Микробиология и вирусология

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала темы необходимо знать:

- морфологию и физиологию грибов и других продуцентов антибиотиков;

- участие структурных элементов клеток прокариотов в их физиологических функциях;

- состав и функции нормальной микрофлоры организма человека.

Цель занятия

1. Познакомиться с основными группами химиотерапевтических препаратов с антимикробной активностью.

2. Усвоить сведения о механизмах лекарственной устойчивости бактерий.

3. Изучить методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам.

4. Усвоить особенности строения бактериофагов. Освоить методы получения и титрования бактериофагов. Ознакомиться с практическим использованием бактериофагов в медицине и микробиологии.

План изучения темы

1. Химиотерапевтические препараты и антибиотики: источники получения, механизм действия, практическое применение.

2. Лекарственная устойчивость микроорганизмов: механизмы формирования, методы определения, способы преодоления.

3. Бактериофагия: природа бактериофагов, их структура, взаимодействие с бактериальной клеткой, специфичность, выделение и титрование бактериофагов, практическое применение.

После изучения темы студент должен уметь

Определить антибиотикограмму исследуемой культуры диско-диффузионным методом.

Интерпретировать результаты изучения чувствительности бактерий к антибиотикам, полученные методом бумажных дисков и методом серийных разведений.

Установить феномен бактериофагии на плотных и жидких питательных средах, оценить полученные результаты.

Применить бактериофаг для профилактики и терапии инфекционных заболеваний.

Дополнительный материал к занятию

Критериями антимикробной активности препарата являются минимальная подавляющая концентрация (МПК) и минимальная бактерицидная концентрация (МБК). МПК - это наименьшая концентрация антибиотиков, которая in vitro полностью подавляет видимый рост бактерий. Она выражается в мг/л или мкг/мл. МБК - это наименьшая концентрация антибиотика, которая вызывает бактерицидный эффект. Для её определения необходимо провести высев из пробирок (визуально отсутствует рост) на плотный питательный агар, не содержащий антибиотик. Этот показатель имеет большое клиническое значение. На основе метода серийных разведений созданы микрометоды, предусматривающие использование меньшего объёма питательной среды. В настоящее время для проведения такого рода исследований выпускаются многочисленные коммерческие наборы, состоящие из высушенных стабилизированных разведений антибиотиков, которые разбавляются суспензией тест-микроба. Данные наборы могут храниться в обычных условиях, вследствие чего исключается необходимость в приготовлении разведений среды и антибиотиков в лабораторных условиях. Достоинством тестов микроразведений является также то, что они включаются в автоматизированную систему.

На основании полученных данных (диаметра зоны задержки роста или величины МПК) микроорганизмы подразделяют на чувствительные, умеренно-резистентные и резистентные. Для разграничения этих категорий используют так называемые пограничные концентрации антибиотиков, которые не являются неизменными величинами. Они пересматриваются по мере изменения чувствительности популяции микроорганизмов. Разработкой и пересмотром критериев интерпретации занимаются ведущие специалисты (химиотерапевты, микробиологи), входящие в специальные комитеты. Одним из них является национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам (National Committee for Clinical Laboratory Standards - NCCLS), организованный в США. В настоящее время стандарты NCCLS используются как международные для оценки результатов определения чувствительности бактерий при многоцентровых микробиологических и клинических исследованиях.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам

Критерием чувствительности микроорганизмов к антибиотикам является минимальная подавляющая концентрация (МПК) или минимальная ингибирующая концентрация (МИК) антибиотика, задерживающая рост возбудителя при стандартных условиях постановки опыта.

Для определения лекарственной устойчивости используют суточную чистую культуру возбудителя, выделенную из организма больного, и стандартную питательную среду (АГВ или Мюллер-Хинтон агар) для её посева.

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят диско-диффузионным методом или методом серийных разведений антибиотика в жидких или плотных средах.

Диско-диффузионный метод

Определение чувствительности к антибиотикам методом бумажных дисков основано на диффузии антибиотика в питательную среду. Концентрация антибиотиков в дисках подобрана таким образом, чтобы диаметры зон задержки роста стандартных тест-микроорганизмов соответствовали международным стандартам. Эта концентрация соответствует средней терапевтической дозе для стандартных штаммов микроорганизмов.

Приготовленную взвесь микроорганизмов засевают на поверхность специальной среды (АГВ или агар Мюллер-Хинтона) в чашки Петри. Затем стерильным пинцетом на засеянную поверхность помещают на равном расстоянии друг от друга, от краев и центра чашки стандартные бумажные диски, пропитанные растворами различных антибиотиков (также можно использовать специальные устройства и диспенсеры). Засеянные чашки выдерживают в термостате при температуре, оптимальной для роста исследуемых бактерий. Если бактерии чувствительны к данному антибиотику, то вокруг диска образуется зона задержки роста. Диаметр зоны задержки роста соответствует степени чувствительности исследуемого микроорганизма к данному антибиотику. Окончательный результат оценивается по специальным таблицам, в которых указаны диаметры зон задержки роста стандартных культур, чувствительных, устойчивых и умеренно-устойчивых.

Метод дисков не даёт надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксину, ристомицину). Также этот метод не позволяет определить минимальную подавляющую концентрацию антибиотика.

Метод серийных разведений

Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий (МПК, МИК). Для этого вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ед/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Далее из основного раствора готовят все последующие разведения в бульоне (в объёме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 106-107 бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона (без антибиотика) и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 370С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем. Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий под влиянием содержащейся в ней минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибиотика. Для оценки минимальной бактерицидной концентрации (МБК) производят высев на плотную питательную среду без антибиотика из пробирок с отсутствием роста. За МБК принимают минимальную концентрацию антибиотика, вызывающую гибель микроорганизма, что характеризуется отсутствием роста на чашках Петри с питательной средой.

Метод серийных разведений антибиотика в агаризованной среде

В этом случае можно в одном опыте проверить чувствительность к разным концентрациям данного антибиотика нескольких культур микроорганизмов. Различные разведения антибиотика готовят в стерильной агаризованной среде. Для этого в неё добавляют требуемое количество исходного раствора антибиотика, тщательно перемешивают и заливают в стерильные чашки Петри. После застывания агара дно чашки с наружной стороны делят маркером на сектора. Каждую исследуемую культуру засевают штрихом с помощью бактериологической петли на определённый сектор в чашки с разными концентрациями антибиотика. Посев исследуемых культур на чашки с различными концентрациями антибиотика можно сделать с помощью аппликатора, позволяющего засевать одновременно 12-15 культур на одну чашку. Затем чашки помещают в термостат при температуре, оптимальной для роста и развития изучаемых бактерий. Результаты учитывают по наличию или отсутствию роста бактерий в сравнении с ростом на среде в контрольной чашке. Бактерии считаются чувствительными к антибиотику в такой его концентрации, при которой их рост полностью подавляется.

Метод Е-тестов

Данный метод сочетает в себе достоинства метода серийных разведений и метода дисков. Вместо дисков используются полоски («линейки») фильтровальной бумаги, пропитанные антибиотиком, причем у основания полоски концентрация антибиотика будет минимальной, а на «верхушке» - максимальной. Полоски помещают на поверхность питательного агара, засеянного исследуемой культурой. Если бактерии чувствительны к действию данного препарата, вокруг участков полоски, содержащих его ингибирующие концентрации, возникает эллипсовидная зона задержки роста. Числовое значение концентрации антибиотика у основания этой зоны указывает на МПК данного антибиотика для данной культуры.

К чувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаруживаемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков.

К умеренно устойчивым относятся штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, создающиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата.

Устойчивыми являются микроорганизмы, рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.

Количественные методы или методы титрования бактериофагов

Титрование бактериофагов проводится с использованием культур чувствительных бактерий в жидких и плотных питательных средах.

Метод титрования бактериофага по Аппельману (на жидкой питательной среде)

Готовят десятикратные разведения исследуемого бактериофага в питательном бульоне. Для этого в ряд пробирок разливают по 4,5 мл бульона. В 1-ю пробирку добавляют 0,5 мл исследуемого фага. Тщательно перемешивают и переносят в последующие пробирки (из пробирки в пробирку) по 0,5 мл соответствующего разведения фага с уменьшением его концентрации в десять раз. Получают разведения от 10-1 до 10-9 степени. Затем в пробирки вносят по 1 капле суточной культуры соответствующих бактерий. После инкубации в течение суток определяют титр фага. За титр бактериофага принимают то его максимальное разведение, при котором наблюдается полный лизис культуры (просветление среды).

Метод титрования бактериофага по Грациа (на плотной питательной среде)

Питательный агар разливают в чашки Петри и подсушивают в термостате. Готовят полужидкий питательный агар по 3-4 мл в пробирке и растапливают его на водяной бане. Делают десятикратные разведения исследуемого бактериофага в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем 0,5 мл каждого разведения бактериофага смешивают с таким же объёмом суточной бульонной культуры чувствительных к бактериофагу бактерий и выливают эту смесь в пробирку с полужидким агаром температурой 45°C. Приготовленную смесь быстро выливают на поверхность первого слоя агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 37°C в течение суток. Смеси бактериофага, культуры и полужидкого агара делают из разведений фага 102-1010, в зависимости от предполагаемого титра фага.

Не заражённые бактериофагом бактерии, размножаясь, образуют сплошной газон роста на поверхности питательного агара. Каждая инфицированная бактериофагом бактерия лизируется и освобождает потомство бактериофага, которое внедряется в интактные клетки бактерий, и весь цикл повторяется. В результате лизиса клеток на сплошном бактериальном газоне появляются «стерильные» пятна или негативные колонии бактериофага. Число этих пятен соответствует количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Количество пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии бактериофага называется его титром.

Фаготипирование бактерий

Метод фаготипирования имеет большое значение при эпидемиологических исследованиях, так как позволяет выявить источник и пути распространения возбудителей заболеваний. Определение фаговара выделенной чистой культуры проводят с помощью набора типовых диагностических бактериофагов. Фаговар культуры определяют по тому типовому фагу, который вызвал её лизис.

Для проведения фаготипирования исследуемую суточную культуру бактерий засевают «газоном» на поверхность питательного агара в чашки Петри, подсушивают в термостате, делят со стороны дна чашки на квадраты и наносят пипеткой по одной капле соответствующего бактериофага в тест-разведении, указанном на ампуле. В один квадрат бактериофаг не вносят, для контроля роста культуры. Чашку термостатируют при 37оС 18-20 часов, после чего оценивают результат реакции. Положительный результат реакции фаголизиса - лизис культуры в месте нанесения бактериофага («негативные» колонии) при наличии роста в контроле свидетельствует о соответствии культуры бактериофагу и принадлежности с учетом её фаголизабельности к соответствующему виду.

Применение бактериофагов

Применяемые на практике препараты бактериофагов представляют собой фильтрат бульонной культуры соответствующих микробов, лизированных фагом, содержащий живые частицы фага, а также антигены бактерий, освободившиеся из бактериальных клеток при их лизисе. Полученный препарат - жидкий бактериофаг - должен иметь вид совершенно прозрачной жидкости желтого цвета большей или меньшей интенсивности. Препарат проходит контроль на стерильность (методом посева), безвредность и литическую активность (титр).

Диагностические бактериофаги выпускаются как в жидкой, так и в сухой форме, в ампулах. Перед началом работы сухой бактериофаг разводится.

Для лечебно-профилактических целей бактериофаги выпускаются в форме таблеток с кислотоустойчивой оболочкой, в жидком виде или в суппозиториях. Таблетированный сухой бактериофаг более стабилен при хранении и удобен при применении. Одна таблетка сухого бактериофага соответствует 20-25 мл жидкого препарата. Срок годности сухого и жидкого препарата составляет 1 год. Жидкий бактериофаг следует хранить при температуре +2 - +100С, сухой - не выше +10С, но его можно хранить в холодильнике и при отрицательной температуре.

Принятый внутрь бактериофаг сохраняется в организме в течение 5-7 дней. Как правило, приём бактериофага не сопровождается какими-либо реакциями или осложнениями. Противопоказаний к приему нет.

Бактериофаги могут применять также в виде орошений, полосканий, примочек, тампонов. Инъекционные формы бактериофагов можно вводить в стерильные полости - брюшную, плевральную, суставную и в мочевой пузырь. Существует форма выпуска бактериофагов в свечах для ректального применения.

Контрольные вопросы

Дайте определение понятия «химиотерапевтический препарат». Назовите фамилию учёного, разработавшего теорию химиотерапии. Какие свойства являются определяющими при выборе химиотерапевтического препарата? Что такое бактерицидное и бактериостатическое действие препарата? Что такое химиотерапевтический индекс, напишите его формулу, для чего применяется этот показатель? Укажите первые антиспирохетные препараты, синтезированные Эрлихом. Назовите группы химиотерапевтических препаратов, приведите примеры. Назовите фамилию учёного, впервые получившего антибактериальный препарат, и название препарата. Дайте определение понятию «антибиотик». Назовите фамилии русских учёных, впервые обнаруживших антибактериальные свойства зелёной плесени. Назовите фамилию учёного, изучавшего свойства зелёной плесени и сделавшего попытку выделить пенициллин. Назовите фамилии учёных - зарубежных и отечественных, получивших первый антибиотик из зелёной плесени. Назовите фамилию учёного, впервые получившего стрептомицин. Классификация антибиотиков по происхождению (источнику получения), по химическому составу. Механизм действия антибиотиков: «мишени» (точки приложения различных групп антибиотиков). Что означает понятие «спектр действия» антибиотиков? Назовите антибиотики активные преимущественно по отношению к грамотрицательным бактериям, преимущественно по отношению к грамположительным бактериям, антибиотики широкого спектра действия, противовирусные, противогрибковые, противоопухолевые антибиотики. Методы определения активности антибиотиков; в каких единицах измеряется антибактериальная активность антибиотиков? Основные проявления побочного действия антибиотиков. Виды лекарственной устойчивости микробов по происхождению. Генетические механизмы лекарственной устойчивости. Фенотипические (биохимические, структурные) механизмы лекарственной устойчивости. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам, техника исследования и оценка результатов. Какие существуют способы предупреждения и преодоления лекарственной устойчивости микробов? Назовите препараты, предназначенные для преодоления лекарственной устойчивости и применяемые в сочетании с антибиотиками.

ЗАДАЧА 1. Укажите культуру, наиболее чувствительную к пенициллину, если диаметр зоны задержки роста вокруг диска равняется: кишечная палочка - 0 мм; стафилококк - 15 мм; стрептококк - 30 мм; палочка дифтерии - 13 мм.

ЗАДАЧА 2. Выберите наиболее эффективный антибиотик для лечения больного, если при определении лекарственной устойчивости возбудителя методом стандартных дисков установлены диаметры зон задержки роста: пенициллин - 0 мм; стрептомицин - 13 мм; тетрациклин - 28 мм; эритромицин -15 мм.

ЗАДАЧА 3. Применение пенициллина для лечения стафилококкового заболевания у больного оказалось неэффективным. Какую можно предположить причину неэффективности пенициллина? Как можно проверить это предположение? Какие методы можно применить для этого?

ЗАДАЧА 4. У больного Н. с диагнозом бактериальная дизентерия до начала лечения выделен возбудитель дизентерии, чувствительный ко всем антибиотикам. Больной лечился левомицетином, с другими больными дизентерией не контактировал. На третий день после начала лечения снова выделен возбудитель дизентерии, который оказался устойчивым одновременно к трём антибиотикам: левомицетину, тетрациклину и стрептомицину. Как могла возникнуть множественная лекарственная устойчивость у возбудителя дизентерии в данной ситуации? Как доказать предполагаемый вами механизм возникновения множественной лекарственной устойчивости.

Свойства бактериофагов. Природа - к какому царству живых существ относится? Строение - какую форму чаще всего имеет? Какие химические компоненты содержит? Структурные элементы бактериофага. Размеры - в каких единицах измеряется величина бактериофагов? Назовите фамилии учёных, открывших явление бактериофагии. Опишите фазы взаимодействия вирулентного (инфекционного) бактериофага с чувствительной к нему бактериальной клеткой. Как обнаружить действие бактериофага на бактерии в жидкой и плотной питательной среде? Как будет выглядеть положительный результат? Что такое титр бактериофага? Как определяют и обозначают титр бактериофага? Что такое умеренный бактериофаг, профаг, лизогенная культура, лизогенная конверсия, трансдукция? Опишите взаимодействие умеренного бактериофага с бактериальной клеткой. Применение бактериофагов в практической медицине - на каком свойстве оно основано? Назовите бактериофаги, применяющиеся для лечения, для диагностики, для фаготипирования.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки.

Заполните в тетради таблицы «Принципы классификации антибиотиков», «Механизмы развития приобретённой лекарственной устойчивости к антибиотикам». Перечислите принципы рациональной антибиотикотерапии и осложнения и побочные эффекты антибиотикотерапии.



Принципы классификации антибиотиков

№	Классификация	Примеры
По происхождению
1.
2…
По способу получения
1.
2…
По спектру действия
1.
2…
По эффекту действия на бактериальную клетку
1.
2…
По механизму действия (мишени)
1.
2…

Механизмы развития приобретённой лекарственной устойчивости к антибиотикам

Генетические	Фенотипические (биохимические)

Работа студента на практическом занятии

1. Знакомство с образцами химиотерапевтических препаратов и антибиотиков. Изучите химиотерапевтические препараты и антибиотики, имеющиеся в наборе. В отношении каждого препарата определите: происхождение (из грибов, из актиномицетов, из животных тканей, из бактерий, полусинтетический, синтетический), спектр действия (антибактериальный, противогрибковый, противовирусный), в каких единицах дозируется. Запишите в тетрадь.

2. Определение чувствительности стафилококка к пенициллину методом серийных разведений.

Цель опыта: по готовому посеву определить бактериостатическую концентрацию антибиотика; рассказать, что необходимо сделать для определения бактерицидной концентрации препарата.

Материал: готовый посев.

Ход опыта: описать.

Результат: определить и записать в виде таблицы.

Вывод: сформулировать.

3. Определение лекарственной устойчивости микроорганизмов методом стандартных дисков.

Цель опыта: определить лекарственную устойчивость культур кишечной палочки и стафилококка с помощью стандартных дисков; определить, в каких случаях устойчивость является природной, а в каких - приобретённой.

Материал: культуры кишечной палочки, стафилококка 209 Р, свежевыделенного от больного стафилококка.

Ход опыта: описать.

Результат: на следующем занятии измерить зоны отсутствия роста вокруг дисков, по таблице определите степень чувствительности микробов к каждому антибиотику. Запишите в тетрадь.

Вывод: сформулируйте в соответствии с поставленной целью.

4. Бактериофагия.

а) Ознакомьтесь с результатами действия бактериофага на бактерии по готовым посевам в жидкой и плотной питательной среде и обратите внимание на «стерильные пятна» - колонии бактериофага.

б) Определение титра бактериофага (учёт результатов демонстрационных посевов):

по Аппельману (в жидкой питательной среде) - определите титр бактериофага, составьте таблицу;

по Грациа (в плотной питательной среде) - сосчитайте стерильные пятна на чашке и с учётом разведения бактериофага определите титр.

Вывод: дайте оценку пригодности бактериофага по титру для практического применения.

в) Деловая игра - методика получения бактериофага. Продумайте последовательность действий, способы и необходимое оснащение для получения 100 литров дизентерийного бактериофага с титром 10-9. Каждый студент участвует в деловой игре, продумав и рассказав ход определённого этапа работы.

г) Ознакомьтесь с набором бактериофагов и определите, с какой целью и каким способом применяется каждый препарат.

Занятие 12. Антибиотики (окончание). Генетика микробов, генная инженерия, биотехнология

Способность микроорганизмов изменять свои свойства имеет непосредственное отношение к практической медицине, так как может оказать влияние на результаты лечения, диагностики и профилактики инфекционных заболеваний. В последние годы основные достижения генетики получены на модели микроорганизмов. Возникли новые научные направления - молекулярная генетика и генетическая инженерия. Развитие этих направлений позволило изучить тонкую структуру гена и обеспечивает возможность получения организмов с запланированными свойствами, лечения наследственных заболеваний человека и получение антибиотиков, гормонов, антител и других биологических веществ промышленным путём (биотехнология).

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения темы студент должен знать:

- структуру и особенности генома микроорганизмов;

- формы изменчивости микроорганизмов, условия, вызывающие изменение их свойств;

- внехромосомные генетические факторы, их свойства и роль в изменчивости микроорганизмов;

- значение изменчивости микроорганизмов для практической медицины.

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала темы необходимо знать основные законы генетики, тонкую структуру генов и механизмы, обеспечивающие их функционирование, а также нарушение функции генов в результате мутаций (биология); структуру и функции нуклеиновых кислот, ферменты, участвующие в реализации генетической информации (биохимия).

Цель занятия

1. Ознакомиться с особенностями генома бактериальной клетки, видами и формами изменчивости микроорганизмов.

2. Ознакомиться с практическим применением достижений генной инженерии.

План изучения темы

1. История развития учения о генетике микроорганизмов.

2. Формы изменчивости микроорганизмов.

3. Значение изменчивости микроорганизмов для теории и практики медицины.

После изучения темы студент должен уметь

Выявить проявления фенотипической изменчивости (модификации) у бактерий.

Интерпретировать результаты опытов по получению фено- и генотипической изменчивости у бактерий.

Учесть и оценить результаты ПЦР.

Дополнительный материал к занятию

Генетические методы диагностики инфекционных заболеваний

Идентификация нуклеиновых кислот

Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (НК) основывается на способности НК специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами гомологичных ДНК или РНК искусственно созданных нитей, меченных изотопами или ферментами (пероксидаза, щелочная фосфатаза).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). В случаях когда в исследуемом материале ДНК или РНК мало или недостаточно для того, чтобы установить её точную генетическую принадлежность, прибегают к полимеразной цепной реакции, основу которой составляет катализируемое ДНК-полимеразой многократное образование копий определённого участка ДНК. ПЦР была разработана в 1983 году американским учёным Керри Мюллисом. В 1993 году К. Мюллис за свои исследования был удостоен Нобелевской премии.

ДНК состоит из двух цепей, построенных из четырёх нуклеотидов: аденина, тимина, гуанина, цитозина (А, Т, Г, Ц). Последовательность нуклеотидов одной цепи комплементарна последовательности другой. У каждой цепи есть 3'- и 5'-концы. 3'-конец одной цепи связан с 5'-концом другой. ДНК-полимераза узнает азотистые основания в цепочке-матрице и наращивает вторую цепочку от 3'- к 5'-концу ДНК, делая подобие негатива. В среде, где производится синтез, должен присутствовать строительный материал - свободные нуклеотиды. ДНК-полимераза начинает работать только тогда, когда к цепи ДНК присоединяется праймер. Праймер представляет собой небольшую цепочку нуклеотидов, служащую затравкой для синтеза новой цепи. С матрицей она соединяется комплементарно. В праймере должно быть не менее 20-30 нуклеотидов: чем их больше, тем точнее выбирается антипоследовательность. Многократно повторяя эту операцию, полимераза способна удлинять 3'-конец праймера до тех пор, пока не достигнет 5'-конца матрицы. Однако если добавить в среду дидезоксинуклеотидтрифосфат (ddNTP), например, дидезоксиаденин (ddA), дальнейший рост цепи невозможен, поскольку к 3'-концу нуклеотиды присоединяться уже не могут.

Зная последовательность оснований, на его границе синтезируют праймер-антипоследовательность из 20-30 нуклеотидов. Их добавляют к препарату расплетённой ДНК, они связываются с родственным участком. С этого места начинает работать фермент-копировщик ДНК-полимераза. Чтобы ограничить нужный участок с другой стороны, с 3'-конца, нужны ddNTP четырёх типов. Копия антипараллельна, и по ней ДНК-полимераза движется в обратную сторону. Работу она начинает с праймера ко второму граничному участку (он должен быть антипоследовательностью, то есть таким же, как в матрице). Дойдя до конца, который был началом в предыдущем проходе, фермент уже во втором цикле выдаёт точную копию избранного участка. Полимераза копирует её в следующем цикле, потом обе копии, потом - 4 и т.д. Заставив полимеразу работать дальше побочных продуктов реакции - копий с длинными хвостами с обеих сторон, будет всё меньше. После 20 проходов будет около 1 миллиона копий нужного участка, а других фрагментов - лишь несколько десятков.

Техника ПЦР

Исследуемым материалом для ПЦР может быть культура бактерий, нуклеиновые кислоты, выделенные из клеток, биологические жидкости (кровь, моча), материал из внешней среды - вода, почва, пищевые продукты и т.д., содержащие ДНК или РНК.

На I этапе молекула ДНК разделяется нагреванием до 950С на 2 комплементарные нити.

На II этапе в реакционную смесь добавляют искусственно синтезированные ДНК-олигонуклеотидные праймеры двух типов. Одни из них комплементарны началу одной цепи ДНК, другие - концу второй. Одновременно вводится смесь 4 типов ddNTP. Праймеры соединяются с цепями ДНК.

На III этапе смесь нагревают до 700С и добавляют фермент ДНК-полимеразу (термостабильную), выделенную в 1980 году Калединым из бактерий Thermus aquaticus, живущих в горячих источниках. Этот фермент достраивает вслед за каждым праймером вторую цепь. Процесс удвоения повторяется 20-30 раз до получения миллиона копий исходной молекулы ДНК. Для проведения ПЦР применяются специальные термостаты - термальные циклеры, позволяющие многократно и быстро проводить нагревание и охлаждение исследуемых проб.

На IV этапе проводится оценка результатов ПЦР с помощью электрофореза в 1% геле с окраской фракций ДНК бромидом этидия, ярко светящимся в ультрафиолетовых лучах. Полученные электрофореграммы затем анализируются.

ПЦР наиболее эффективна для обнаружения микроорганизмов, трудно культивируемых в лабораторных условиях. Как правило, эти возбудители - внутриклеточные паразиты, длительно персистирующие в организме хозяина.

Контрольные вопросы

Дайте определение понятий «наследственность» и «изменчивость». Основные этапы развития учения о наследственности и изменчивости у микроорганизмов. Что такое генотип, фенотип? Особенности структуры генома прокариотов. Структурная модель ДНК по Уотсону и Крику. Что такое генетический код? Какими символами обозначается генотип и фенотип бактерий? Перечислите внехромосомные факторы наследственности. Перечислите бактериальные плазмиды; какие свойства они кодируют? Что такое трансмиссивные, нетрансмиссивные плазмиды? Что такое транспозоны, Is-последовательности? Формы изменчивости микроорганизмов: генотипическая и фенотипическая. Механизмы наследственной изменчивости бактерий: мутации и рекомбинации, виды рекомбинаций. Укажите фамилию учёного, опыты которого с пневмококками наметили пути для поиска материальной основы наследственности. Опишите механизм трансформации, трансдукции, конъюгации. Применение генетических методов в диагностике инфекционных заболеваний.

ЗАДАЧА. У больного К. с диагнозом бактериальная дизентерия в первый день заболевания выделен возбудитель дизентерии с типичными для этого вида биохимическими и другими свойствами (не ферментировал лактозу). Через два дня у этого же больного был выделен микроб, у которого все свойства были типичными для возбудителя дизентерии: у него появилась способность ферментировать лактозу. Какой генетический механизм возникновения у возбудителя дизентерии нового свойства можно предположить? Как доказать наличие предполагаемого вами механизма изменчивости?

Дайте определение понятий: молекулярная биология, биотехнология, генетическая инженерия. Опишите последовательность этапов генной инженерии. Укажите способы получения чистых генов для генетической инженерии; векторы (проводники) с помощью которых рекомбинантную ДНК можно ввести в клетку. Ферменты, с помощью которых можно расщеплять молекулу ДНК на отдельные фрагменты, «сшивать» отдельные фрагменты ДНК. Достижения генетической инженерии и биотехнологии: перечислите основные продукты, применяемые в медицине. Геномная инженерия: методы, достижения. Значение изменчивости микроорганизмов для практической медицины.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Составьте схему: «Формы изменчивости бактерий».

Работа студента на практическом занятии

1. Учёт посевов предыдущего занятия (см. занятие 11).

2. Опыт по выявлению спонтанных мутаций у бактерий.

Цель опыта: определить, имеются ли мутанты, устойчивые к стрептомицину, в культуре бактерий, которая не соприкасалась со стрептомицином.

Методика: на чашке с МПА производится рассев культуры бактерий с целью получения изолированных колоний. После суточного инкубирования в термостате выросшие колонии с помощью игольчатого штампа-репликатора переносятся на чашку с МПА, содержащим стрептомицин, и контрольную чашку. После суточного инкубирования в термостате учитывают результат.

Результат: зарисовать чашки с колониями.

Вывод: сформулировать.

3. Опыт конъюгации бактерий.

Цель опыта: определить, возможна ли конъюгация между данными штаммами.

ЗАДАЧА: получить прототрофный рекомбинант путём конъюгации двух ауксотрофных культур.

Материал: донор, ауксотроф по лейцину, реципиент - ауксотроф по треонину.

Методика: суточные бульонные культуры этих штаммов смешивают во флаконе и оставляют в термостате на 30-60 минут. В результате конъюгации от клеток донора к реципиенту передаются гены, кодирующие способность синтезировать треонин, и образуются прототрофные клетки. Для выявления этих клеток смесь бактерий высевают на среду, в которой отсутствуют лейцин и треонин (так называемая минимальная среда). Если конъюгация произошла, то на минимальной среде вырастут колонии прототрофных рекомбинантов. Донор и реципиент не вырастают.

Результат: нарисовать чашку с готовым результатом опыта.

Вывод: сформулировать.

4. Нарисовать в тетради схемы опытов трансформации и трансдукции.

5. Опыт бактериоциногении.

Цель: определить, какие из испытуемых культур кишечной палочки способны продуцировать колицины.

Методика: испытуемые культуры засеяны бляшками на чашке с МПА. После двухсуточной инкубации в термостате выросшие культуры убиты парами хлороформа. На поверхность посева наливается растопленный МПА, содержащий колицинчувствительную культуру. После инкубации в термостате учитывается результат по зонам отсутствия роста вокруг колоний колициногенных культур.

Результат: зарисовать.

Вывод: сформулировать (указать колициногенные культуры).

6. Диссоциация бактерий. Посмотреть с помощью бинокулярной лупы колонии эпидермального стафилококка: гладкие (S) и шероховатые (R). 

Раздел 4. Учение об инфекции. Иммунологические основы диагностики лечения и профилактики заболеваний

Темы практических занятий раздела «Учение об инфекции. Иммунологические основы диагностики лечения и профилактики заболеваний».

1. Инфекция. Экспериментальный метод исследования.

2. Иммунитет. Факторы врождённого иммунитета. Антигены.

3. Антитела. Реакции иммунитета: реакция нейтрализация токсинов антитоксинами, реакция преципитации, реакция агглютинации.

4. Реакция иммунного лизиса (иммунного бактериолиза, иммунного гемолиза). Реакция связывания комплемента. Реакции с мечеными компонентами: иммунофлюоресценция (РИФ), иммуноферментный анализ (ИФА), иммуноблоттинг, радиоиммунный анализ (РИА), иммунная электронная микроскопия (ИЭМ).

5. Медицинские биологические препараты для диагностики, профилактики и терапии инфекционных болезней.

6. Итог по разделу «Инфекция. Иммунологические основы диагностики лечения и профилактики заболеваний»

Содержание компетенций и планируемый пороговый уровень развития компетенций в результате изучения раздела «Учение об инфекции. Иммунологические основы диагностики лечения и профилактики заболеваний»

№	Код компетенции	Содержание компетенции (или её части)	В результате изучения дисциплины обучающиеся должны:
			Знать	Уметь	Владеть
1.	ПК-7	Способность и готовность применять методы асептики и антисептики, проводить санитарную обработку лечебных и диагностических помещений медицинских организаций	классификацию, морфологию и физиологию микроорганизмов и вирусов, их влияние на здоровье человека, методы микробиологической диагностики, применение основных антибактериальных и противовирусных препаратов, методы асептики и антисептики	пользоваться физическим, химическим и биологическим оборудованием для проведения санитарной обработки помещений медицинских организаций	алгоритмом применения методов асептики и антисептики
2.	ПК-11	Способность и готовность использовать методы оценки природных и медико-социальных факторов среды в развитии болезней у взрослого населения и подростков, осуществлять профилактические мероприятия по предупреждению инфекционных болезней	основные понятия и проблемы биосферы и экологии, феномен паразитизма и биоэкологические заболевания; функциональные системы организма человека, их регуляцию и саморегуляцию при воздействии с внешней средой в норме и патологии	работать с увеличительной техникой (микроскопами, оптическими и простыми лупами); проводить микробиологическую и иммунологическую диагностику	алгоритмом проведения профилактических мероприятий по предупреждению инфекционных болезней
3.	ПК-20	Способность и готовность осуществлять алгоритм выбора медикаментозной терапии больным с инфекционными заболеваниями	структурные и функциональные основы болезней и патологических процессов, причины, основные механизмы развития и исходов типовых патологических процессов, нарушений функций органов и систем	применять основные антибактериальные, противовирусные и биологические препараты; анализировать вопросы общей патологии и современные теоретические концепции и направления в медицине	принципы патогенетической терапии больных инфекционными заболеваниями
4.	ПК-31	Способность и готовность изучать научно-медицинскую информацию, отечественный и зарубежный опыт по тематике исследования	методы сбора, хранения и обработки научно-медицинской информации	производить расчёты по результатам эксперимента, проводить элементарную статистическую обработку экспериментальных данных, анализировать отчёты	базовыми технологиями преобразования информации: текстовые, табличные редакторы, поиск в сети Интернет

Занятие 13. Инфекция. Экспериментальный метод исследования

Освоение вопросов инфекции необходимо врачу для понимания патогенеза инфекционных заболеваний. Экспериментальный метод исследования в микробиологии применяется для изучения патогенности микроорганизмов, для выделения чистой культуры возбудителя из исследуемого материала, для испытания лечебного и профилактического действия химиотерапевтических и биологических препаратов.

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения темы студент должен знать:

- понятие об инфекции, формы инфекции;

- понятие о патогенности и вирулентности микроорганизмов, факторы вирулентности и способы их выявления;

- правила заражения и вскрытия животных.

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала студенту необходимо знать:

- виды симбиоза макро- и микроорганизмов;

- основные группы микроорганизмов из разделов «Морфология микроорганизмов», «Физиология микроорганизмов»;

- приготовление препаратов-мазков, окраска их по Граму.

Цель занятия

1. Ознакомиться с методами выявления факторов патогенности микроорганизмов.

2. Изучить особенности и динамику развития инфекционного процесса, формы его проявления, пути передачи.

3. Познакомиться с основными методами экспериментального заражения и бактериологического исследования трупов животных.

План изучения темы

1. Инфекция и инфекционный процесс.

2. Патогенность и вирулентность микроорганизмов. Факторы патогенности.

3. Экспериментальное заражение животных. Определение вирулентности микробов и силы токсина.

4. Роль макроорганизма, внешней и социальной среды в возникновении и развитии инфекционного процесса.

5. Динамика развития инфекционного процесса. Виды инфекционного процесса.

После изучения темы студент должен уметь

1. Соблюдая правила асептики, провести бактериологическое исследование трупа лабораторных животных.

2. Определить форму инфекционного процесса у экспериментального животного при бактериологическом исследовании трупа.

Дополнительный материал к занятию

Методы изучения факторов вирулентности бактерий и силы токсинов

Биологические пробы на лабораторных животных для определения силы токсина (дерматонекротическая проба на лабораторных животных, кератоконъюнктивальная проба, определение DLM токсина).

Посев культуры на кровяной агар для определения продукции гемолизинов.

Определение ферментов, обусловливающих инвазивность бактерий:

плазмокоагулаза определяется в реакции плазмокоагуляции с цитратной кроличьей плазмой;

гиалуронидаза определяется по способности культуры гидролизовать гиалуроновую кислоту;

лецитиназу определяют на среде ЖСА (желточно-солевой агар) по наличию венчика вокруг колонии;

ДНК-азу определяют на питательной среде, в которую добавляют раствор ДНК, по просветлению среды вокруг колонии после нанесения на поверхность среды HCl.

4. Определение факторов персистенции микроорганизмов (антилизоцимной, антикомплементарной, антитрипсиновой, антиинтерфероновой, антикарнозиновой, антитромбоцитарной, антииммуноглобулиновой, антигистоновой активности).

Заражение лабораторных животных проводят для:

моделирования инфекционных заболеваний;

выделения чистой культуры возбудителя болезни:

определения факторов вирулентности и измерения летальной дозы;

проверки качества вакцин, иммунных сывороток, фармпрепаратов, антибактериальных препаратов.

Заражение животных производят разными способами (подкожно, внутрикожно, накожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, через рот, в мозг, интраорбитально и др.) в зависимости от задач исследования и используемых животных.

Контрольные вопросы

Формы симбиоза микро- и макроорганизма. Дайте определение понятий «инфекционный процесс» и «инфекционное заболевание». Условия, от которых зависит возникновение, течение и исход инфекционного процесса. Перечислите положения «триады Генле-Коха». Что такое патогенность микроба? Вирулентность микробов, единицы её измерения. Какая разница между понятиями патогенность и вирулентность микробов? Какой микроб более вирулентен: с DLM 1 миллиард микробных клеток или с DLM 250 млн. микробных клеток? Как можно понизить вирулентность микробов? Как повысить вирулентность микробов? Дайте определение: факультативные внутриклеточные паразиты и облигатные внутриклеточные паразиты, приведите примеры. Факторы вирулентности микробов. Что такое адгезивность микробов и с какими факторами связано это свойство? Что такое инвазивность микробов и с какими факторами связано это свойство? Что такое антифагоцитарная активность микробов и с какими факторами это связано? Какие факторы обеспечивают персистенцию микроорганизмов в организме хозяина? Дайте характеристику экзотоксинов и эндотоксинов: образование, получение, химическая природа, сила действия, избирательность действия, антигенность, реакция на действие формалина и тепла. Анатоксин, его получение и основные свойства. Перечислите токсигенные бактерии. Пирогены бактериального происхождения, их характеристика, применение в медицине; в каких препаратах присутствие пирогенов является нежелательным? Как определяется пирогенность воды и растворов? Понятие об условно-патогенных микробах, примеры. Влияние состояния макроорганизма и условий внешней среды на течение инфекционного процесса. Возможные исходы заражения. Формы инфекционного процесса в зависимости от наличия клинических проявлений. Что такое экзогенная инфекция, эндогенная инфекция, аутоинфекция? Формы инфекции в зависимости от локализации возбудителя в организме хозяина, в зависимости от продолжительности взаимодействия возбудителя с макроорганизмом. Что такое рецидив, реинфекция, суперинфекция, вторичная инфекция? Понятие о бактериемии, септицемии, септикопиемии, токсинемии. Если ввести кровь больного ботулизмом человека в организм мыши, то она заболевает и погибает: чем вызывается гибель мыши? Как называется состояние организма, которое возникает у мыши? Укажите признаки, по которым инфекционные болезни отличаются от неинфекционных. Периоды течения инфекционного заболевания. Основные формы взаимодействия возбудителей при смешанных инфекциях. Перечислите основные особенности вирусных инфекций. Типы вирусной инфекции. Каким термином обозначается вирулентность вирусов? Определение понятия внутрибольничные (госпитальные) инфекции. Какие микроорганизмы (патогенные или условно-патогенные) чаще всего их вызывают? Определение понятия «госпитальные штаммы» и их основные свойства. Условия, способствующие возникновению внутрибольничных инфекций. В каких целях используется экспериментальный метод исследования? Какие животные чаще всего используются для экспериментов в микробиологических лабораториях? Правила отбора и подготовки животных для экспериментального заражения. Какие меры предосторожности следует соблюдать при заражении животных? Назовите методы заражения животных. Какова цель бактериологического исследования трупа экспериментального животного? Какие условия соблюдаются при бактериологическом исследовании трупа? Почему исследуемый материал не должен соприкасаться с дезинфицирующими веществами?

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Составьте схему «Основные факторы вирулентности микробов».

Работа студента на практическом занятии

1. Изучение факторов вирулентности микробов. Определение плазмокоагулазы: культуру стафилококка засеять в пробирку с цитратной плазмой кролика, в контроле оставить незасеянную плазму. Результаты учесть через два часа. В тетради описать ход опыта, результат и сделать вывод.

2. Изучение демонстрационных посевов стафилококков и стрептококков на кровяном агаре, объяснить причину образования зон гемолиза вокруг колоний.

3. По таблице определить DLM экзотоксина, записать в тетрадь. По таблице определить DLM и вычислить LD50 микробов. Записать в тетрадь.

4. Изучить схемы заражения экспериментальных животных.

5. Внимательно ознакомиться с процессом вскрытия трупа заражённого животного. Протокол вскрытия записать в тетрадь.

Занятие 14. Иммунитет. Факторы врождённого иммунитета. Антигены

Для врача очень важно иметь представление об иммунитете как о способе защиты постоянства внутренней среды организма от генетически чужеродных агентов, в том числе от патогенных микроорганизмов. Иммунология внесла значительный вклад в такие области современной медицины, как переливание крови, вакцинация, трансплантация органов, лечение аллергии, аутоиммунных болезней и рака. Мощным фактором защиты организма от микроорганизмов является врождённый (видовой) иммунитет, который представляет собой совокупность анатомо-физиологических приспособлений организма. Приобретённый иммунитет формируется в результате попадания или введения в организм антигена. Студент должен знать, какие же вещества могут выступать в роли антигена, как получить антиген.

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения темы студент должен знать:

- определение понятия иммунитет, виды иммунитета;

- клеточные и гуморальные факторы врождённого (видового) иммунитета;

- антигены, способы их получения и практическое применение.

Исходный уровень знаний

Из курса биологии и гистологии вспомнить клетки крови, их морфологию; приготовление мазка из крови, фиксацию, окраску.

Цель занятия

1. Познакомиться с клеточными и гуморальными механизмами врождённого иммунитета (фагоцитоз, лизоцим, комплемент, интерфероны).

2. Освоить методы оценки факторов врождённого иммунитета организма человека.

3. Выработать чёткое преставление об антигенах, их разнообразии, свойствах.

План изучения темы

1. Иммунитет, виды иммунитета.

2. Факторы врождённого иммунитета.

3. Антигены, свойства антигенов, методы получения.

В процессе самоподготовки используйте конспект лекций, учебник, руководство к практическим занятиям. Просмотрите дополнительный материал в пособии, ответьте на контрольные вопросы и решите задачи.

После изучения темы студент должен уметь

1. Оценить факторы врождённого иммунитета организма (гуморальные и клеточные).

Дополнительный материал к занятию

Методы оценки функциональной активности фагоцитирующих клеток

Количественную оценку фагоцитарной активности лейкоцитов проводят в цельной крови, или в лейкоцитарной взвеси, или в обогащенных фракциях фагоцитирующих клеток. В качестве стандартных объектов фагоцитоза используют мелкодисперсные частицы латекса диаметром от 1,0 до 2,0 мкм, суспензию убитых нагреванием клеток бактерий или дрожжеподобных грибов.

Определение фагоцитарной активности полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови

В микропипетку набирают 0,05 мл 2% цитрата натрия и 0,1 мл крови, выливают в пробирку. Добавляют 0,05 мл 2-миллиардной взвеси убитых стафилококков. Пробирку помещают на 30 минут в термостат, после чего встряхивают, готовят мазки, фиксируют их смесью Никифорова и окрашивают метиленовым синим (1% раствор, разведённый 1:4) в течение одной минуты. Мазки микроскопируют, находят 25 нейтрофилов и подсчитывают: процент активных фагоцитов (фагоцитарная активность) - количество нейтрофилов, фагоцитировавших стафилококки, по отношению к 25 изученным нейтрофилам; фагоцитарное число - среднее число стафилококков на один нейтрофил (общее число фагоцитированных стафилококков разделить на 25). Запись удобно вести в сетке (5 клеток х 5 клеток).

Количественная проба на лизоцим в сыворотке крови

В контрольную пробирку налить 0,5 мл физиологического раствора. Этой же пипеткой в опытную пробирку налить 0,5 мл инактивированной сыворотки крови. В обе пробирки добавить по 0,5 мл взвеси микрококка. Встряхнуть. При наличии в сыворотке лизоцима просветление в опытной пробирке появляется через несколько минут.

Контрольные вопросы

Определение понятия иммунитет. Виды иммунитета в зависимости от способа его формирования. Виды иммунитета в зависимости от агента, против которого он направлен. Врождённый (естественный) иммунитет является видовым или индивидуальным, специфическим или неспецифическим, может ли передаваться по наследству? Назовите основные факторы врождённого иммунитета. Автор фагоцитарной теории, основные положения этой теории. Какие клетки обладают фагоцитарной активностью? Фазы фагоцитарного процесса. Какими показателями определяют фагоцитарную активность лейкоцитов (показатель, название, сущность). Какое различие между завершённым и незавершённым фагоцитозом? При каких заболеваниях наблюдается незавершённый фагоцитоз? Укажите факторы, усиливающие фагоцитоз. Опсоно-фагоцитарная реакция - принцип реакции, методика постановки. Что такое опсонический индекс? Перечислите гуморальные защитные факторы крови. Лизоцим: автор, открывший его (в каком материале), химическая природа, отношение к нагреванию, где содержится в организме, какие клетки продуцируют его, что происходит с бактериями под действием лизоцима, влияет ли он на вирусы? Комплемент, его химическая природа, отношение к нагреванию, из каких фракций состоит, где содержится в организме; основные пути активации комплемента; какое участие принимает в реакциях иммунитета; что происходит с бактериями при действии комплемента; укажите животное, которое используется для получения комплемента; при какой температуре и в течение какого времени можно разрушить (инактивировать) комплемент. Как называется сыворотка крови, прогретая при таком режиме? Приобретённый иммунитет, его характеристика: видовой или индивидуальный, специфический или неспецифический, передаётся ли по наследству, функция какой системы (ткани) лежит в основе формирования приобретённого иммунитета?

...