Микробиология и вирусология

Образования ацетоина (ацетил-метил-карбинола) при ферментации глюкозы проводится с помощью реакции Фогес-Проскауэра. Добавление к культуре 40% КОН и 5% альфа-нафтола даёт красное окрашивание, т.е. в щелочных условиях ацетоин образует с альфа-нафтолом соединение красного цвета - ацетилметилкарбинол.

Утилизацию цитрата с целью выявления способности бактерий использовать его как источник углерода проверяют на среде Симмонса. Среда содержит набор солей, агар, неорганический источник азота, цитрат натрия, индикатор бромтимоловый синий. При наличии фермента цитрат-пермеазы среда подщелачивается и окрашивается в синий цвет. При отсутствии роста бактерий среда остается зеленой.

Каталаза - это фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и кислорода. Каталазу содержат аэробы и факультативные анаэробы, но она отсутствует у облигатных анаэробов. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешивания микробных клеток с 1% раствором перекиси водорода. На предметное стекло помещают каплю перекиси водорода и суспендируют в ней небольшое количество культуры микроорганизмов, выращенной на плотной среде.

Обнаружение цитохромоксидазы у аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов проводится путём нанесения и растирания петли культуры на индикаторную бумажку, пропитанную спиртовым раствором альфа-нафтола и 1% водным раствором ментола. При положительном результате бумажка синеет.

Выявление нитратредуктазы характерно в основном для факультативных анаэробов. Фермент восстанавливает нитраты в нитриты. Нитрат является конечным акцептором электронов. В кислой среде нитраты окисляют йодид калия. Выделившийся йод, реагируя с крахмалом, даёт синее окрашивание среды.

Тест окисления/ферментации глюкозы (в аэробных/анаэробных условиях) устанавливается на среде Хью-Лейфсона. В среде содержится агар, соли, пептон, глюкоза и индикатор бромтимоловый синий. Посев осуществляют уколом в столбик питательной среды в две пробирки. Для создания анаэробных условий после посева среда в одной из пробирок заливается слоем стерильного вазелинового масла. Посев выращивают 3-4 суток. Образование кислоты из глюкозы изменяет зеленый цвет среды в жёлтый. При окислении глюкозы изменение цвета происходит в верхней части пробирки без вазелинового масла. При ферментации меняется цвет среды под слоем вазелинового масла (в анаэробных условиях). Тест используется для дифференциации аэробных бактерий от анаэробов и факультативных анаэробов. Аэробы (например, Pseudomonas aeruginosa) расщепляют глюкозу в аэробных условиях, то есть только окисляют глюкозу, но не ферментируют её; анаэробы (например, Clostridium perfringens) утилизируют глюкозу только в анаэробных (т.е. ферментируют). Факультативные анаэробы (например, Escherichia coli, Staphylococcus aureus) утилизируют глюкозу в аэробных и анаэробных условиях.

Гемолитические свойства микроорганизмов (способность микроорганизмов разрушать эритроциты) изучают при посеве их на среды с кровью. Жидкие среды при разрушении эритроцитов становятся прозрачными, а на плотных средах вокруг колоний появляется прозрачная зона (гемолиз). Кровяной агар Цейсслера (для культивирования анаэробов) состоит из мясо-пептонного агара с 1% глюкозы на 20% свежей дефибринированной крови. Возбудитель газовой гангрены образует зону гемолиза вокруг колоний. Гемолитические штаммы стафилококков и стрептококков дифференцируют на кровяном агаре по наличию альфа- (неполного) или бета- (полного) гемолиза вокруг колонии.

В последние годы для изучения биохимической активности выпускаются наборы систем индикаторных бумажных, микротест-системы и другие подобные системы одноразового использования, которые позволяют изучить ферментный профиль микробов.

Системы индикаторные бумажные (СИБ) представляют собой наборы бумажных дисков для выявления самых разнообразных ферментов бактерий. Диски пропитаны субстратом (углеводами, аминокислотами, цитратом, ацетатом, малонатом и другими веществами), а также содержат индикатор. Полную петлю исследуемой культуры или каплю густой микробной взвеси вносят в стерильный физиологический раствор (в некоторых случаях в забуференный: рН 5,4-5,6) либо в 1% пептонную воду и помещают в эту пробирку соответствующий диск. В контрольные пробирки культуру бактерий не вносят. Для определения сероводорода диск помещают в пробирку на поверхность МПА, засеянного уколом, что позволяет одновременно определить подвижность. После инкубации в термостате оценивают результаты тестов по изменению цвета среды и диска. Утилизация вещества приводит к изменению цвета индикатора. Во всех пробирках учитывают предварительный результат в тот же день и окончательный - через восемнадцать-двадцать четыре часа. Имеются наборы, которые содержат от десяти до тридцати тест-бумажек.

Диагностические микротест-системы (МТС), типа API-20-Е (для энтеробактерий), API-32-Gr+, ID32 GN, Enterotube и другие. Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, или планшеты, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды или только субстраты и индикаторы. Стерилизацию МТС проводят ультрафиолетовым облучением. Существует два основных типа таких систем. Это индивидуальные системы, рассчитанные на идентификацию одной культуры. К ним относятся тест-системы ПБДЭ, ПБДС (Россия), системы API (Франция) и многие другие. Второй тип систем основан на использовании многорядных планшетов, позволяющих одновременно проводить идентификацию нескольких культур. К системам этого типа относятся тест-системы фирмы Lachema (Чехия), ММТ Е (Россия), Enterotube II (США) и др. В каждую ячейку засевают взвесь культуры бактерий определённой густоты. В контрольные ячейки наливают физиологический раствор. Инкубация тест-систем проводится в обычных термостатах или в специальных термостатируемых устройствах, входящих в комплект автоматизированных систем, где учёт результатов и их интерпретация осуществляется автоматически с помощью компьютера (Vitek, BioMerieux, Франция). Результат учитывают после 3-4-часовой инкубации в термостате визуально или при использовании автоматизированной компьютерной системы по изменению цвета индикатора. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях.

Идентифицируемые микроорганизмы	Тест-система	Время инкубации, ч
Энтеробактерии	ПБДЭ ММТ Е-1, 2 Энтеротест 1, 2 API 20 Е Enterotube II	18-24 24 18-24 24-48 18-24
Стафилококки	ПБДС Стафи-тест API Staph	24 24 24
Стрептококки и энтерококки	Стрепто-тест API 20 Strep	24 4-24
Коринебактерии	API Coryne	24
Анаэробы	Анаэро-тест API 20 А Rapid Anaerobe	48 24 4
Грибы	API 20 С	72

Санитарная микробиология - раздел медицинской микробиологии, изучающей микрофлору окружающей среды и ее влияние на здоровье человека. Санитарная микробиология разрабатывает методы контроля за состоянием воды, почвы, воздуха, пищевых продуктов и различных предметов обихода. Одновременно санитарная микробиология разрабатывает микробиологические нормативы и мероприятия по оздоровлению окружающей среды.

Практическая санитарная микробиология использует 2 основных метода оценки санитарно-эпидемиологического состояния внешней среды: прямое обнаружение патогенных микроорганизмов и выявление косвенных признаков пребывания патогенов во внешней среде.

Непосредственное обнаружение патогенных микроорганизмов, как правило, затруднено из-за их малого количества и проводится по эпидпоказаниям. Косвенные методы - это определение общей микробной обсеменённости или общего микробного числа (ОМЧ), а также определение и титрование санитарно-показательных микроорганизмов (СПМ), которые регулярно проводятся контролирующими органами с целью определения безопасности объектов для здоровья населения.

ОМЧ расценивается как показатель интенсивности загрязнения окружающей среды органическими веществами.

Санитарно-показательными называют микроорганизмы, по которым можно косвенно судить о возможном присутствии патогенов в окружающей среде.

Санитарно-показательные микроорганизмы должны удовлетворять следующим характеристикам

Постоянно обитать в естественных полостях человека и животных и выделяться в окружающую среду.

Не должны размножаться вне организма, исключая пищевые продукты.

Длительность их выживания в окружающей среде должна быть не меньше и даже несколько больше, чем у патогенных микроорганизмов.

Устойчивость санитарно-показательных микроорганизмов в окружающей среде должна быть аналогичной или превышать таковую у патогенных микроорганизмов.

У санитарно-показательных микроорганизмов не должно быть в окружающей среде «двойников».

Микроб не должен изменяться в окружающей среде.

Методы индикации и идентификации санитарно-показательных микроорганизмов должны быть простыми.

Содержание санитарно-показательных микроорганизмов в исследуемых объектах оценивается по их титру и индексу.

Методы проведения санитарно-микробиологических исследований

(предусматривают определение общей микробной обсеменённости (ОМЧ), определение и титрование санитарно-показательных микроорганизмов).

Санитарно-микробиологическое состояние почвы оценивается на основании сопоставления количества термофильных бактерий и бактерий - показателей фекального загрязнения. Почвы с преобладанием санитарно-показательных бактерий расцениваются как санитарно-неблагополучные, загрязнённые фекалиями человека или животных. Присутствие в почве E. coli и Enterococcus faecalis указывает на свежее (до 2 недель), бактерий родов Citrobacter и Enterobacter - на несвежее (до 2 месяцев), а Clostridium perfringens - на давнее (более 2 месяцев) фекальное загрязнение. Более точная оценка проводится с помощью определения коли-индекса - количество бактерий группы кишечной палочки (БГКП), обнаруженных в 1 г почвы, перфрингенс-титра - масса почвы (в граммах), в которой обнаружена 1 особь Clostridium perfringens, общего числа сапрофитных, термофильных и нитрифицирующих бактерий в 1 г почвы.

Микробиологические нормативы для оценки санитарного состояния почвы:

- чистая почва: коли-титр - 1 и выше; перфрингенс-титр - 0,01 и выше; ОМЧ - 100-1000;

- загрязнённая почва: коли-титр - 0,9-0,01; перфрингенс-титр - 0,009-0,0001; ОМЧ - 1000-100000;

- сильно загрязнённая почва: коли-титр - 0,009 и ниже; перфрингенс-титр - 0,00009 и ниже; ОМЧ - 10000-4000000.

Для определения ОМЧ почву берут на глубине 10-15 см стерильным ножом (из разных мест не менее 10 проб) в стерильную банку. Из проб готовят навеску 30 г, которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Готовят разведения 10-3, 10-4, 10-5. Из 2-х последних разведений 0,1 мл смешивают с 40 мл 0,7% расплавленного и остуженного до 450С МПА, после чего выливают двойным слоем в чашки с 2% агаром. Инкубируют в термостате. Подсчитывают количество выросших колоний.

Для определения коли-титра, перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера. Инкубируют при 430С 48 часов. При получении в средах газообразования и помутнения производят высев петлей на среду Эндо. Отбирают типичные для кишечной палочки колонии, делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. При выявлении в мазках грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Если проба отрицательная, проверяют ферментативные свойства выделенной культуры посевом на полужидкую среду с глюкозой. Появление в среде кислоты и газа подтверждает наличие E. coli. Определяют коли-титр по наименьшему объёму, в котором обнаруживают БГКП.

Для определения перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии засевают в пробирки со стерильной железосульфитной средой Вильсон-Блера. После 48 часов инкубации при 430С учитывают результаты по образованию черных колоний C. perfringens в агаровом столбике среды. Мазки окрашивают по Граму, микроскопируют (крупные грамположительные палочки со спорами овальной формы, центрального или субтерминального расположения), вычисляют перфрингенс-титр (наибольшее разведение посевного материала, посев которого приводит к почернению и разрыву среды в первые 12 часов роста при 430С).

Санитарно-микробиологическое состояние питьевой воды оценивается по общему микробному числу (ОМЧ) - количеству мезофильных факультативно-анаэробных микроорганизмов (МЕФАМ) в 1 мл воды; присутствию общих и термотолерантных колиформных бактерий.

По эпидемиологическим показаниям, в воде дополнительно определяют наличие энтерококков, сальмонелл, шигелл, вибрионов, энтеровирусов.

Определение общего числа микроорганизмов

Общее микробное число (ОМЧ) - общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов, способных образовывать колонии на питательном агаре при t=370С в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза.

Из каждой пробы воды делают посев не менее двух объёмов по 1 мл. Для этого 1 мл воды вносят в стерильную чашку Петри, заливают 6-8 мл расплавленного и остуженного до 45-460С питательного агара, тщательно перемешивают. После застывания агара чашки помещают вверх дном и инкубируют при 370С в течение 24 часов. Затем подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Подсчитанное количество колоний на каждой чашке суммируют и делят на 2. Результат выражают в КОЕ (колониеобразующих единиц) в 1 мл исследованной пробы воды.

Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий

К общим колиформным бактериям относятся грамотрицательные, не образующие споры палочки, не обладающие оксидазной активностью ферментирующие лактозу или маннит с образованием альдегида, кислоты и газа при 370С в течение 24 часов.

Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками общих колиформных бактерий, но, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при 440С в течение 24 часов.



Микробиологические и паразитологические показатели питьевой воды (согласно СанПиНу 2.1.4.559-96)

Показатели	Единицы измерения	Нормативы
Общее микробное число 2	число образующих колонии бактерий (колониеобразующих единиц - КОЕ) в 1 мл	не более 50
Общие колиформные бактерии 2	число бактерий в 100 мл	отсутствие
Термотолерантные колиформные бактерии	число бактерий в 100 мл	отсутствие
Колифаги 3	число бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 100 мл	отсутствие
Споры сульфитредуцирующих клостридий 4	число спор в 20 мл	отсутствие
Цисты лямблий 3	число цист в 50 л	отсутствие

Примечания: 1 - при определении проводится 2-кратное исследование по 100 мл отобранной пробы воды; 2 - превышение норматива не допускается в 95% проб, отбираемых в точках водоразбора наружной и внутренней водопроводной сети в течение 12 месяцев, при количестве исследуемых проб не менее 100 за год; 3 - определение проводится только в системах водоснабжения из поверхностных источников перед подачей воды в распределительную сеть; 4 - определение проводится только при оценке эффективности технологии обработки воды.

Метод мембранных фильтров

Мембранный фильтр помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуумному насосу. Воду фильтруют в объёме 333 мл. Затем фильтры Зейтца помещают на поверхность среды Эндо в чашки Петри и после инкубации при 370С в течение суток подсчитывают количество выросших колоний, типичных для БГКП. Из 2-3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadaceae и других оксидазоположительных бактерий, обитающих в воде. Для этого фильтр с выросшими на нём колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-n-фенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает колонию в синий цвет. 2-3 колонии, не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5% раствором глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 370С. При наличии газообразования подсчитывают число красных колоний на фильтре.

Бродильный метод

Засевают 3 объёма воды по 100 мл (для качественного анализа) или при исследовании воды с целью количественного определения общих колиформных бактерий делают посев 3 объёмов по 100 мл, 3 - по 10 мл и 3 - по 1 мл.

Посев 100 мл и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 мл воды - в 10 мл среды обычной концентрации.

Посевы инкубируют при 370C в течение 24-48 часов. Через 24 часа из питательной среды, где отмечено наличие роста и образование газа, делают высев по секторам на среду Эндо, приготовленную с добавлением фуксина.

Положительный результат на присутствие общих колиформных бактерий в данном объёме воды дают по помутнению и образованию газа на среде накопления (глюкозо-пептонная среда или лактозо-пептонная среда) и наличию красных колоний на среде Эндо. В сомнительных случаях выполняют оксидазный тест и подтверждают способность к газообразованию на среде с лактозой или маннитом (глюкозой).

Результат отрицательный, если

- в среде накопления нет признаков роста,

- на секторах среды Эндо нет роста лактозоположительных колоний,

- на секторах среды Эндо выросли нехарактерные для колиформных бактерий колонии,

- все колонии оказались оксидазоположительными,

- если в подтверждающем тесте на среде с лактозой или маннитом (глюкозой) не отмечено газообразования.

Наиболее вероятное число (НВЧ) бактерий (общих и термотолерантных колиформных бактерий) - вычисляют по специальным таблицам.

Санитарно-микробиологическое состояние воздуха закрытых помещений оценивают по общему микробному числу (ОМЧ) - количеству особей, обнаруживаемых в 1 м3 воздуха, наличию санитарно-показательных бактерий: гемолитических стрептококков, золотистых стафилококков, а также дрожжевых и плесневых грибов.

Согласно СанПиН 2.1.3.1375-03, воздушная среда помещений лечебных учреждений и аптек по уровню бактериальной обсемененности разделена на 4 класса.

Микробиологические показатели для оценки воздушной среды аптечных учреждений можно определить путем посева воздуха седиментационным (по Коху) или аспирационным методом (в аппарате Кротова).

Допустимые уровни бактериальной обсеменённости воздушной среды помещений лечебных учреждений в зависимости от их функционального назначения и класса чистоты

Класс чистоты	Название помещений	Санитарно-микробиологические показатели
		общее количество микроорганизмов в 1 м3 воздуха (КОЕ/м3)	количество колоний S.aureus в 1 м3 воздуха (КОЕ/м3)	количество плесневых и дрожжевых грибов в 1 дм3 воздуха
		До начала	Во время работы	До начала	Во время работы	До начала	Во время работы
Особо чистые (А)	Операционные, родильный зал, асептические боксы для гематологических, ожоговых больных, палата для недоношенных, асептический блок аптек, стерилизационные (чистая половина) боксы бактериологических лабораторий	не более 200	не более 500	не должно быть	не должно быть	не должно быть	не должно быть
Чистые (Б)	Процедурные, перевязочные, предоперационные, палаты реанимации, залы реанимации, детские палаты, комнаты сбора и пастеризации грудного молока, ассистентские и фасовочные аптек, дистилляторная, помещения бактериологических и клинических лабораторий, предназначенные для исследований	не более 500	не более 750	не должно быть	не должно быть	не должно быть	не должно быть
Условно чистые (В)	Палаты хирургических отделений; коридоры, примыкающие к операционным и родильным залам; смотровые, боксы и палаты инфекционных отделений, ординаторские, материальные, кладовые чистого белья	не более 750	не более 1000	не должно быть	не более 2	не должно быть	не должно быть
Грязные (Г)	Коридоры и помещения административных зданий, лестницы, лечебно-диагностические, санитарные комнаты, туалеты, комнаты грязного белья	Не нормируются

Седиментационный метод (по Коху) - оседание микробов под действием силы тяжести - является простым способом изучения микрофлоры воздуха. Он заключается в том, что чашки Петри со средой оставляют открытыми на определённое время (5-10 минут на общую обсеменённость и не менее 40 минут на кокковую микрофлору), затем их закрывают, маркируют и выдерживают 24 часа в термостате и 24 часа при комнатной температуре. Количество выросших колоний соответствует степени загрязнённости воздуха: по приблизительному подсчёту на площадь 100 см2 в течение 5 минут оседает столько микробов, сколько их содержится в 10 л воздуха.

Аспирационный метод - более точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляется с помощью приборов. Аппарат Кротова устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью просасывается через узкую щель плексигласовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорганизмами равномерно фиксируются на всей поверхности среды благодаря постоянному вращению чашки под входной щелью.

После инкубации посева в термостате проводят расчет микробного числа по формуле:

где N - количество выросших на чашке колоний;

V - объём пропущенного через прибор воздуха, дм3;

1000 - искомый объём воздуха, дм3.

Наличие санитарно-показательных для воздуха микроорганизмов - золотистого стафилококка, гемолитического стрептококка, плесневых грибов, кандид - определяют по характеру выросших колоний на специальных средах (желточно-солевом агаре, кровяном агаре, среде Сабуро) и при микроскопическом изучении бактерий из этих колоний.

Контрольные вопросы

Каковы особенности ферментных систем бактерий? Как регулируется продукция ферментов у бактерий? Какие группы ферментов различают в зависимости от механизма, которым регулируется продукция фермента? Какое практическое значение имеет изучение ферментативной активности бактерий? Методы изучения сахаролитической и протеолитической активности бактерий. Дифференциально-диагностические среды: перечислите, назовите основные составные части и применение. На какое изменение среды реагирует индикатор в этих средах? По какому признаку дифференцируются бактерии на средах Эндо, Левина, Плоскирева? Каким свойством должны обладать бактерии, чтобы образовать на этих средах окрашенные колонии? Если бактерии образуют бесцветные колонии, что это означает? Среды Гисса их состав и применение. Что такое «пёстрый» или «цветной» ряд? Среда Олькеницкого, её состав; как производится посев и как отмечают на этой среде ферментацию разных углеводов, образование сероводорода? Что представляют собой микротест-системы для определения ферментативной активности микробов; как производят посев и как учитывают результаты? Что такое СИБ; как используется эта система, как производится посев и учёт результатов? Укажите основные объекты внешней среды, которые подвергаются санитарно-бактериологическому исследованию. Микробиоценоз, определение понятия. Перечислите и дайте характеристику межвидовых взаимоотношений в микробиоценозах. Какие показатели определяются при бактериологической оценке объектов внешней среды? Санитарно-показательные микроорганизмы: определение понятия. Какими свойствами должны обладать санитарно-показательные микроорганизмы? Перечислите санитарно-показательные микроорганизмы для воздуха, воды, почвы. Микрофлора воды: постоянная микрофлора, источники загрязнения. Показатели для санитарно-бактериологической оценки воды. Методика определения общего микробного числа воды. Показатели фекального загрязнения воды, методы их определения. Укажите предельно допустимые показатели для питьевой воды. Микрофлора воздуха: постоянная микрофлора, источники загрязнения. Показатели для санитарно-бактериологической оценки воздуха, методы их определения. Микрофлора почвы: постоянная микрофлора, её значение для круговорота веществ в природе. Источники загрязнения почвы патогенными микроорганизмами. Показатели для санитарно-бактериологической оценки. Для каких заболеваний факторами передачи могут быть вода, воздух, почва? Некультивируемые формы бактерий: определение понятия, практическое значение.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Выпишите названия (по-латыни) видов санитарно-показательных микроорганизмов для воды, воздуха и почвы.

Работа студента на практическом занятии

1. Выделение чистой культуры бактерий-аэробов (3-й день). Изучите культуру на скошенном агаре макроскопически, приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте, сделайте вывод о чистоте культуры. Для дальнейшей идентификации выделенной культуры произведите посев на среды «пёстрого» ряда и на среду Олькеницкого. Изучите готовые посевы аэробных бактерий на средах «пёстрого» ряда и на среде Олькеницкого, составьте таблицу «Биохимическая активность микроорганизмов». Ознакомьтесь с методикой изучения ферментативной активности бактерий с помощью микротест-систем и СИБ.

2. Выделение чистой культуры анаэробов (4-й день). Изучите характер роста культуры на среде Китта-Тароцци, приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте.

3. Исследование микрофлоры воды и воздуха. Произведите посев водопроводной воды для определения общего микробного числа (ОМЧ). Определите показатели фекального загрязнения воды (наличие колиформных бактерий) по демонстрационным посевам и по таблице. Произведите посев воздуха лаборатории седиментационным методом и с помощью аппарата Кротова.

4. Методы изучения нормальной микрофлоры организма человека (подготовка к следующему занятию). Возьмите стерильным тампоном слизь из зева друг у друга и сделайте посев в пробирку с сахарным мясо-пептонным бульоном. Сделайте посев с кожи рук на чашку с МПА: возьмите маленький стерильный ватный тампон, смочите его в стерильном физиологическом растворе, протрите кожу, сделайте посев этим тампоном.

Занятие 9. Санитарно-бактериологическое исследование воды и воздуха (окончание). Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы. Нормальная микрофлора организма человека

В медицинской практике для уничтожения микробов в объектах внешней среды широко применяются физические и химические факторы. Поэтому врачу необходимо знать отношение различных микроорганизмов к физическим факторам и химическим веществам для того, чтобы правильно выбрать способ уничтожения микробов во внешней среде или, наоборот, сохранения их жизнедеятельности. Микроорганизмы заселяют организм человека сразу после рождения и всю жизнь сопровождают его. Видовой состав нормальной микрофлоры организма здорового человека может изменяться в зависимости от возраста, пола, состояния здоровья, способа лечения и других причин. Для каждой области человеческого организма формируется характерный биоценоз. Значение микрофлоры для организма человека неоднозначно, но в нормальных условиях в основном положительное. Поэтому необходимо знать состав нормальной микрофлоры, причины, вызывающие её нарушения, способы восстановления.

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения темы студент должен знать:

- характер действия на микроорганизмы физических факторов и химических веществ;

- состав нормальной микрофлоры организма человека, причины его нарушения и способы восстановления.

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала темы необходимо знать:

- способы определения ферментативной активности микробов и учета результатов;

- методы санитарно-бактериологического исследования воды и воздуха;

- физические факторы, способные оказать действие на микробы;

- химические вещества, оказывающие губительное действие на микробы (антисептики).

Цель занятия

1. Изучить характер влияния на микроорганизмы физических и химических факторов.

2. Показать разнообразие ферментов у микроорганизмов и возможности их использования для идентификации.

3. Изучить методы и показатели, необходимые для микробиологической оценки объектов окружающей среды.

План изучения темы

1. Повторите методы исследований ферментативной активности бактерий, определения показателей для санитарно-бактериологической оценки воды, воздуха, способы регистрации результатов.

2. Влияние факторов внешней среды на микробы изучите по учебнику, конспектам лекций и руководству; обратите внимание на механизмы действия факторов, особенности действия антисептиков (дезинфицирующих веществ).

3. При изучении нормальной микрофлоры обратите особое внимание на изменение состава микрофлоры в течение первого года жизни ребенка, на причины, вызывающие дисбактериоз, способы его предупреждения и устранения, на оценку положительного и отрицательного влияния микрофлоры на организм человека. Название пробиотиков их состав и способы применения выучить. Пребиотики, синбиотики: их роль в лечении дисбиозов.

После изучения темы студент должен уметь

Выбирать методы для предстерилизационной обработки предметов медицинского назначения и дезинфекции.

Освоить основные микробиологические методы изучения микрофлоры организма человека.

Проводить оценку качественного и количественного состава микрофлоры кожи, рото-носоглотки, желудочно-кишечного тракта, урогенитального тракта.

Дополнительный материал к занятию

Некоторые дезинфицируюшие вещества, применяемые в ЛПУ

№	Название препарата, фирма, страна	Спектр антимикробного действия	Область применения дезинфекционных средств
			Изделия медицинского назначения	Поверхности помещений, мебели, оборудования	Сан-тех. оборудование	Уборочный материал	Предметы ухода за больными	Белье	Посуда	Выделения
I. Группа галоидосодержащих средств
1	Хлорамины Б, ХБ, Д, Россия	Бактерии, микобактерии, вирусы, грибы	+	+	+	+	+	+	+	-
2	Жавелион, Франция	Бактерии, микобактерии, вирусы, грибы	+	+	+	+	+	+	+	-
II. Группа перекисных соединений
3	Дезоксон-1, дезоксон-4, Россия	Бактерии, микобактерии, вирусы, грибы, споры	+	+	+	+	-	+	+	-
4	Перекись водорода, Россия	Бактерии, микобактерии, вирусы, грибы, споры	+	+	+	+	+	+	+	-
III. Группа ПАВ
5	Аламинол, Россия	Бактерии, микобактерии, вирусы, грибы	+	+	+	+	+	+	+	-
6	Септабик, Израиль	Бактерии, кроме микобактерий, грибы	-	+	+	+	+	+	-	-
IV. Группа гуанидинов
7	Лизетол АФ, Германия	Бактерии, микобактерии, вирусы, грибы	+	-	-	-	-	-	-	-
8	Хлоргексидин биглюконат (гибетан), Россия, Польша, Венгрия, Финляндия	Водные р-ры: бактерии, кроме микобактерий Спиртовые р-ры: бактерии, кроме микобактерий, вирусы	- +	+ -	- -	- -	- -	+ -	+ -	- -
V. Группа альдегидсодержащих вешеств
9	Бианол, Россия	Бактерии, микобактерии, вирусы, грибы, споры	+	+	+	-	-	-	-	-
10	Глютарал, Россия	Бактерии, микобактерии, вирусы, грибы, споры	+	-	-	-	-	-	-	-
VI. Группа спиртов
11	Спирт этиловый, Россия	Бактерии, кроме микобактерий, вирусы, грибы	+	-	-	-	-	-	-	-
VII. Группа фенолсодержащих средств
12	Амоцид, Германия	Бактерии, микобактерии, вирусы, грибы	-	+	+	+	-	+	-	+

Выписка из санитарных правил СП 1.2.731-99 (Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами: Санитарные правила. - М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 1999. - 107 с.)

Режимы обеззараживания различных объектов, заражённых патогенными микроорганизмами

№	Объект	Способ	Средство	Концентрация р-ра, %	Время, мин.
1. Бактерии, не образующие спор, кроме микобактерий
1	Помещения (пол, стены, двери), рабочий стол и др. мебель, оборудование	Протирание	Хлорамин Б, ХБ Дезоксон-1, дезоксон-4 Перекись водорода с 0,5% моющего средства Аламинол	1 1 3 1	60 30 60 30
2	Халаты, шапочки, маски, бельё больного без видимых загрязнений	Автоклавирование	Автоклав	1 атм, 1200С	30
		Замачивание с последующей стиркой	Хлорамин Б, ХБ Дезоксон-1, дезоксон-4 Перекись водорода с 0,5% моющего средства Аламинол	0,5 1 3 1	60 30 30 15
3	Очки, фонендоскоп	2-кратное протирание с интервалом 15' с последующим обмыванием водой погружение	Перекись водорода с 0,5% моющего средства Перекись водорода Спирт	3 3 70	30 30 30
4	Посуда лабораторная (пипетки, пробирки, колбы, чашки Петри), мазки-отпечатки	Автоклавирование	Автоклав	1,5 атм, 1270С	60
		Кипячение	Пищевая сода	2	30
		Погружение	Хлорамин Б, ХБ Дезоксон-1, дезоксон-4 Перекись водорода с 0,5% моющего средства	3 2 3	60 60 60
5	Незащищённые участки кожи, руки	Протирание с последующим мытьем	Спирт	70	2
6	Незащищённые участки кожи, руки при попадании инфекционного материала в случае аварии		Хлорамин Б или ХБ Спирт	0,5 70	1 2 раза по 2 мин
2. Микобактерии
1	Помещения (пол, стены, двери), рабочий стол и др. мебель, оборудование	Протирание (2-кратное протирание)	Хлорамин Б, ХБ Дезоксон-1, дезоксон-4 Аламинол	0,5 0,25 3	60 60 90
2	Халаты, шапочки, маски, бельё больного без видимых загрязнений	Кипячение	Кальцинированная сода Любое моющее средство	2 0,5	15 15
		Замачивание	Хлорамин Б, ХБ Дезоксон-1, дезоксон-4 Аламинол	5 05 3	240 60 180
3	Посуда лабораторная (пипетки, пробирки, колбы, чашки Петри)	Автоклавирование	Автоклав	1,5 атм, 1270С	60
		Кипячение	Пищевая сода	2	15
		Погружение	Активированный хлорамин Б, ХБ	1	60
4	Незащищённые участки кожи, руки при попадании инфекционного материала в случае аварии	Протирание с последующим мытьём	Активированный хлорамин Б, ХБ	0,5	2
3. Бактерии, образующие споры
1	Помещения (пол, стены, двери), рабочий стол и др. мебель, оборудование	2-кратное протирание (орошение) с интервалом в 30 мин	Активированный хлорамин Б, ХБ Перекись водорода с 0,5% моющего средства	4 6	120 120
2	Халаты, шапочки, маски, бельё больного без видимых загрязнений	Автоклавирование	Автоклав	2 атм, 1320С	90
		Кипячение	Кальцинированная сода	2	60
		Замачивание	Активированный хлорамин Б, ХБ Перекись водорода с 0,5% моющего средства при 500С	1 3	120 60
3	Очки, фонендоскоп	2-кратное протирание с интервалом в 30 мин с последующим промыванием водой	Перекись водорода с 0,5% моющего средства при 500С	6	60
4	Посуда лабораторная (пипетки, пробирки, колбы, чашки Петри), мазки-отпечатки	Автоклавирование	Автоклав	2 атм, 1320С	90
		Кипячение	Пищевая сода	2	60
		Погружение	Активированный хлорамин Б, ХБ Перекись водорода с 0,5% моющего средства при 500С Дезоксон-1 Спирт+3% Н2О2	4 6 1 96	60 60 60 30
5	Незащищённые участки кожи, руки при попадании инфекционного материала в случае аварии	Протирание с последующим мытьём	Активированный хлорамин Б, ХБ	1	2
4. Вирусы и хламидии
1	Помещения (пол, стены, двери), рабочий стол и др. мебель, оборудование	Протирание (2-кратное)	Хлорамин Б, ХБ Аламинол Перекись водорода* Дезоксон-1, дезоксон-4	3 5 4 0,1	30 60 60 45
2	Халаты, шапочки, маски, бельё больного без видимых загрязнений	Автоклавирование	Автоклав	0,5 атм, 1100С	45
		Кипячение	Кальцинированная сода Любое моющее средство	2 0,5	15 15
		Погружение	Хлорамин Б, ХБ Активированный хлорамин Б, ХБ Перекись водорода с 0,5% моющего средства при 50єС Дезоксон-1, дезоксон-4 Аламинол	3 (1) 0,5 3 0,1 3	30 (60) 30 30 30 60
3	Очки, фонендоскоп	2-кратное протирание с последующим промыванием водой погружением	Перекись водорода Спирт	6 70	15 30
4	Посуда лабораторная (пипетки, пробирки, колбы, чашки Петри), мазки-отпечатки	Автоклавирование	Автоклав	1,5 атм, 1270С	60
		Кипячение	Кальцинированная сода Любое моющее средство	2 0,5	30 30
		Погружение	Хлорамин Б, ХБ Перекись водорода с 0,5% моющего средства при 50єС Дезоксон-1, дезоксон-4	3 6 0,5	60 60 60
5	Незащищённые участки кожи, руки	Протирание с последующим мытьём	Хлорамин Б, ХБ Спирт	1 70	2 2
5. Грибы
1	Помещения (пол, стены, двери), рабочий стол и др. мебель, оборудование	Протирание	Хлорамин Б, ХБ Активированный хлорамин Б, ХБ Дезоксон-1, дезоксон-4 Аламинол	5 1 0,5 3	60 60 60 60
2	Халаты, шапочки, маски, бельё больного без видимых загрязнений	Кипячение	Кальцинированная сода	2	30
		Погружение	Хлорамин Б, ХБ Активированный Хлорамин Б, ХБ Дезоксон-1, дезоксон-4 Аламинол	5 1 0,2 3	180 15 60 180
3	Очки	2-кратное протирание с интервалом 30 мин.	Хлорамин Б, ХБ Активированный хлорамин Б, ХБ Дезоксон-1, дезоксон-4 Аламинол	5 1 0,5 3	60 60 60 60
4	Посуда лабораторная (пипетки, пробирки, колбы, чашки Петри), мазки-отпечатки	Автоклавирование	Автоклав	2 атм, 1320С	20
		Кипячение	Пищевая сода	2	30
		Погружение	Хлорамин Б, ХБ	5	120
5	Руки, заражённые участки кожи	Мытьё с марлевой салфеткой	Йодонат Активированный хлорамин Б, ХБ	1 0,5	1 2

Примечание: 1 - отсчёт времени обеззараживания при кипячении начинается с момента закипания воды; 2 - допускается использование зарубежных дезинфицирующих средств, разрешённых для применения в России.

Контрольные вопросы

Перечислите физические факторы, которые могут губительно действовать на микробы. Деление микробов по отношению к температуре; температурный оптимум, минимум, максимум. Приведите примеры видов микробов, которые погибают при комнатной температуре. Погибают ли перечисленные виды бактерий при 00С, при 1000С: возбудитель столбняка, сибирской язвы, дифтерии, брюшного тифа, ботулизма, анаэробной газовой инфекции, менингококк, гонококк, холерный вибрион, стафилококк. Как влияет на бактерии высушивание? Что такое лиофильное высушивание, для чего применяется? Какие виды лучистой энергии губительно действуют на микробов и применяются на практике? Действие биологических факторов на микробы. Назовите дезинфицирующие вещества, наиболее часто применяемые на практике. Механизмы действия дезинфицирующих веществ на микробы. Действие дезинфицирующих веществ на вегетативные формы и споры бактерий. В какой из концентраций этиловый спирт оказывает более сильное бактерицидное действие: 70 или 96%? Почему? Дайте определения понятия: нормальная микрофлора организма человека; резидентная микрофлора, транзиторная микрофлора. Что такое гнотобионты, для чего они используются? Как изменяется микрофлора ребёнка после рождения и в течение первого года жизни? Назовите органы и ткани, свободные от постоянной микрофлоры. Характеристика микрофлоры различных биотопов организма: органов дыхания, желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы, кожи, глаз, наружного уха. Микрофлора толстого кишечника - облигатная и факультативная, аэробная и анаэробная. Значение нормальной микрофлоры в жизни человека. Обнаружение какого микроба свидетельствует о фекальном загрязнении? Дисбиоз (дисбактериоз): определение понятия, в чём выражается, причины возникновения, способы предупреждения и лечения. Понятие о пробиотиках, пребиотиках, синбиотиках. Назовите препараты, применяемые для устранения дисбиоза; что они содержат, как применяются, механизмы действия; какие препараты рекомендуют применять для детей до 6-месячного возраста и для взрослых? Бифидогенные препараты (пребиотики): назовите основные препараты.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Напишите название препаратов, применяемых для устранения дисбиоза, их состав, применение.

Заполните в тетради таблицу «Механизм действия химических веществ на микроорганизмы».

Группы веществ	Препараты	Механизм действия
Поверхностно-активные (детергенты)
Фенолы
Галоидосодержащие вещества
Кислородсодержащие вещества
Альдегидсодержащие вещества
Спирты
Гуанидины
Четвертичные аммониевые основания
Красители
Соли тяжёлых металлов
Металлы

Работа студента на практическом занятии

1. Учёт результатов определения биохимической активности аэробных бактерий на средах Гисса и Олькеницкого.

2. Исследование микрофлоры воды и воздуха. Произведите учёт результатов посева воды на микробное число. Определите, соответствует ли вода ГОСТу по микробному числу и показателям колиформных бактерий (см. предыдущее занятие). Произведите учёт результатов посевов воздуха, дайте оценку бактериальной обсеменённости воздуха.

3. Действие физических факторов на микроорганизмы. Произведите учёт опыта Бухнера (действие УФ-лучей на бактерии), результат зарисуйте. Поставьте опыт по действию высоких и низких температур на бактерии: испытайте действие замораживания, кипячения и автоклавирования на споровые и неспоровые бактерии.

4. Действие дезинфицирующих веществ на бактерии. По демонстрационной таблице проверьте правильность составленной вами таблицы.

5. Нормальная микрофлора организма человека. Из посева на сахарном бульоне (посев из зева) приготовьте мазок, окрасьте по Граму, промикроскопируйте несколько полей зрения, зарисуйте все обнаруженные виды бактерий. Из посева на МПА (посев с кожи рук) отберите несколько разных колоний, приготовьте мазки, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте. Приготовьте мазок из зубного налёта: на предметное стекло нанесите каплю физиологического раствора; стерильной заострённой спичкой возьмите у себя зубной налёт, внесите в каплю физиологического раствора, приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте различные виды обнаруженных в мазке микробов. После обобщения полученных результатов сделайте выводы о разнообразии встречающихся видов микробов, о сходстве их по морфологии с патогенными видами и отсюда о необходимости идентификации их не только по морфологии, но и по комплексу других признаков. Выводы запишите в тетрадь.

Занятие 10. Итог по разделу «физиология микробов»

Занятие является завершающим по разделу «Физиология микробов». На этом занятии преподаватель дает оценку вашей работе: знаете ли вы теоретический материал по данной теме и владеете ли микробиологическими методами исследования.

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения темы студент должен быть готов ответить на все вопросы к итоговому занятию.

Исходный уровень знаний

Материал предыдущих занятий с 6 по 9.

Цель занятия

1. Систематизировать знания по физиологии микробов.

2. Продемонстрировать овладение умениями, полученными при изучении физиологии микробов.

План изучения темы

Повторите все темы раздела «Физиология микробов» по учебнику. практическому руководству, по конспектам лекций, прочитайте дополнительный материал в пособии и записи в своей тетради для практических занятий. Ответьте на контрольные вопросы.

После изучения раздела студент должен уметь

Владеть техникой посева бактерий на жидкие и плотные среды.

Охарактеризовать предложенные питательные среды, применяемые в микробиологической практике.

Охарактеризовать колонии микроорганизмов.

Провести посев изолированных колоний на скошенный питательный агар.

Провести посев изолированных колоний на скошенный питательный агар.

Проводить оценку санитарно-бактериологического состояния воздуха, воды, почвы по микробиологическим показателям.

Выбрать средства, режим стерилизации в соответствии с конкретными задачами.

Выбирать методы для предстерилизационной обработки предметов медицинского назначения и дезинфекции.

Освоить основные микробиологические методы изучения микрофлоры организма человека.

Контрольные практические задания по разделу «физиология микробов»

Произведите посев материала от больного на жидкую питательную среду для выделения анаэробных микроорганизмов.

Произведите посев материала штриховым способом на плотную питательную среду для выделения чистой культуры микроорганизмов.

Произведите посев материала по Дригальскому на плотную питательную среду для выделения чистой культуры микроорганизмов.

Дайте характеристику культуральных свойств микроорганизмов, выросших на среде Эндо.

Дайте характеристику культуральных свойств микроорганизмов, выросших на среде Плоскирева.

Дайте характеристику культуральных свойств микроорганизмов, выросших на среде Левина.

Дайте характеристику культуральных свойств микроорганизмов, выросших на среде Китта-Тароцци.

Оцените результаты исследования ферментативной активности бактерий на среде Олькеницкого.

Идентифицируйте культуру микроорганизмов по результатам определения биохимической активности на средах Гисса.

Контрольные вопросы по разделу (подробную расшифровку вопросов смотрите в соответствующих занятиях (6-9))

Основные компоненты химического состава бактериальной клетки, их локализация в клетке и биологическая роль. Понятие о конструктивном и энергетическом метаболизме (анаболизме и катаболизме). Особенности процесса питания у прокариотов. Источники и типы питания микробов. Общие требования к питательным средам; рН среды, его значение для большинства видов бактерий. Классификация питательных сред по происхождению, по составу и назначению, по консистенции. Простые и сложные питательные среды, примеры. Специальные питательные среды: приведите примеры. Элективные питательные среды, примеры. Дифференциально-диагностические среды, принцип их действия, состав и применение. Что такое стерилизация, дезинфекция, асептика, антисептика? Методы стерилизации, применяемые в микробиологической практике (аппарат, режим стерилизации, стерилизуемые материалы, контроль эффективности стерилизации). Стерилизация прокаливанием на огне. Стерилизация сухим жаром. Стерилизация паром под давлением. Дробные методы стерилизации. Фильтрование через бактериальные фильтры. Кипячение. Пастеризация. Как простерилизовать стеклянную посуду и пипетки? Как простерилизовать простые питательные среды, среды, содержащие углеводы? Как простерилизовать питательные среды, содержащие белки? Что такое рост микробов, размножение микробов? Что такое культура бактерий, чистая культура, штамм, клон...