Микробиология и вирусология

ЗАДАЧА. В семье заболел дифтерией ребенок Валерий, 3-х лет. Другие члены семьи не заболели, причём мать переболела дифтерией в детстве, а отец был привит дифтерийным анатоксином. Старшая сестра Наташа не была привита дифтерийным анатоксином из-за медицинских противопоказаний, поэтому ей пришлось провести экстренную профилактику с помощью противодифтерийной антитоксической сыворотки. Младший брат, Виталий, 3-х месяцев, не заболел, хотя ничем не был привит. В доме есть кошка и собака, они не заболели. Назовите для каждого из членов семьи и для животных вид иммунитета, благодаря которому они не заболели.

Что такое антиген? Характеристика полноценных антигенов. Какие вещества могут быть антигенами? Как называется способность антигенов индуцировать образование и накопление антител и иммунных лимфоцитов? Вступать с антителами в специфическое взаимодействие? Как называются антигены, обладающие обоими этими признаками? Как называются антигены, обладающие одним (каким?) из этих признаков? Структура антигена. Как называется часть молекулы антигена, определяющая его специфичность? Назовите известные вам антигены. Антигенная структура микробной клетки. Жгутиковый антиген, локализация, буквенное обозначение, природа, отношение к температуре, способ получения. Соматический антиген, его локализация, буквенное обозначение, химическая природа, отношение к температуре, способы получения. Для чего применяются антигены бактерий? Что такое «химическая вакцина»? Что такое протективный антиген? Продукты жизнедеятельности микробной клетки как антигены. Анатоксин, его свойства, получение, применение. Видоспецифические, типоспецифические и группоспецифические антигены микробов, их практическое значение для идентификации микробов. Гетероантигены. Методика приготовления антигена из эритроцитов. Антигены организма человека, аутоантигены, изоантигены.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки.

Составьте схему «Классификация иммунитета», заполните таблицу «Факторы неспецифической защиты организма».

Работа студента на практическом занятии

I. Изучение факторов врождённого иммунитета.

1. Фагоцитоз.

Цель опыта: Определить фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови.

Ход опыта: описать.

Результат: подсчитать, зарисовать, отметить на рисунке стрелками стадии фагоцитоза.

Вывод: сформулировать.

2. Незавершённый фагоцитоз. Промикроскопировать и зарисовать мазок из гноя больного гонореей.

3. Лизоцим. Цель опыта: определить, обладает ли лизоцимной активностью сыворотка крови. Ход исследования записать в тетрадь, учесть результат и сделать вывод.

II. Антигены.

1. Приготовление антигена из культуры кишечной палочки. Приготовить взвесь культуры в физиологическом растворе, инактивировать на водяной бане, проверить на стерильность путём посева на скошенный агар. Стандартизировать с помощью оптического стандарта мутности.

2. Приготовление дифтерийного анатоксина. Рассчитать количество формалина, необходимое для того, чтобы получить 0,4% его концентрацию в 10 мл дифтерийного токсина. Добавить формалин и смесь поставить в термостат.

Занятие 15. Антитела. Реакции иммунитета: реакция нейтрализации токсинов антитоксинами, реакция преципитации, реакция агглютинации

Раздел «Иммунитет» - важнейший в нашем курсе. Успешное освоение этого раздела возможно только при систематическом и последовательном изучении всех его тем. Понятие об антигенах и антителах, о структурных основах специфичности приобретённого иммунитета, процессе иммуногенеза необходимо для понимания следующих разделов: реакции иммунитета, их использование для диагностики и для специфической профилактики и терапии.

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения темы студент должен знать:

- антитела, их свойства, строение, структурные основы специфичности; процесс антителогенеза;

- реакции иммунитета, механизм, ингредиенты, методы постановки, практическое применение.

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала темы необходимо знать структуру простых и сложных белков, структуру иммуноглобулинов (биохимия), клетки крови и органов иммунной системы (гистология); резус-фактор и антитела к нему (физиология).

Цель занятия

1. Изучить строение и функционирование иммунной системы.

2. Изучить специфические формы иммунного ответа: клеточный и гуморальный ответы, иммунологическая память, иммунологическая толерантность.

3. Выработать чёткое преставление об антителах, их строении, классах иммуноглобулинов, их роли.

4. Изучить механизмы взаимодействия антиген-антитело: принципы и методы постановки реакций агглютинации и преципитации.

5. Научиться интерпретировать результаты серологических исследований.

План изучения темы

1. Иммунная система организма. Иммуногенез.

2. Антитела, их свойства, строение. Получение иммунных сывороток.

3. Реакции иммунитета.

Рекомендуется изучить тему по учебнику, затем по конспекту лекций и по «Руководству к лабораторным занятиям». Разобрать схему «Иммунная система». Прочитать план предстоящего занятия, ответить на контрольные вопросы, решить задачи.

После изучения темы студент должен уметь

Поставить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле, реакцию кольцепреципитации в пробирках.

Учесть готовый результат развёрнутой реакции агглютинации в пробирках; учесть и оценить реакцию преципитации в агаре.

Контрольные вопросы

Какая ткань составляет иммунную систему организма? Укажите центральные и периферические органы иммуногенеза у человека и их функции. Опишите процесс формирования гуморального и клеточного иммунного ответа. Назовите классы лимфоцитов, от которых зависит механизм иммунитета: гуморальный и клеточный. Укажите: клетки, которые в процессе антителогенеза осуществляют захват, переваривание и презентацию антигена; клетки, взаимодействующие при формировании гуморального иммунитета, клеточного иммунитета; клетки, которые трансформируются и превращаются в плазмоциты, продуцирующие антитела; клетки, стимулирующие этот процесс; клетки, которые угнетают иммунный ответ; клетки, которые убивают опухолевые и заражённые вирусом клетки. Цитокины - определение понятия, виды. Антигены главного комплекса гистосовместимости (MHC), их роль в формировании иммунного ответа, в реакции отторжения трансплантата. Классы MHC, их характеристика. Антитела - определение понятия, основные свойства. Как получить иммунную сыворотку? Как получить сыворотку, которая нейтрализовала бы столбнячный токсин? Против каких антигенов образуются антитоксины, агглютинины, преципитины, бактериолизины, гемолизины, антилимфоцитарные антитела? Какие антитела образуются при введении в организм дифтерийного анатоксина? Дифтерийных бактерий? Где содержатся антитела в организме? Что такое титр антител? Химическая природа антител. Структура иммуноглобулина (начертить схему). Что такое активный центр иммуноглобулина? Перечислите классы иммуноглобулинов, значение в организме. Укажите класс иммуноглобулинов, способных проникать через плаценту. С какими структурами иммуноглобулинов связана способность соединяться с антигеном, эффекторные функции? Динамика накопления антител. Вторичный иммунный ответ, его особенности. Что такое реакции иммунитета? Условия протекания реакций иммунитета. Перечислите группы реакций иммунитета. Что такое чувствительность и специфичность иммунологических реакций? Какие реакции иммунитета происходят между токсином и антитоксинами? Как определяется и в каких единицах выражается биологическая активность антитоксических сывороток? Обнаружение токсигенности бактерий методом преципитации в агаре: как ставится реакция, что является антигеном? Антителами? Что происходит между ними? Что появляется при положительной реакции?

ЗАДАЧА. Подставьте вместо пропущенных слов «анатоксин» или «антитоксин»: … является антигеном; ... является антителом; … создаёт при введении в организм активный иммунитет; … создаёт при введении в организм пассивный иммунитет, … получают путём иммунизации животных; … получают из токсина при воздействии формалина и тепла; … нейтрализует токсин; … вызывает в организме образование антител.

Реакция агглютинации: что такое агглютинация, что является антигеном, что - антителами; две фазы реакции; методы постановки; какие контроли ставят и для чего? Реакция агглютинации на стекле: необходимые ингредиенты, метод постановки; как выглядит положительная реакция; в чём преимущество реакции по сравнению с развёрнутой реакцией агглютинации и в чём её недостаток; в каком случае реакция агглютинации на стекле является ориентировочной, а в каком случае она даёт окончательный результат? Развёрнутая реакция агглютинации: необходимые ингредиенты, порядок постановки, необходимые контроли, учёт результатов. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации: что служит антигеном в этой реакции, как его получают, механизм реакции. Реакция обратной непрямой гемагглютинации: что служит антигеном в этой реакции, как его получают, механизм реакции. Что такое эритроцитарный диагностикум? Что такое антительный эритроцитарный диагностикум? Методика постановки реакций. Реакция коагглютинации. Агглютинирующие сыворотки: что они содержат; как их получают, для чего применяются; что такое титр агглютинирующей сыворотки? В чём различия между поливалентными и моновалентными (монорецепторными) агглютинирующими сыворотками; почему при иммунизации кролика микробами одного вида получается сыворотка, содержащая антитела к нескольким антигенам? Какими способами можно получить монорецепторную сыворотку; что означает термин «адсорбированная агглютинирующая сыворотка»?

ЗАДАЧА. Получена агглютинирующая сыворотка путём иммунизации кролика бактериями с антигенной структурой 1, 3, 4. Как из этой сыворотки получить монорецепторную сыворотку против антигена 3? Что для этого требуются?

Моноколональные антитела и гибридомы: что это такое? Опишите последовательность действий для получения моноколональных антител, какие клетки соединяют для получения гибридом. Преимущество моноколональных антител; практическое применение. Реакция обнаружения неполных антител (реакция Кумбса): чем отличаются неполные антитела от полных; какое свойство антител используется для их обнаружения; какая диагностическая сыворотка для этого применяется? Реакция преципитации: что такое преципитация? Что служит антигеном? Как получить преципитирующую сыворотку? Что такое титр преципитирующей сыворотки? Две фазы реакции, какими по физическому состоянию должны быть ингредиенты реакции? Варианты постановки реакции: в жидкой среде, в геле, с использованием электрофореза. Реакция флоккуляции. Практическое применение реакций преципитации.

ЗАДАЧА. На одежде человека, подозреваемого в убийстве, обнаружено пятно крови. С помощью какой реакции можно определить, человеческая ли это кровь; что здесь будет антигеном и что - антителами; какой диагностический препарат нужно иметь в лаборатории для этой реакции; как он приготовлен?

ЗАДАЧА. Как при помощи реакции преципитации определить является ли доставленный для анализа образец мясом крупного рогатого скота или мясом лошади; какие необходимы для этого диагностические препараты?

Для чего практически применяются реакции иммунитета, какая основная особенность реакций иммунитета используется при этом, в каких двух направлениях применяются реакции иммунитета, какие диагностические препараты необходимо иметь при этом; что они содержат?

Задания для выполнения в процессе самоподготовки.

Заполните таблицу «Реакции иммунитета» в отношении реакций, разбираемых в рамках данной темы.

Реакции иммунитета

Реакция иммунитета	Антиген	Антитело	Способ постановки	Применение

Работа студента на практическом занятии

Работу начать сразу с постановки развёрнутой реакции агглютинации, но в тетрадь записать позже (см. ниже).

1. Учёт посева предыдущего занятия. Посмотрите посев антигена, отметьте результат, сделайте вывод о стерильности приготовленного антигена.

2. Реакция агглютинации:

а) реакция агглютинации на стекле.

Цель опыта: определить, являются ли антитела иммунной сыворотки и антигены бактерий специфичными в отношении друг друга.

Материал: иммунная сыворотка, культура бактерий на скошенном агаре.

Ход опыта: описать.

Результат: нарисовать.

Вывод: сформулировать;

б) развёрнутая реакция агглютинации.

Цель опыта: определить титр агглютинирующей сыворотки.

Материал: агглютинирующая сыворотка, взвесь бактерий.

Ход опыта: начертить схему постановки реакции.

Результат: в конце занятия отметить, в каких пробирках произошла агглютинация.

Вывод: сформулировать.

в) реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации. Разобрать по таблице РНГА. Учесть демонстрационную реакцию, отметить титр сыворотки;

г) реакция Кумбса (определение неполных антител). Разобрать по таблице. Начертить схему реакции в тетради;

3. Реакция преципитации:

а) реакция преципитации с сывороточным антигеном.

Цель: определить видовую принадлежность сывороточного белка.

Материал: перечислить ингредиенты.

Ход опыта: начертить схему.

Результат: отметить, в какой пробирке произошла преципитация.

Вывод: сформулировать;

б) Определение токсигенности коринебактерий дифтерии в реакции преципитации в агаре (учёт демонстрационного посева).

Цель: определить, какие из исследуемых культур являются токсигенными.

Результат: изобразить в виде схематического рисунка. Отметить стрелками токсигенные культуры.

4. Диагностические препараты. Посмотреть диагностикумы и диагностические сыворотки. Провести разбор препаратов по схеме: что содержит препарат (антиген, антитела), как приготовлен, для чего применяется, что можно выявить с помощью этого препарата, как дозируется (титр)?

Занятие 16. Реакция иммунного лизиса (иммунного бактериолиза, иммунного гемолиза). Реакция связывания комплемента. Реакции с мечеными компонентами: иммунофлюоресценция (РИФ), иммуноферментный анализ (ифа), иммуноблоттинг, радиоиммунный анализ (риа), иммунная электронная микроскопия (ИЭМ)

На данном занятии изучаются реакции иммунитета с участием комплемента и реакции иммунитета с мечеными компонентами (меченые антигены или антитела). Необходимо продумать механизмы и схемы постановки этих реакций. В последние годы перечисленные реакции широко используются для диагностики инфекционных заболеваний и вытесняют традиционные методы (агглютинации, преципитации).

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения темы студент должен знать о каждой из реакций:

- ингредиенты;

- механизм реакции;

- методы и схемы постановки;

- практическое применение;

- диагностические препараты.

Исходный уровень знаний

Для усвоения материала необходимо восстановить знания, полученные на предыдущих двух занятиях: комплемент и пути его активации; антигены и антитела; механизмы реакций иммунитета.

Цель занятия

1. Изучить механизм и методы постановки реакции иммунного бактериолиза и иммунного гемолиза.

2. Изучить механизм и методы постановки реакции связывания комплемента (РСК).

3. Изучить механизм и методы постановки реакции иммунофлюоресценции (РИФ).

4. Изучить механизм и методы постановки реакций иммуноферментного анализа (ИФА), радиоиммунного анализа (РИА), иммуноблоттинга.

5. Изучить механизм и методы постановки реакции иммунной электронной микроскопии (ИЭМ).

6. Научиться интерпретировать результаты серологических исследований.

План изучения темы

1. Реакция иммунного бактериолиза.

2. Реакция иммунного гемолиза.

3. Реакция связывания комплемента.

4. Реакция с мечеными компонентами: РИФ, ИФА, РИА. ИЭМ, иммуноблоттинг.

5. Реакции иммобилизации.

После изучения темы студент должен уметь

Поставить РСК с готовыми ингредиентами по схеме, учесть и интерпретировать её результат.

Учесть и оценить результаты РИФ.

Учесть и оценить результаты ИФА.

Учесть и оценить результаты иммуноблоттинга.

Дополнительный материал к занятию

Реакция локального гемолиза в геле

Реакция предложена Н. Йерне в 1963 г., её применяют для подсчета клеток-антителопродуцентов. Клетки, продуцирующие антитела (например, плазмоциты селезёнки, после иммунизации животного эритроцитами барана), вносят вместе с эритроцитами барана в гель (агар). Затем в реакционную систему вносят комплемент (наслаивая его на агар) и наблюдают образование зон гемолиза вокруг каждой клетки, образующей антитела к эритроцитам барана. Метод получил распространение во многих областях экспериментальной иммунологии, так как даёт возможность оценить образование антител на уровне отдельных тканей и органов и клеточных популяций иммунной системы после различных воздействий.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

ИФА - это выявление антигенов (или антител) с помощью соответствующих им антител (антигенов), конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, в-галактозидазой или щелочной фосфатазой).

Наиболее распространён твердофазный ИФА, когда один из компонентов иммунной реакции (антигены или антитела) сорбирован на твёрдом носителе, например, в лунках пластиковой микропланшетки из полистирола. Для определения антител в лунки с сорбированным антигеном последовательно добавляют:

сыворотку крови больного,

антиглобулиновую сыворотку, меченую ферментом,

смесь растворов субстрата для фермента и хромогена.

Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путём тщательного промывания. При положительном результате изменяется окраска раствора хромогена в жёлто-коричневый цвет (при использовании пероксидазы) или жёлто-зелёный цвет (при использовании фосфатазы).

Если необходимо определить в исследуемом материале антиген, тогда в лунку с сорбированными антителами вносят исследуемый материал, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, и смесь растворов субстрата для фермента и хромогена.

Для постановки ИФА выпускаются специальные тест-системы с набором всех необходимых ингредиентов.

К настоящему времени созданы многочисленные модификации базовой методики ИФА.

Конкурентные методы ИФА: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Этот тест используется для определения количества антигена в исследуемом материале.

Сэндвич-ИФА (метод двойных антител для определения антигена): фиксированные на твёрдой фазе антитела инкубируют с анализируемым антигеном. После отмывания добавляют избыток меченых антител, специфичных к тому же антигену. Несвязавшиеся антитела отмывают. Продукт ферментативной реакции образуется в количествах, пропорциональных количеству связанного антигена. Можно использовать немеченые вторые антитела; о реакции в данном случае судят по связыванию энзим-меченых антител, специфичных по отношению к IgG (вторые антитела). В любом случае первые и вторые антитела должны принадлежать животным разных видов.

Измерение количества продуктов реакции ИФА проводят в автоматизированном варианте в приборах-ридерах с помощью спектрофотометра, по оптической плотности растворов в лунках при определённой длине волны.

Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг - (от англ. «blot» - пятно) - метод идентификации антигенов (или антител) с помощью известных сывороток (или антигенов). Представляет собой сочетание гель-электрофореза с ИФА. Первоначально бактериальные клетки или вирионы разрушают при помощи ультразвука, а затем методом электрофореза разделяют все антигены вируса или бактериальных клеток и получают коммерческий реагент на специальной нитроцеллюлозной плёнке. При постановке иммуноблоттинга на плёнку с известными антигенами наносится исследуемая сыворотка пациента. После инкубации и отмывания несвязавшихся антител, приступают к ИФА - на плёнку наносят антисыворотку к иммуноглобулинам человека, меченную ферментом, и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом. При наличии комплексов антиген-антитело-антисыворотка к иммуноглобулину-фермент на носителе появляются окрашенные пятна. Метод иммуноблоттинга позволяет отдельно обнаружить антитела на различные антигены возбудителя (например, при ВИЧ-инфекции иммуноблоттинг выявляет антитела на gp120, gp24 и другие антигены вируса).

Радиоиммунный анализ (РИА)

В основе метода лежит реакция антиген-антитело с применением метки антигена или антитела радионуклидом. В качестве метки используются 125I, 14C, 3H, 51Cr и другие радионуклиды. Образующиеся иммунные комплексы выделяют из системы и определяют их радиоактивность на счётчиках (в-излучение). Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

Широко распространён твёрдофазный вариант РИА с использованием меченых антител или антигенов, сорбированных в лунках полистироловых панелей.

РИА применяют для выявления антигенов микробов, вирусов, различных гормонов, ферментов, лекарственных веществ, иммуноглобулинов, а также других веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях 10-12-10-15 г/л.

Контрольные вопросы

Реакция иммунного бактериолиза: что это за реакция; что является антигеном, что - антителами, механизм реакции, методы постановки, практическое применение. Реакция иммунного гемолиза: необходимые ингредиенты, методика постановки; контроли, практическое применение. Реакция локального гемолиза в геле (реакция Йерне): принцип реакции, методика постановки, практическое применение. Реакция связывания комплемента: принцип реакции; что образуется при взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном; что происходит с комплементом, если он присутствует при этом взаимодействии? Какова судьба комплемента в том случае, если между антигеном и антителами нет специфического сродства? С помощью какой реакции можно определить, что произошло с комплементом; почему используется именно эта реакция; каков видимый положительный результат РСК? Почему? Какое свойство комплемента используется в первой фазе РСК? Во второй фазе? Если конечным результатом РСК является гемолиз, что это означает - положительный или отрицательный результат? Объясните результаты: РСК+ + + +, РСК+ + +, РСК+ +, РСК+. Назовите ингредиенты первой системы РСК и ингредиенты второй системы РСК. Почему исследуемую сыворотку необходимо инактивировать? Как титруют комплемент? Гемолитическая сыворотка: что она содержит, как её получают, что такое титр и как его определяют? Какие животные используются для получения компонентов РСК? Методика постановки РСК на холоде. При постановке каких из перечисленных реакций необходимо участие комплемента: преципитации, флоккуляции, агглютинации, выявления неполных антител, иммунного бактериолиза, иммунного гемолиза, Йерне, РСК? Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) - укажите последовательность событий при прямой реакции Кунса; необходимые ингредиенты. Что является антигеном, что - антителами, чем помечены антитела, как учитывается результат реакции, как выглядит положительный результат? Практическое применение - что можно определить с помощью этой реакции? Непрямая реакция иммунофлюоресценции - укажите последовательность событий при этой реакции, необходимые ингредиенты, что является антигеном, какие иммунные сыворотки применяются; практическое применение; преимущество непрямой РИФ по сравнению с прямой реакцией. Иммуноферментный анализ (ИФА) - принцип реакции; необходимые ингредиенты; укажите последовательность событий при постановке реакции с целью обнаружения антигена в исследуемом материале; необходимые ингредиенты; что происходит при положительном результате, как он выглядит? Укажите последовательность действий при постановке ИФА с целью обнаружения антител в исследуемой сыворотке; необходимые ингредиенты; что происходит при положительном результате? Иммуноблоттинг - принцип реакции; основные этапы; необходимые ингредиенты; как учитывается результат; преимущества реакции. Радиоиммунный анализ (РИА) - из каких основных этапов складывается реакция; чем помечены антитела или антигены, как учитывается результат? Иммуноэлектронная микроскопия - принцип метода; основные этапы; необходимые ингредиенты; чем помечены антитела; как учитывается результат реакции. Реакции иммобилизации - принцип метода, техника постановки, компоненты, учёт результатов.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки.

Заполните таблицу «Реакции иммунитета» в отношении реакций, разбираемых в рамках данной темы.

Реакции иммунитета

Реакция иммунитета	Антиген	Антитело	Способ постановки	Применение

Работа студента на практическом занятии

Работу начать сразу с постановки 1 фазы РСК, но в тетрадь записать позже (см. ниже).

1. Реакция иммунного гемолиза. Посмотреть демонстрационную реакцию иммунного гемолиза, зарисовать в виде схемы, объяснить результат в опытной и в контрольных пробирках.

2. Реакция связывания комплемента

а) разобрать РСК по таблице;

б) начертить в тетрадь схему постановки РСК в виде таблицы;

в) поставить вторую фазу РСК (первая фаза ставится в начале занятия);

г) разобрать диагностические препараты, необходимые для РСК;

д) учесть результат. Сформулировать вывод о наличии специфических антител в исследуемой сыворотке.

3. Реакция иммунофлюоресценции. Изучите таблицу, составьте в тетради схему постановки реакции; посмотрите диагностические сыворотки; определите - что содержит сыворотка, как приготовлена, для какой реакции (прямой или непрямой РИФ) она применяется. Посмотрите демонстрационный результат РИФ в люминесцентном микроскопе.

4. Иммуноферментный анализ (ИФА). Составьте в тетради схему постановки реакции в двух вариантах: для обнаружения антигена в исследуемом материале и для обнаружения антител в сыворотке. Ознакомьтесь с набором ингредиентов для диагностики ВИЧ-инфекции и гепатита В. Определите, что содержит каждый ингредиент и для чего он применяется.

5. Иммуноблоттинг. Составьте в тетради схему постановки реакции; посмотрите демонстрацию - результат реакции.

6. Радиоиммунный анализ (РИА). Составьте в тетради схему реакции.

7. Иммунная электронная микроскопия (ИЭМ). Посмотрите демонстрацию - результат реакции, составьте в тетради схему реакции, укажите стрелками антиген (вирус) и меченые антитела.

Занятие 17. Медицинские биологические препараты для диагностики, профилактики и терапии инфекционных болезней

Вам предстоит изучить лечебно-профилактические и диагностические биологические препараты. Врачу любой специальности приходится применять на практике те или иные биологические препараты, а чтобы делать это грамотно и сознательно, необходимо усвоить общие принципы создания этих препаратов, их состав, применение.

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения темы студент должен знать лечебно-профилактические и диагностические препараты: источники и методы получения, классификацию, практическое применение.

Исходный уровень знаний

Мы ещё раз подчеркиваем - раздел «Иммунитет» можно усвоить только путём систематического и последовательного изучения. Вспомните и повторите весь предыдущий материал по иммунитету: антигены и антитела; виды приобретённого иммунитета; получение иммунных сывороток; диагностические препараты.

Цель занятия

1. Научиться характеризовать диагностические и лечебно-профилактические препараты.

2. Научиться подбирать препараты для иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных заболеваний.

План изучения темы

При изучении материала по лечебно-профилактическим и диагностическим препаратам важно понять и усвоить основные принципы, с тем чтобы уметь применять их для анализа конкретных препаратов. Чтобы научиться быстро проводить такой анализ, надо потренироваться в процессе самоподготовки. Повторите материал по конспекту лекций, разберите данную в этой лекции схему «Лечебно-профилактические и диагностические препараты», самостоятельно воспроизведите эту схему, не заглядывая в конспект. Затем выучите материал по этой теме по учебнику и по «Руководству к лабораторным занятиям». Выучите дополнительный материал по пособию. Ответьте на вопросы. Прочитайте план предстоящего занятия.

После изучения темы студент должен уметь

Дать характеристику диагностическим и лечебно-профилактическим препаратам.

Подобрать препараты для диагностики, профилактики и терапии инфекционных заболеваний.

Дополнительный материал к занятию

Диагностические препараты

К диагностическим препаратам относят:

диагностикумы (бактериальные, риккетсиозные, вирусные, грибковые, паразитарные);

антигены бактерий, вирусов;

диагностические иммунные сыворотки;

диагностические иммуноглобулины;

диагностические бактериофаги (используются для фагодиагностики и фаготипирования бактерий, что имеет эпидемиологическое значение);

аллергены.

Диагностические иммунобиологические препараты широко применяются для диагностики инфекционных болезней, аллергических состояний. Принцип действия диагностических препаратов основан на иммунологических реакциях (реакция антиген-антитело).

Лечебно-профилактические препараты

Вакцины. Вакцинами называются препараты, которые содержат антиген и применяются для создания в организме искусственного активного иммунитета. По природе содержащегося в них антигена и технике приготовления различают вакцины: 1) живые, 2) инактивированные (убитые),

3) химические, 4) анатоксины, 5) ассоциированные, 6) субъединичные,

7) генно-инженерные. По назначению и применению различают вакцины профилактические и лечебные. Вакцины и анатоксины с уменьшенной дозировкой антигена (БЦЖ-м, АД-м и другие) применяют для вакцинации и ревакцинации при наличии противопоказаний к прививкам. Живые вакцины применяются для профилактики следующих заболеваний: туберкулёз (БЦЖ и БЦЖ-м), чума, сыпной тиф (штамм ЕВ), туляремия, бруцеллёз, сибирская язва (СТИ), Ку-лихорадка (штамм М-44), грипп, корь, полиомиелит, эпидемический паротит, жёлтая лихорадка (штамм 17-Д). Инактивированные вакцины применяются для профилактики следующих заболеваний: полиомиелит, холера, брюшной тиф, лептоспироз, коклюш, сыпной тиф, бешенство (антирабическая культуральная вакцина), гепатит А, клещевой энцефалит, грипп, герпес. Химические вакцины, в отличие от живых и убитых, не содержат микробных тел. Они содержат наиболее иммуногенные антигены, извлечённые тем или иным способом из микробных клеток, преимущественно химическими методами. К ним относятся вакцины: брюшнотифозная (содержит 0-антиген бактерий брюшного тифа, адсорбированный на гидроокиси алюминия), менингококковая (содержит капсульный полисахарид менингококка серогруппы А, В), холерная. Вакцины с искусственным адъювантом создаются на основе композиции естественных антигенов и синтетических носителей (гриппозная вакцина с полиоксидонием - Гриппол). Рекомбинантные вакцины - это препараты, полученные в результате генной инженерии (например, дрожжевая рекомбинантная вакцина против гепатита В содержит HBs-антиген, который синтезирован рекомбинантной дрожжевой клеткой). Анатоксины - препараты, полученные из экзотоксинов путём обработки формалином и теплом. Анатоксины: стафилококковый нативный, стафилококковый адсорбированный, холероген-анатоксин, дифтерийный адсорбированный (АД, АД-м), дифтерийно-столбнячный (АДС, АДС-м), тетра-анатоксин (ботулинический типов А, В, Е, столбнячный), трианатоксин (ботулинический А, В, Е), секстаанатоксин (анатоксины C. perfringens, C. novyi, ботулинический типов А, В, Е, столбнячный). Ассоциированные (комплексные) вакцины содержат разные по своей природе антигены. Ассоциированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина (АКДС) содержит инактивированную или химическую коклюшную вакцину, дифтерийный и столбнячный анатоксины, адсорбированные на гидроокиси алюминия. Живая сухая комбинированная сыпнотифозная вакцина Е (ЖСКВ-Е) содержит высушенную живую культуру риккетсий Провачека авирулентного штамма Е в смеси с растворимым антигеном вирулентного штамма риккетсий. Холерная вакцина содержит холероген-анатоксин и О-антиген холерных вибрионов. Вакцина MMR содержит антигены возбудителей кори, эпидемического паротита и краснухи.

Лечебные вакцины. Для лечебных целей применяют вакцины при некоторых хронических и вяло протекающих бактериальных и вирусных заболеваниях: бруцеллёзе (инактивированная вакцина), хронической гонорее (инактивированная вакцина), герпесе (герпетическая инактивированная вакцина), стафилококковых инфекциях (стафилококковый антифагин, стафилококковая вакцина), протейной инфекции, инфекциях, вызванных условно-патогенными микроорганизмами. Вакцины применяются для лечения соматических заболеваний различной этиологии (рассеянный склероз, диабет, наркомания и др.), а также онкологических заболеваний (БЦЖ («Имурон») - для лечения рака мочевого пузыря).

Однако все перечисленные вакцины имеют недостатки: не всегда обеспечивают полноценный иммунитет, не гарантируют полной безопасности для пациентов, так как часто содержат балластные вещества, которые могут быть причиной аллергических реакций. Поэтому в настоящее время разрабатываются технологии получения новых вакцин 3-го поколения, лишённых этих недостатков. Для получения таких вакцин используются следующие направления.

1. Синтетические (пептидные) вакцины. К макромолекулярному соединению (белок, олигосахарид, высокомолекулярные электролиты - полиионы и др.), обеспечивающему сильный иммунный стимул, присоединяются искусственно синтезированные или полученные из микробных клеток антигенные детерминанты. Возможно присоединение нескольких детерминант (эпитопов) разных возбудителей. Следовательно, одна такая вакцина может обеспечить выраженный протективный иммунитет против нескольких заболеваний

2. Генно-инженерные вакцины. Гены возбудителей, ответственные за синтез протективных антигенов, выделяют из их хромосом (или синтезируют) и вводят в другие микроорганизмы. В дальнейшем или выделяют нужные антигены, или вводят в организм невирулентные носители антигенов в качестве вакцин.

3. Антиидиотипические вакцины. Используют антиидиотипические антитела 2-го поколения, активные центры которых представляют собой копию антигенной детерминанты (эпитопа).

4. ДНК-вакцины.

5. Вакцины, содержащие продукты генов главного комплекса гистосовместимости.

6. Растительные вакцины.

7. Мукозальные вакцины.

8. Микрокапсулированные вакцины.

Лечебно-профилактические сыворотки содержат антитела и предназначены для создания в организме искусственного пассивного иммунитета. По характеру содержащихся в них антител сыворотки могут быть разделены на антитоксические, антимикробные и противовирусные. Антитоксические сыворотки - гетерологичные (лошадиные): противостолбнячная, противоботулинические (моновалентные типов А, В, С, Е и поливалентная), противодифтерийная, противогангренозные; гомологичные (донорские): антистафилококковая донорская плазма, антисинегнойная донорская плазма, иммуноглобулин противостафилококковый донорский, иммуноглобулин противостолбнячный донорский. Антимикробные иммуноглобулины (гетерологичные): противосибиреязвенный, лептоспирозный, антирабический (против бешенства), против клещевого энцефалита, японского энцефалита, против лихорадки Эбола; гомологичные (донорские) - нормальный человеческий иммуноглобулин (противокоревой), противопротейная донорская плазма, противогриппозный донорский гамма-глобулин.

Бактериофаги - препараты, в которых содержатся вирусы бактерий, способные лизировать и инактивировать бактерии. Их применяют для профилактики и лечения ряда бактериальных инфекций (брюшной тиф, дизентерия, холера, гнойные инфекции). Эти препараты также назначаются с профилактической целью контактным лицам в очагах. Лечебный и профилактический эффект фагов умеренный, поэтому их применяют в комплексе с другими препаратами.

Пробиотики - живые микроорганизмы и вещества микробного происхождения, оказывающие при естественном способе введения позитивные эффекты на физиологические, биохимические и иммунные реакции организма хозяина через стабилизацию и оптимизацию функции его нормальной микрофлоры. Пробиотики получают путём выращивания бактерий на искусственных питательных средах, концентрирования, сушки, стандартизации и изготовления готовых форм в виде порошка или таблеток. В качестве бактерий в пробиотиках используют различные виды бифидумбактерий, лактобактерий и другие микроорганизмы и их комбинации в различных процентных концентрациях (бифидумбактерин, линекс, лактобактерин, биобактон, гастрофарм, колибактерин, бификол, споробактерин, бактисубтил и др.).

Пребиотики - препараты немикробного происхождения, способные оказывать позитивный эффект путём селективной стимуляции роста или усиления метаболической активности нормальной микрофлоры кишечника. К ним относятся лактулоза (дюфалак, лактусан), парааминометилбензойная кислота (ПАМБА), лизоцим, пантотенат кальция, олигосахариды, галакто-олигосахариды. Перечисленные ингредиенты содержатся в молочных продуктах, кукурузных хлопьях, хлебе, бананах, горохе и т.д.

Синбиотики - препараты, полученные в результате рациональной комбинации пробиотиков и пребиотиков.

Иммуномодуляторы - группа иммунобиологических препаратов химической или биологической природы, способные модулировать (регулировать) иммунные реакции (тималин, тактивин, интерфероны, миелопид, интерлейкины, левамизол, нуклеинат натрия, ликопид, полиоксидоний и др.).

Контрольные вопросы

На чём основано практическое применение учения об иммунитете для профилактики и терапии? Что такое вакцина? Виды вакцин. Понятие о живых, инактивированных (убитых), химических, ассоциированных вакцинах, об анатоксинах. Методика получения инактивированных вакцин, примеры. Живые вакцины - характеристика вакцинных штаммов, методы получения, особенности применения, примеры. Химические вакцины - определение понятия, примеры. Анатоксины: методика получения, примеры. Какое преимущество имеют сорбированные вакцины и анатоксины перед нативными? Понятие об адъювантах. Объясните смысл лечебного применения вакцин и анатоксинов; при каких заболеваниях применяются лечебные вакцины? Ассоциированные вакцины - определение понятия, примеры. Характеристика вакцин 1, 2, 3-го поколений, преимущества и недостатки. Принципы получения вакцин 3-го поколения: синтетических, генно-инженерных, субъединичных, антиидиотипических. Лечебные сыворотки, их виды. Получение, очистка и титрование антитоксических сывороток (примеры). В каких единицах дозируются антитоксические сыворотки? Иммуноглобулины, их преимущество перед сыворотками. Методика получения, виды препаратов иммуноглобулинов в зависимости от источников получения. Примеры. Способ введения гетерологичных сывороток и иммуноглобулинов.

Диагностикумы. Бактериальные диагностикумы - способы получения, для чего применяются. Эритроцитарные диагностикумы (антигенсодержащие и антителосодержащие) - способы получения, для чего и в каких реакциях применяются. Антигены для реакции преципитации - характеристика, применение.

Диагностические сыворотки (агглютинирующие, преципитирующие, антитоксические) - способы получения, применение. Монорецепторные (адсорбированные) сыворотки - способ получения. Моноклональные антитела (сыворотки) - способ получения, преимущества.

ЗАДАЧА. Какой вид иммунитета создаётся при введении анатоксина (или вакцины) против брюшного тифа, или противостолбнячной сыворотки, или противосибиреязвенного гамма-глобулина?

ЗАДАЧА. Что содержит (антиген или антитело) и для чего применяется брюшнотифозный диагностикум? Агглютинирующая сыворотка дизентерийная Флекснер? Сыворотка против глобулинов человека (антиглобулиновая) меченая ФИТЦ?

Задания для выполнения в процессе самоподготовки.

Составьте схему «Медицинские биологические препараты».

Работа студента на практическом занятии

1. Изучение лечебно-профилактических и диагностических биологических препаратов. Посмотреть препараты, прочитать этикетки, проанализировать каждый препарат по схеме: какой это препарат - лечебно-профилактический или диагностический; что содержит (антиген, антитело, аллерген); как приготовлен; если препарат лечебно-профилактический - какое действие оказывает на организм (формирование какого иммунитета вызывает); если препарат диагностический - что обнаруживает с помощью этого препарата; дозируется ли этот препарат и в каких единицах? Разбор препарата записать в тетрадь.

Занятие 18. Итог по разделу «учение об инфекции. Иммунологические основы диагностики лечения и профилактики заболеваний»

На предстоящем занятии будет дана оценка вашим знаниям, навыкам и умениям по важнейшему разделу микробиологии. Подготовьтесь к этому занятию как можно лучше. От того, насколько вы сознательно изучите этот раздел, насколько хорошо вы поймете, глубоко и прочно усвоите учение об инфекции и иммунитете, зависит ваш успех по частной микробиологии.

Цель самоподготовки

После самостоятельного изучения темы студент должен ответить на все контрольные вопросы к итоговому занятию, быть готовым к выполнению практической задачи, то есть уметь правильно разбираться в биологических препаратах.

Исходный уровень знаний

Материал предыдущих занятий с 13 по 17.

Цель занятия

1. Систематизировать знания по инфекции и иммунитету.

2. Продемонстрировать овладение умениями, полученными при изучении раздела «Инфекция и иммунитет».

План изучения темы

Повторите весь материал по учебнику, по конспекту лекций, по «Руководству к лабораторным занятиям». Учтите при этом рекомендации к предыдущему занятию. Ответьте на контрольные вопросы к занятиям 13-17. Разберите биологические препараты, причем не пытайтесь выучить наизусть все имеющиеся на кафедре препараты -это невозможно и бесполезно, а усвойте общую схему и по этой схеме научитесь разбираться в каждом из них. Для этого нужно поупражняться (примерно так, как по математике при решении задач). На кафедре имеется набор биологических препаратов для подготовки студентов.

После изучения раздела студент должен уметь

1. Провести бактериологическое исследование трупа лабораторных животных и на основании этого определить форму инфекционного процесса.

2. Оценить факторы врождённого иммунитета организма (гуморальные и клеточные).

Ставить, учитывать и интерпретировать результаты иммунологических реакций.

Давать характеристику диагностическим и лечебно-профилактическим препаратам.

Подбирать препараты для диагностики, профилактики и терапии инфекционных заболеваний.

Контрольные практические

задания по разделу «Инфекция и иммунитет»

Дайте характеристику медицинского иммунобиологического препарата по составу и применению, пользуясь схемой (см. предыдущее занятие).

Контрольные вопросы

(подробную расшифровку вопросов смотрите в соответствующих занятиях (13-17))

Инфекция, инфекционный процесс, условия возникновения. Патогенность и вирулентность микробов. Микробные токсины. Формы инфекционного процесса. Смешанные инфекции. Внутрибольничные инфекции. Особенности вирусных инфекций. Иммунитет, определение понятия, виды иммунитета. Врождённый иммунитет. Фагоцитарная теория И.И. Мечникова. Система комплемента. Антигены. Антигенная структура бактерий и вирусов. Иммунная система организма. Механизм иммунного ответа. Регуляция иммунного ответа. Антигены гистосовместимости и их роль в формировании иммунитета. Антитела, свойства, строение, классы иммуноглобулинов. Полные и неполные антитела, методы обнаружения. Теория антителообразования. Местный иммунитет. Противовирусный иммунитет. Механизм соединения антитела с антигеном, реакции иммунитета. Виды антител. Моноклональные антитела. Реакция нейтрализации токсина антитоксином. Реакция преципитации. Реакция агглютинации. РНГА и РОНГА. Реакции с применением меченых антигенов и антител: РИФ, ИФА, РИА, иммуноблоттинг. Реакции иммунного гемолиза. РСК. Применение реакций иммунитета при вирусных заболеваниях. Методы оценки иммунного статуса организма. Роль медицинской микробиологии в осуществлении профилактики инфекционных заболеваний, лечебно-профилактические и диагностические биологические препараты. Вакцины, виды вакцин, получение. Живые вакцины. Анатоксины. Характеристика вакцин 1, 2, 3-го поколений. Принципы получения вакцин 3-го поколения (синтетических, генно-инженерных, антиидиотипических и др.). Антитоксические сыворотки. Методы профилактики и терапии токсинемических инфекций. Выявления гиперчувствительности замедленного типа. Аллергены, аллергические реакции. Практическое применение.

ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВАЖНЕЙШИХ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И КЛИНИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Методические указания к самостоятельной работе студента при подготовке к практическим занятиям по частной микробиологии

Те разделы микробиологии, которые вы уже изучили (общая микробиология, учение об инфекции и иммунитете), являются необходимым этапом для формирования врачебного мышления при освоении курса частной (клинической) микробиологии, к которому вы приступаете. На практических занятиях по общей микробиологии и иммунологии вы овладели основными микроскопическими, микробиологическими и иммунологическими методами исследования. Полученные вами теоретические знания и практические навыки создали необходимую базу для успешной работы на практических занятиях по частной микробиологии, где вам предстоит, используя полученные знания и умения, самостоятельно ставить микробиологический диагноз инфекционных заболеваний, то есть выполнять врачебную функцию.

В процессе изучения этого итогового раздела медицинской микробиологии вам необходимо будет усвоить лабораторную диагностику бактериальных, вирусных и грибковых инфекций. Особенностью лабораторной микробиологической и иммунологической диагностики инфекционных заболеваний является то, что по результатам лабораторных исследований не устанавливается конкретная нозологическая форма, то есть название заболевания (это функция лечащего врача), а определяется этиологическая и патогенетическая роль выделенных из организма больных микробов. Лабораторными методами определяют также иммунологические сдвиги и аллергическое состояние организма, что даёт возможность выбора для врача в конкретной клинической обстановке эффективных иммунологических препаратов. Кроме того, изучение свойств выделенного возбудителя, в частности чувствительности его к химиотерапевтическим препаратам, даёт ориентировку лечащему врачу в выборе эффективных антимикробных препаратов для успешного лечения больного.

Таким образом, частная медицинская микробиология имеет прямое отношение к клинике и поэтому данный раздел называют еще клинической микробиологией.

Основной целью клинической микробиологии является определение этиологической роли микроба - возбудителя инфекционного заболевания и (или) иммунологических сдвигов в организме больного. Следовательно, основными задачами клинической микробиологии будут:

1) установить этиологическую и патогенетическую роль выделенных возбудителей;

2) определить характер и уровень иммунологических и аллергических сдвигов в организме больного;

3) обеспечить возможность выбора эффективных химиотерапевтических и иммунологических препаратов для лечения больного.

Решение этих задач обеспечивает возможность:

а) для врача-лечебника: постановку окончательного диагноза инфекционного заболевания и назначение наиболее эффективной, рациональной антимикробной терапии и иммунотерапии;

б) для врача-эпидемиолога: проведение эпидемиологического анализа с целью установления источника, путей передачи инфекции, выявления бактерионосителей, для предупреждения распространения инфекции, а также принятия решения о проведении специфической профилактики в определённых коллективах людей.

Успешная лабораторная диагностика инфекционных заболеваний возможна только при тесном взаимодействии и взаимопонимании лечащего врача и врача-микробиолога. Особенно большое значение имеет правильный выбор материала для исследования и условий транспортировки его в лабораторию, обеспечивающих сохранность живого возбудителя. Выбор материала определяется предварительным клиническим диагнозом заболевания и его стадией, а условия транспортировки - особенностями свойств возбудителя.

При взятии материала для лабораторного исследования от больных или бактерионосителей необходимо соблюдать определенные правила:

1) материал следует брать до применения антибиотиков или других химиотерапевтических препаратов;

2) забор материала производить с учётом стадии заболевания, патогенеза инфекционного процесса и наиболее вероятной локализации возбудителя;

3) материал нужно брать в достаточном количестве, соблюдая правила асептики, чтобы предупредить возможность загрязнения его микроорганизмами окружающей среды и нормальной микрофлоры организма человека;

4) исследуемый материал нужно доставить в лабораторию в возможно короткие сроки в стерильной посуде или в специальных контейнерах при соблюдении первоначальной температуры или в замороженном виде (в зависимости от свойств предполагаемого возбудителя);

5) любой материал, направляемый в лабораторию, должен сопровождаться направлением, в котором лечащий врач указывает фамилию, имя, отчество больного, вид материала, дату его взятия, предварительный клинический диагноз.

На практических занятиях по частной (клинической) микробиологии вы должны будете освоить основные функции врача-микробиолога и иммунолога, то есть самостоятельно провести все необходимые исследования для того, чтобы в зависимости от предварительного клинического диагноза, поступившего материала и запроса лечащего врача установить вид возбудителя или наличие в организме специфических антигенов, антител, наличие аллергической перестройки, определить иммунный статус больного и т.д.

Для выполнения этой работы вы будете пользоваться микробиологическими и иммунологическими методами исследования, усвоенными на предыдущих занятиях. Сюда относятся методы:

1) микроскопические (бактериоскопические, вирусоскопические);

2) микробиологические (бактериологические, микологические, вирусологические);

3) биологические или биопробы;

4) иммунологические (серологические, кожно-аллергические пробы, тесты для оценки иммунного статуса организма).

При подготовке к практическому занятию по частной микробиологии прежде всего необходимо изучить и запомнить характеристики возбудителей заболеваний. Студенты часто жалуются на то, что запомнить характеристики возбудителей трудно и на экзаменах они «путаются». Для того чтобы этого не произошло, рекомендуем вам усвоить общую схему (алгоритм) характеристики возбудителя. Сначала необходимо запомнить и потренироваться в правильном написании названия возбудителя по-латыни. Затем нужно дать характеристику его свойств по следующей схеме:

1) морфология: форма, взаимное расположение клеток в мазке, наличие спор, жгутиков, капсул, включений и других морфологических особенностей;

2) тинкториальные свойства, т.е. способность окрашиваться анилиновыми красителями, отношение к окраске по Граму, специальные способы окраски;

3) культуральные свойства: требовательность к питательным средам, наиболее употребительные питательные среды, температура выращивания, способ биологического окисления, характер роста на плотных и жидких питательных средах, внешний вид колоний и др.;

...