качестве питательного субстрата. Плотные среды, содержащие 1,5-2% агар-агара, применяются для выделения чистых культур микроорганизмов, изучения морфологии колоний, количественного учёта, определения антагонистических свойств и других целей. Сыпучие среды используют для хранения посевного материала, культур-продуцентов в микробиологической и медицинской промышленности. К ним относят разваренное пшено, кварцевый песок, пропитанный питательным раствором.

Питательные среды по целевому назначению могут быть разделены на основные, специальные, элективные и дифференциально-диагностические. Основные питательные среды: мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар. Специальные питательные среды применяются для выращивания тех микробов, которые не могут расти на основных средах. Например, кровяной агар и сахарный бульон для стрептококка, сывороточный агар для менингококка и гонококка. Элективные питательные среды применяются для выделения одного какого-либо вида микроорганизма из смеси различных бактерий. Данный вид бактерий растёт на этой среде быстрее и лучше других, опережая их в своем росте; а рост других бактерий задерживается. Например, свёрнутая сыворотка для палочки дифтерии, щелочная пептонная вода для холерного вибриона, желчный бульон для палочек брюшного тифа, солевые среды для стафилококка. Дифференциально-диагностические питательные среды применяются для отличия одних видов бактерий от других на основании их биохимических свойств. В этих средах в качестве основы применяют разнообразные органические и неорганические соединения: питательный бульон или 1% пептонную воду. К ним добавляют углеводы, спирты, мочевину и другие вещества; при расщеплении которых происходит сдвиг рН в кислую (углеводы, спирты, липиды) или щелочную (белки) сторону, что изменяет цвет индикатора, также входящего в состав среды.

Дифференциально-диагностические среды делят на 4 основные группы:

Среды, содержащие белки, дающие характерные изменения под действием бактериальных ферментов и токсинов (кровь, желатин, молоко и др.); их применяют для определения гемолитических или протеолитических свойств: кровяной агар (КА), среда с желатином, молоко, желточно-солевой агар (ЖСА).

Среды, содержащие углеводы или многоатомные спирты и индикаторы: ферментативное расщепление субстрата приводит к сдвигу рН и изменению окраски индикатора. Например, среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева, среды Гисса, среда Олькеницкого.

Среды для дифференциации микробов по редуцирующей способности. В эту группу входят среды с красителями, обесцвечивающимися при восстановлении, а также среды с нитратами для определения денитрифицирующей активности бактерий.

Среды, включающие вещества, ассимилируемые только определённой группой бактерий. Наиболее распространёнными средами данной группы являются цитратный агар Симмонса и цитратная среда Козера.

Подробнее эти среды описаны в дополнительном материале к занятию 9 (тема: «Ферменты бактерий»).

Методы выделения чистых культур бактерий

Используют бактериологический, биологический (заражение лабораторного животного), био-бактериологический методы.

Сущность бактериологического (культурального) метода состоит в посеве исследуемого материала с использованием методов механического разобщения микробов, чтобы получить рост в виде изолированных колоний.

Методы разобщения микроорганизмов основаны на:

1) механическом разобщении бактериальных клеток на поверхности плотных питательных сред шпателем (по Дригальскому), или рассеву штрихами калиброванной петлей (по Гольду), или тампоном, после забора им исследуемого материала;

2) фильтрации исследуемого материала перед посевом (материал пропускают через специальные фильтры с определённым диаметром пор и разделяют содержащиеся в нем микроорганизмы по величине). Этот метод применяют, например, для очистки вирусов от бактерий, а также при получении бактериофагов и токсинов (в фильтрате остается фаг, или очищенный токсин, тогда как на фильтре остаются бактериальные клетки);

3) предварительном разведении в жидкой среде посевного материала с последующим высевом определённой посевной дозы на чашки с агаризованной питательной средой (метод пластинчатых разводок по Коху);

4) биологических свойствах микроорганизма, культуру которого необходимо выделить из исследуемого материала:

а) для получения культур психрофильных бактерий посевы инкубируют при низких температурах для избирательного подавления размножения сопутствующей микрофлоры;

б) метод Шукевича, используемый для выделения культуры бактерий, характеризующихся «ползучим» ростом (протеи);

в) для выделения спорообразующих бактерий прогревают посевной материал на водяной бане при 800С 10-15 мин, перед высевом. При этом погибают вегетативные формы, а споры в таких условиях сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают;

г) метод ингибирования основан на различном действии некоторых химических веществ и антибиотиков, которые добавляют в питательную среду с целью задержки роста сопутствующих микроорганизмов. Эффект ингибирования учитывается при создании элективных питательных сред. С этой же целью может быть использована предварительная обработка исследуемого материала химическими веществами перед посевом. Например, обработка материала перед посевом серной кислотой (5% раствор) быстро убивает большинство микроорганизмов, кроме кислотоустойчивых, которые выживают в этих условиях.

Биологический метод основан на способности некоторых бактерий быстро размножаться в организме чувствительных к ним лабораторных животных (биопроба) или растений. Для заражения подбирают наиболее восприимчивые к предполагаемому возбудителю инфекции виды животных или виды растений. После появления у заражённых организмов признаков болезни их убивают. Органы исследуют гистологически, микроскопически для обнаружения в них возбудителя. В некоторых случаях производят посев органов и тканей на питательные среды с целью выделения чистой культуры возбудителя (био-бактериологический метод).

Техника посева микроорганизмов на питательные среды

Посев уколом осуществляется уколом микробиологической петлёй или иглой в столбик плотной или полужидкой питательной среды. Применяется для выращивания анаэробов, для выявления характера роста по ходу укола и для определения газообразования. У подвижных и неподвижных микроорганизмов характер роста будет различным. Посев уколом практикуют также для длительного хранения культур.

Посев петлей (посев штрихами) по методу Гольда. На внешней стороне дна чашки Петри с питательным агаром проводят разграничительные линии, разделяющие её на 4 сектора. Исследуемый материал вносят петлёй в первый сектор и проводят ею параллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлёй, не изменяя её положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток микроорганизмы вырастают в виде отдельных колоний.

Посев шпателем по методу Дригальского. Используют 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлёй или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают стерильным шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель, не обеззараживая, переносят во 2-ю чашку и втирают оставшиеся на нём микроорганизмы в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й - минимальное. В зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале на третьей или на второй и третьей чашках вырастают отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры.

Посев по методу Шукевича. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду свежескошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы «вползают» на его поверхность. Отсевая материал из верхнего края роста культуры в конденсационную воду свежескошенного агара и повторяя это несколько раз, можно выделить чистую культуру.

Приборы, методы и среды для культивирования анаэробов

Микроанаэростат - используется для создания вакуума с дозированным содержанием кислорода. Прибор представляет собой герметически закрывающийся сосуд, снабжённый манометром, в который помещают посевы и откачивают воздух. Микроанаэростат помещают в термостат.

Эксикатор - стеклянный лабораторный сосуд с притёртой крышкой. В его донной части имеется дополнительная емкость, куда наливается смесь пирогаллола и едкого натра или гидросульфита натрия и двууглекислой соды. На сетку-подставку помещают посевы и притирают крышку с помощью вазелина. Эксикатор помещают в термостат.

Метод Фортнера. В чашку Петри наливают питательный агар с 1-2% глюкозы. Посредине чашки стерильным скальпелем вырезают канавку шириной приблизительно 1 см. Одну половину чашки засевают культурой аэробов (сарцина, кишечная палочка), вторую - культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом. Засеянную чашку закрывают, герметизируют и помещают вверх дном в термостат. Быстрорастущие аэробы, поглощая кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробных микроорганизмов.

Метод Перетца. В стерильную чашку Петри помещают стеклянные палочки, на которые кладут стеклянные пластинки или предметные стекла. В пробирку с 20 мл расплавленного и охлажденного до 500С МПА с 10% глюкозы (pH 7,0-7,2) вносят исследуемый материал и добавляют 2-4 капли 10% гидросульфита натрия на 10% растворе углекислой соды. Содержимое пробирки быстро перемешивают и выливают в чашку с таким расчётом, чтобы агар заполнил пространство между стеклянной пластинкой и дном чашки. Чашки инкубируют при 370С 24-48 часов. Колонии анаэробов вырастают под стеклянной пластинкой.

Метод Вейон-Виньяля. В пробирку с 0,5% расплавленным и охлажденным до 40-450С сахарным агаром вносят исследуемый материал и перемешивают. При необходимости материал разводят путём переноса в последующие 2-3 пробирки с расплавленным агаром. Содержимое пробирок набирают в пастеровские пипетки. После заполнения пипетки вытянутый конец запаивают, а противоположный конец закрывают стерильной ваткой и заливают парафином. Трубки помещают в термостат; через 2-3 суток в агаре вырастают глубинные колонии, видимые в проходящем свете, которые можно изолировать. Для этого трубку надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию извлекают петлёй и пересевают для накопления чистой культуры в соответствующую питательную среду.

Метод Биттнера. К крышке чашки Петри с посевом исследуемого материала или выделенной культуры анаэробов прикрепляют пакет из фильтровальной бумаги, содержащей пирогаллол, К2СО3 и тальк. Чашку герметизируют при помощи парафина или скотча. Содержимое пакета увлажняется за счёт образующегося конденсата, и ингредиенты вступают в реакцию, которая сопровождается поглощением О2 и выделением СО2.

Газ-пак (Generbag anaer). Система Generbag anaer состоит из воздухонепроницаемых пакетов, изготовленных из прозрачной пластмассы и генераторов, содержащих смесь веществ, поглощающих кислород. Последовательность работы: вынуть генератор из пакета, поместить в нижнюю часть воздухонепроницаемого пакета, затем поместить чашки (или пробирки) с посевами и с помощью специальной скрепки закрыть пакет. Инкубация при 370С.

Среда Китта-Тароцци. Содержит мясо-пептонный бульон, 0,5% глюкозы и 0,15% агара. На дно пробирки для адсорбции О2 помещают кусочки варёной печени или фарша слоем 1-1,5 см и заливают 6-7 мл среды. Среду перед посевом регенерируют (прогревают 15-20 мин. на водяной бане для удаления воздуха, а затем быстро охлаждают). После посева среду заливают вазелиновым маслом и помещают в термостат.

Полужидкий сахарный агар (высокий столбик). В пробирку с 6-7 мл расплавленного и охлаждённого до 40-450С полужидкого питательного агара, содержащего 0,5-1% глюкозы, вносят исследуемый материал и перемешивают. Посевы помещают в термостат.

Среда для контроля стерильности (СКС). Рост многих анаэробных микроорганизмов возможен только на средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом. Поэтому в среды добавляют восстановители, например, тиогликолевую кислоту или её натриевую соль, цистеин, аскорбиновую кислоту. Функции восстановителей выполняют и другие компоненты среды: глюкоза, пептон. СКС содержит питательный бульон, витаминный препарат ЭКД, NaCl, Na2CO3, глюкозу, тиогликолят натрия, цистеин, агар (0,75%). Среду разливают в пробирки по 6-7 мл.

Контрольные вопросы

Химический состав бактериальной клетки: содержание, локализация в клеточных структурах и биологическая роль воды, белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов и минеральных веществ. Источники азота, углерода. Факторы роста. Что такое энергетический и конструктивный метаболизм? Особенности обмена веществ бактерий. Ферменты бактерий. Механизм расщепления веществ. Способы поступления их в клетку. Типы питания микробов. Могут ли микроорганизмы изменить тип питания? Каковы типы питания патогенных микробов? Каким требованиям должны соответствовать питательные среды? Классификация питательных сред по консистенции, по целевому назначению. Основные питательные среды. Специальные питательные среды, их названия; для каких бактерий предназначены? Элективные питательные среды, состав, применение. Приведите примеры. Дифференциально-диагностические среды, их названия; для чего применяются? Что такое рост микробов, размножение микробов? Как размножаются бактерии? Фазы роста бактериальной культуры в жидкой питательной среде (начертить кривую). Размножение бактерий в непрерывно-проточной среде. Условия культивирования бактерий. Что такое культура бактерий, чистая культура, штамм? Особенности биологического окисления у микробов. Группы микробов по типу биологического окисления. Каковы различия между аэробным и анаэробным типом (основные этапы, ферменты, участие свободного кислорода, конечный акцептор водорода, продукты окисления). Перечислите патогенные анаэробы. Что такое окислительно-восстановительный потенциал среды, какие микробы лучше растут при низких его значениях, какие - при более высоких? Типы брожения. Что такое аэрация питательной среды, как она осуществляется? Особенности культивирования анаэробных бактерий. Среды, методы и приборы, используемые для их культивирования. Среда Китта-Тароцци: на чём основано её действие, что входит в её состав, что делают со средой перед посевом и для чего? Рассказать поэтапно выделение чистой культуры микробов-аэробов. Рассказать поэтапно выделение чистой культуры микробов-анаэробов. Что такое психрофилы, мезофилы, термофилы? Оптимальная температура для роста патогенных микробов.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

В тетради перепишите схемы выделения чистых культур аэробов и анаэробов и впишите цель посева на каждом этапе.

Заполните таблицу «Культивирование анаэробов».

№	Способ культивирования	Сущность способа	Используемые
			приборы	методы	среды
1.	Физический
2.	Химический
3.	Биологический
4.	Комбинированный

Работа студента на практическом занятии

1. Ознакомление с питательными средами. Изучите питательные среды и распределите их по назначению: основные, специальные, элективные, дифференциально-диагностические.

2. Методы посева бактериальных культур с соблюдением правил асептики. Ознакомьтесь с особенностями техники пересева бактериальных культур на плотные и на жидкие питательные среды.

3. Выделение чистой культуры бактерий-аэробов. Ознакомьтесь с методом получения изолированных колоний путем посева на чашке с питательной средой (демонстрация преподавателем). Из смеси бактерий приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте. Произведите посев смеси бактерий на чашку с питательной средой, укажите цель посева.

4. Методы культивирования и выделения чистых культур анаэробов. Ознакомьтесь с аппаратурой для культивирования анаэробов. Из посева на среде Китта-Тароцци приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте. Внимательно проследите за демонстрацией преподавателем посева по методу Вейнберга в трубки Вейон-Виньяля.

Занятие 7. Выделение чистых культур бактерий (продолжение) методы стерилизации

Знание методов стерилизации необходимо врачу любой специальности. Поэтому следует тщательно изучить этот материал и знать конкретно методики, аппаратуру, режим стерилизации.

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения темы студент должен знать:

- культуральные свойства микробов;

- понятие о стерилизации, дезинфекции, асептике и антисептике, методы стерилизации;

- устройство термостатов.

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала необходимо знать:

- схему выделения чистой культуры аэробов и анаэробов;

- условия, необходимые для культивирования микробов;

- характеристику роста микробов на плотных и на жидких питательных средах; морфологию колоний микробов, пигменты микробов.

Цель занятия

1. Изучить культуральные свойства бактерий.

2. Ознакомиться с особенностями бактериологического метода выделения чистых культур анаэробных микроорганизмов.

3. Ознакомиться с основными методами стерилизации, применяемыми в микробиологии и медицине.

План изучения темы

1. Повторите схему выделения чистой культуры бактерий - аэробов и анаэробов.

2. Понятие о культуральных свойствах микробов;

а) условия, необходимые для культивирования данного вида (питательная среда, рН, гН2, температура, аэробные или анаэробные условия);

б) характер роста данного вида микробов на питательных средах.

3. Пигменты микробов, их характеристика.

4. Методы стерилизации.

После изучения темы студент должен уметь

Охарактеризовать колонии микроорганизмов.

Провести посев изолированных колоний на скошенный питательный агар.

Выбрать средства, режим стерилизации в соответствии с конкретными задачами.

Дополнительный материал к занятию

Методы контроля стерильности

Микробиологический контроль объектов, подвергшихся стерилизации, проводится постоянно.

Контроль работы аппаратуры для стерилизации осуществляется несколькими способами:

Персонал должен строго соблюдать установленный режим стерилизации, который обеспечивает гибель микробов.

Соответствующей службой должен регулярно проводиться технический контроль аппаратуры для стерилизации.

Косвенно о поддержании определенной температуры при стерилизации можно судить по изменению окраски химических индикаторов, которые помещают на поверхность и в глубину стерилизуемого объекта. Создана комплексная система оперативного контроля критических параметров паровой и воздушной стерилизации с помощью индикаторов серий «МедИС», «СТЕРИКОНТ», «СТЕРИТЕСТ», «ИНТЕСТ», «ФАРМАТЕСТ», «СВИДЕТЕЛИ». Индикаторы серий «МедИС» и «СТЕРИКОНТ» предназначены для контроля всех критических параметров паровой или воздушной стерилизации в камере стерилизатора (снаружи стерилизуемых упаковок). Индикаторы серии «СТЕРИТЕСТ» предназначены для контроля всех критических параметров паровой и воздушной стерилизации внутри стерилизуемых упаковок. Индикаторы серии «ИНТЕСТ» предназначены для контроля всех критических параметров паровой и воздушной стерилизации как в камере стерилизатора, так и внутри стерилизуемых упаковок. Индикаторы серии «ФАРМАТЕСТ» предназначены для контроля всех критических параметров паровой или воздушной стерилизации как в камере стерилизатора, так и внутри стерилизуемых флаконов с растворами и питательными средами. Индикаторы серии «СВИДЕТЕЛИ» предназначены для визуального отличия упаковок, прошедших стерилизацию, от нестерилизованных и исключения риска смешения потоков стерилизованных и не стерилизованных изделий.

Преимущества индикаторов:

- чёткий, контрастный цветовой переход облегчает визуальный контроль и повышает его точность;

- на каждом индикаторе напечатан эталон конечного цвета индикаторной метки, который она приобретает при соблюдении параметров стерилизации;

- липкий слой на обратной стороне индикатора облегчает его закрепление на стерилизуемых упаковках и подклеивание в журнал контроля.

4. Микробиологический контроль стерилизации проводится с помощью посевов кусочков стерилизуемого материала, смывов с предметов, подвергшихся стерилизации на среды, позволяющие обнаружить аэробные и анаэробные бактерии, грибы (сахарный бульон, тиогликолевая среда, среда Сабуро). Отсутствие роста после 14 дней инкубации в термостате свидетельствует о стерильности предмета. Кроме того, для контроля процесса стерилизации применяются тест-культуры спор Bacillus stearothermophilus (для контроля работы паровых стерилизаторов) и Bacillus licheniformis B-6 (для воздушных стерилизаторов). Тест-культуры помещают в камеры для стерилизации и после её окончания высевают на питательные среды с последующей инкубацией в термостате.

Для сохранения стерильности предметы должны иметь упаковку, не допускающую микробного загрязнения. С этой целью применяют полимерную плёнку, бумагу, фольгу, биксы, металлические пеналы, флаконы.

Контрольные вопросы

Как вы будете проводить выделение чистой культуры аэробов и анаэробов на данном занятии? Как, по каким признакам проводится описание изолированных колоний бактерий на плотных питательных средах? Что входит в понятие «культуральные свойства микробов»? Для чего их изучают? Пигменты микробов, их характеристика: приведите примеры микробов, образующих пигменты, растворимые в воде, растворимые в органических растворителях и нерастворимые пигменты. Определите понятия: асептика; антисептика, дезинфекция, стерилизация. Перечислите методы стерилизации, применяемые в микробиологической практике и медицине. Охарактеризуйте каждый из этих методов: аппаратура, режим стерилизации (температура и время), стерилизуемые материалы, контроль успешной стерилизации. Как стерилизовать стеклянную посуду? Простые питательные среды. Питательные среды, содержащие углеводы. Стерилизация дробными методами проводится при таких температурах, при которых споровые формы не гибнут. Как же достигается стерильность при этих методах? Перечислите методы, применяемые для контроля процесса стерилизации. Фильтрование: в каких случаях применяется, что представляют собой фильтры, условия фильтрования; от каких микроорганизмов не освобождается профильтрованная жидкость? Как простерилизовать питательную среду, содержащую белки? Пастеризация: режим, для чего применяется, хранение пастеризованных продуктов. Стерильны ли пастеризованные продукты? Принципиальная схема устройства термостатов и их применение в микробиологической практике.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Перепишите таблицу «Методы стерилизации» и заполните её. Напишите определения понятий: стерилизация, дезинфекция, асептика, антисептика.



МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ

Метод	Аппарат	Режим стерилизации	Стерилизуемый материал	Контроль стерилизации
Прокаливание
Стерилизация сухим жаром
Стерилизация паром под давлением
Стерилизация текучим паром
Тиндализация

МЕТОДЫ ЧАСТИЧНОГО ОБЕСПЛОЖИВАНИЯ

Метод	Режим	От каких микроорганизмов не освобождается обрабатываемый материал
Пастеризация
Фильтрование
Кипячение

Дайте определение понятий:

Стерилизация Асептика

Дезинфекция Антисептика

Работа студента на практическом занятии

1. Изучение культуральных свойств бактерий. Ознакомьтесь с характером роста бактерий на жидких и плотных питательных средах, опишите их в тетради. Изучите характер роста пигментных бактерий по готовым посевам и опишите в тетради.

2. Выделение чистой культуры аэробов (второй день). Изучите и опишите в тетради выросшие на чашке колонии. Отберите изолированные колонии, принадлежащие разным видам бактерий, приготовьте из них мазки, микроскопируйте и зарисуйте. Произведите пересев одной из отобранных колоний на скошенный агар.

3. Выделение чистой культуры анаэробов (третий день). Изучите и опишите колонии в трубке Вейон-Виньяля. Отберите изолированную колонию, извлеките её путём распила трубки, приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте, произведите пересев из этой же колонии на среду Китта-Тароцци.

4. Методы стерилизации. Ознакомьтесь с аппаратурой для стерилизации (демонстрация).

5. Устройство термостата, бокса для проведения посевов (демонстрация).

Занятие 8. Выделение чистых культур бактерий (окончание). Изучение ферментативных свойств бактерий. Санитарно-бактериологическое исследование воды и воздуха. Нормальная микрофлора организма человека

Способность микробов расщеплять углеводы и белки широко используется в микробиологической практике для идентификации (определения вида) микроба. Дело в том, что разные виды бактерий, в том числе и имеющие одинаковую морфологию, могут отличаться по ферментативной активности. Поэтому идентифицировать такие виды только по их морфологии невозможно. После выделения чистой культуры морфологически сходных микробов производят их посев на среды с углеводами и белковые среды.

В окружающей нас природе наряду с микробами-сапрофитами могут находиться и патогенные микроорганизмы. Поэтому систематический микробиологический контроль почвы, воды и воздуха имеет большое практическое значение как для предупреждения инфекционных заболеваний, так и в интересах экологии - сохранения постоянства микрофлоры в естественной среде обитания.

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения темы студент должен знать:

- ферменты микробов; методы определения ферментативной активности микробов, применяемые для этого питательные среды;

- микрофлору почвы, воды и воздуха; методы санитарно-бактериологического исследования объектов внешней среды.

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала темы необходимо знать:

- выделение чистой культуры аэробов и анаэробов;

- питательные среды.

Цель занятия

1. Изучить принципы идентификации чистых культур по морфологическим, культуральным, биохимическим и другим свойствам.

2. Показать разнообразие ферментов у микроорганизмов и возможности их использования для идентификации.

3. Изучить методы и показатели, необходимые для микробиологической оценки объектов окружающей среды.

План изучения темы

1. Ферменты микробов - по лекции и по учебнику. Обратите внимание на особенности ферментных систем прокариотов. Определение ферментативной активности микробов - по практическому руководству и по дополнительному материалу к данному занятию.

2. Санитарно-бактериологическое исследование почвы, воздуха и воды - по учебнику, по лекции, по практическому руководству. Микрофлору внешней среды следует усвоить по определенному плану: постоянная микрофлора данной среды, санитарно-показательные микроорганизмы, показатели микробного загрязнения; для каких инфекционных заболеваний данная среда может быть фактором передачи. Методы санитарно-бактериологических исследований и предельно-допустимые показатели - усвоить конкретно.

3. Нормальная микрофлора организма человека.

После изучения темы студент должен уметь

Охарактеризовать колонии микроорганизмов.

Провести посев изолированных колоний на скошенный питательный агар.

Проводить оценку санитарно-бактериологического состояния воздуха, воды, почвы по микробиологическим показателям.

Освоить методику взятия материала для микробиологического исследования со слизистой рото-носоглотки и зева стерильным ватным тампоном.

Дополнительный материал к занятию

Для отличия одних видов бактерий от других изучают их ферментативную активность. Для обнаружения ферментов исследуемую культуру микробов засевают на специальные дифференциально-диагностические питательные среды, которые в зависимости от состава и своего назначения можно разделить на 4 группы.

Среды, содержащие белковые вещества (пептон, желатину, молоко, свёрнутую сыворотку крови, куриный белок и т.д.) для выявления протеолитических ферментов.

Среды с сахарами или многоатомными спиртами (углеводами), для определения сахаролитической активности микроорганизмов.

Среды с химическими веществами, изменяющимися под влиянием окислительно-восстановительных ферментов, продуцируемых микробами.

Среды, содержащие индифферентные химические вещества, являющиеся источником питания одних видов и не ассимилируемые другими видами микробов.

Свойство расщеплять углеводы и высокоатомные спирты, которые принято объединять в одну группу, именуемую сахарами, присуще многим микробам. Под действием сахаролитических ферментов бактерий «сахарб» расщепляются либо до кислоты, либо до кислоты и газа. Сахаролитические свойства изучают на средах Гисса (или «пёстрого ряда»). Среды Гисса готовятся на основе жидкой среды (пептонной воды) или полужидкого мясо-пептонного агара. Содержат какой-либо углевод или многоатомный спирт (лактозу, глюкозу, маннит, сахарозу и т.д.) и индикатор, который меняет свой цвет в кислой среде. В пробирку с жидкой средой Гисса помещают стеклянный поплавок. Если на среду Гисса посеять микроб, который сбраживает данный углевод с образованием кислоты и газа, то есть до конечных продуктов, то среда изменит свой цвет, в полужидкой среде появятся пузырьки и разрывы в толще агара, в жидкой среде - пузырёк газа в поплавке. При сбраживании углевода только до промежуточных продуктов (до кислоты) происходит только изменение цвета среды. Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах: Эндо, Левина, Плоскирева, Клиглера, Олькеницкого и других. Среды Эндо, Левина, Плоскирева в чашках Петри применяются для дифференцировки бактерий кишечной группы по их способности сбраживать лактозу. Эти среды содержат питательный агар, лактозу и индикатор, изменяющий свой цвет в кислой среде (индикатор рН). Если посеять на такую среду бактерии, которые сбраживают лактозу, например, кишечную палочку, то в результате сбраживания лактозы образуется кислота и индикатор изменит свой цвет в кислой среде. Поэтому колонии кишечной палочки на таких средах будут окрашены соответственно цвету индикатора: на среде Эндо и среде Плоскирева - в красный цвет, на среде Левина - в чёрно-синий. Если же на эти среды посеять бактерии, которые не сбраживают лактозу, например, палочки брюшного тифа или палочки дизентерии, то кислота не образуется, реакция среды останется слабощелочной и цвет индикатора не изменится. Поэтому колонии бактерий, не сбраживающих лактозу, на этих средах будут бесцветными. Среду Плоскирева можно отнести также и к элективным средам, для выделения палочек дизентерии, так как эта среда содержит соли желчных кислот, задерживающих рост кишечной палочки, и краситель бриллиантовый зеленый, задерживающий рост воздушной кокковой микрофлоры. Висмут-сульфит агар - это дифференциально-диагностическая среда, применяемая главным образом при диагностике сальмонеллёзов. При росте сальмонелл происходит восстановление висмута из его солей и колонии сальмонелл, в отличие от других видов микробов, окрашиваются в чёрный цвет.

Применяются также комбинированные среды, содержащие не один углевод, а два или три, например, среда Олькеницкого - трёхсахарный агар с мочевиной. Одна пробирка среды Олькеницкого заменяет скошенный агар и среды Гисса с лактозой, сахарозой и глюкозой. Среда готовится на основе не очень плотного МПА. Содержит лактозу (1%), сахарозу (1%), глюкозу (0,1%), мочевину, соль Мора (сульфат железа), гипосульфит натрия и индикатор.

Среду после стерилизации в расправленном виде оставляют застывать в таком положении, чтобы получился столбик и скошенная часть. Посев производится штрихом по скошенной части и уколом в столбик. При сбраживании углеводов, которые содержатся в большем количестве (лактозы, сахарозы или обоих сахаров) изменяется цвет всей среды; при сбраживании только глюкозы изменяется цвет столбика, а скошенная часть остается без изменений. Образование газа определяется по наличию пузырьков в столбике агара. Культуры, расщепляющие мочевину с образованием аммиака, дают щелочную реакцию. При этом происходит нейтрализация кислоты, образующейся при сбраживании углеводов, и цвет всей среды не изменяется. Расщепление мочевины свойственно протеям и некоторым кишечным палочкам. Патогенные энтеробактерии не разлагают мочевину. Добавление соли Мора и гипосульфита позволяет также изучить способность бактерий расщеплять белки с образованием сероводорода, что определяется по почернению в столбике агара в результате превращения сульфата железа в сульфид чёрного цвета.

При росте микроорганизмов, образующих амилазу, на средах с растворимым крахмалом происходит его расщепление. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя, - цвет среды не изменяется. Нерасщеплённый крахмал даёт с этим раствором синее окрашивание.

Протеолитические ферменты у бактерий изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном и на некоторых полиуглеводных средах (например, на среде Клиглера). Показателями глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода.

Сероводород обнаруживают с помощью полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца, которую закрепляют между стенкой засеянной пробирки и пробкой (при взаимодействии сероводорода и ацетата свинца бумага чернеет в результате образования сульфида свинца), или на средах, в состав которых входят соли железа или свинца, которые при взаимодействии с сероводородом дают чёрное окрашивание самой среды или выросших колоний (среды Вильсона-Блера, Клиглера и т.д.)

Для обнаружения индола по способу Мореля узкие полоски фильтровальной бумаги, смоченные горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушенные, помещают между стенкой пробирки с питательным агаром и пробкой. При выделении индола на 2-3-й день нижняя часть полоски бумаги приобретает розовый цвет. Другой, более чувствительный, метод обнаружения индола позволяет концентрировать индол на поверхности среды ксилолом или эфиром, а добавление раствора Ковача (парадиметиламинобензальдегида) приводит к образованию красного кольца. Индол образуется при наличии у бактерий фермента триптофаназы.

Наличие аммиака определяют по посинению розовой лакмусовой бумажки, помещённой между стенкой и пробкой засеянной пробирки.

Желатиназа. При посеве уколом в желатин некоторые микробы (холерный вибрион, стафилококк, сибиреязвенная палочка и др.) при комнатной температуре (20-22°С) разжижают его, причём различные виды микробов дают характерную для них форму разжижения (послойно, в виде гвоздя, ёлочки и т.д.).

Другие протеолитические ферменты:

- при посеве на свёрнутую сыворотку вокруг колоний появляются углубления (разжижение);

- в молоке происходит расщепление сгустка казеина с образованием пептона, в результате чего оно приобретает желтоватый цвет (пептонизация молока).

Наличие уреазы у бактерий определяют на среде с мочевиной и индикатором фенол-рот (начальный цвет среды - жёлтый). При расщеплении мочевины на аммиак и углекислый газ накапливается аммоний, что сдвигает рН в щелочную сторону и изменяет цвет индикатора на красный.

...